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Secuenciar una molécula de ADN consiste en determinar en qué orden se disponen los
cuatro nucleótidos (A, T, C y G) que componen la molécula.
El primer método diseñado para secuenciar el ADN fue desarrollado por Allan Maxam y
Walter Gilbert en 1977. Es un método químico que somete la molécula de DNA a
distintos métodos de ruptura. Cada método escinde la molécula allí donde haya un
nucleótido específico. Este método es bastante laborioso y, hoy en día, ha sido sustituido
por métodos enzimáticos que, además, se pueden llevar a cabo de forma automatizada.
El método de Sanger fue diseñado por Fred Sanger en 1977. También se conoce como
método didesoxi o secuenciación por terminación de la cadena. Es un método
enzimático que permite determinar la secuencia del molde a medida que se sintetiza su
hebra complementaria. Se necesitan los siguientes componentes:
1.- Los ddNTP terminadores de cadena están marcados fluorescentemente. Cada ddNTP
se marca con un fluoróforo distinto, que no interfiere en la reacción de la polimerasa y
que emite luz con una longitud de onda característica. De este modo, la reacción se lleva
a cabo en un sólo tubo, no en cuatro.
• 1.- El cebador hibrida con el molde y se incuba en presencia de las cuatro enzimas
(ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa) y de los sustratos APS y
luciferina.
• 3.- En presencia de APS, la ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP. Este ATP
provoca la conversión de luciferina en oxiluciferina mediante la enzima luciferasa.
Esta reacción genera una cantidad de luz visible proporcional a la cantidad de ATP
consumido. Esta luz es captada por un fotodetector, dando lugar a un pico en el
pirograma. La altura del pico es proporcional al número de nucleótidos que se han
incorporado.
Los métodos de la primera generación son capaces de secuenciar hasta 100 kbases al
día, con lo que se necesitan varios años para secuenciar el genoma humano. Durante esta
última década se han desarrollado los denominados "métodos de segunda generación"
que son capaces de llevar a cabo el proceso de secuenciación de forma muchísimo más
rápida. Estos métodos se caracterizan porque secuencian de forma masiva y simultánea
(en parealelo) la genoteca completa y permiten secuenciar la totalidad del genoma
humano en cuestión de días.
454-pirosecuenciación
La primera fase de este método consiste en la preparación de una genoteca. Se
fragmenta el ADN genómico por métodos suaves como, por ejemplo, la nebulización,
que genera fragmentos de entre 300 y 800 pares de bases. Se marcan los extremos de los
fragmentos con dos tipos de adaptadores, que denominaremos A y B (uno permitirá que
el fragmento se una a las esferas de agarosa y el otro es complementario al oligonucleótido
que actuará como cebador en las fases de amplificación y secuenciación). Se seleccionan
los fragmentos marcados en uno de sus extremos con el adaptador A y en el otro con el
adaptador B.
En la segunda fase se hace una PCR en emulsión, es decir, en una mezcla de aceite y
agua. Para ello, primero se mezclan los fragmentos de la genoteca con esferas de
agarosa recubiertas con un oligo complementario a uno de los adaptadores. Se hace la
mezcla de forma que cada esfera sólo se una a un fragmento de la genoteca. Después
se añade una emulsión que contiene, en su fase acuosa, todos los reactivos necesarios
para la PCR. Cada esfera queda aislada en una gota acuosa rodeada de aceite y separada
de las demás esferas. Cada gota se convierte en un microrreactor en el que se lleva a cabo
la PCR. En cada gota aumenta exponencialmente el número de fragmentos de ADN
(todos ellos idénticos) que, a su vez, se unen a los oligonucleótidos que recubren la esfera.
Al final del proceso, cada esfera está recubierta de aproximadamente dos millones de
fragmentos de ADN.
A continuación, se deshace la emulsión y se depositan las esferas recubiertas de ADN
en una placa que contiene cientos de miles de pocillos con un diámetro medio de 44 μm,
de manera que en cada pocillo sólo cabe una esfera. Algunos pocillos pueden quedar
vacíos. A continuación se añaden otras esferas más pequeñas sobre las que se han
inmobilizado dos de las enzimas que intervienen en el proceso de pirosecuenciación (la
sulfurilasa, que convierte el PPi en ATP, y luciferasa, que convierte la luciferina en
oxiluciferina y genera un fotón de luz).
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