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363

Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

Al considerar los procesos bioquímicos se indicó ya que frente a las fer- rnentaciones clásicas, que se desarrollan bajo condiciones anaeróbicas (Cap. 8) se dan también fermentaciones que tienen lugar con suministro de oxígeno y que se denominan ''fermentaciones oxidativas" u "oxida- dones incompletas". Entre los productos finales de estos procesos se cuentan el ácido acético, ácido glucónico, cetoácidos, oxoácidos, ácido tumárico, ácido cítrico, ácido glutámico y otros. En los últimos cincuenta años ha aumentado significativamente el número de productos obtenidos por vía aeróbica con ayuda de los microorganismos, y la mayoría de las fennentaciones industriales son aeróbicas. Por ello, en el presente capítu- lo no nos ocuparemos tan sólo de las "fermentaciones oxidativas" en sen- tido estricto, sino también de los microorganismos y procesos que se emplean en la ''Microbiología industrial" (actualmente llamada Bio- tecnología microbiana). Los procesos ya introducidos en el capítulo 8 no los repetiremos.

La nueva denominación de "Biotecnología microbiana" hace referencia a un nuevo contenido. Los microorganismos utilizados hasta ahora en la producción microbiológica eran cepas naturales o seleccionadas por mutación. Pero ya actualmente, y en el futuro, se emplearán microorga- nismos que habrán sido modificados mucho más profundamente desde el punto de vista genético molecular. Los métodos de la ingeniería genética (apartado 15.5 y Cap. 16) permiten producir por vía microbiana nuevos metabolitos, productos secundarios naturales y nuevas proteínas (insulina, somatostatina, entre otros).

10.1 Formación de acético y bacterias del ácido acético

Las bacterias del ácido acético tienen en común la capacidad de formar ácidos a partir de azúcares o alcoholes a través de oxidaciones incomple- tas, y de secretarlos transitoriamente, o como productos finales desecha- bles, al medio de cultivo. Entre las bacterias del ácido acético se cuentan bacilos Gram negativos, débilmente móviles por flagelación peritrica (Acetobacter) o flagelación polar (Acetomonas = Gluconobacter). Son muy semejantes a los pseudomonas, pero se diferencian de ellos por su elevada tolerancia frente a los ácidos, una actividad peptolítica disminui- da, poca motilidad y por la ausencia de pigmentos coloreados. Los hábi- tats naturales de las bacterias del ácido acético son las plantas. Allí donde

364

10. Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

-.e liberen Lumos rico-, en a1úcares se encuentran levaduras COnjuntame

te con bacterias del ácu.lo acético.

n-

EI

que

dans),

una

bacteria pcrtcne1ca

al

grupo

de

que acumula el acetato únicamente de

los

forma transitoria, o que

(pero\v-

ill!r.

~uperoxidantcs

tene1ca

trar

al

grupo

suboxwlan1·,

incapa7 de oxidar al acetato, puede dc

e

ya con experimentos muy sencillos. Sobre un medio lechoso de

1110

, _

ar-

ye'>o (etanol-extracto de lcH1dura-carbonato cálcico) liene lugar dur.inte el

crecimiento de las colonia'> una excreción de ácidos que conduce a la lución del carbonato cálcico (formación de un halo). Mientra<, que

grupo

peroxyda ns determinan una nueva aparición de turbidez por precipital ión

del

grupo pcroxidans

los del

diso-

grupo

los

del

'º"

s uboxydan s dejan un

cálcico

halo

claro permanentemente,

de

nuevo

e l

del

carbonato

cuando oxidan

acetato. Entre

se cuentan

Acetobacter acl'li

y A. pasteuria1111111. Gluw.

110/Jt1cter oxyda11s

es el prototipo de los suboxidantes. Entre los do<, gr

P<h

\e dan toda<,

acidopliilum

las tran-.iciones

oxidan

posibles.

Acetobacter .ryli11u111. A. aceti

y

despacio.

La mayoría de

A.

el

acetato únicamente muy

las bacterias del ácido acético requieren medios nutritivos

complejo-

Las bacterias del ácido acético ox.idan alcoholes primarios hasta lo -. ác i-

dos grasos correspondientes, p.

ej.

CH.-CH,OH

~

CH.CHrCH20H

~

CH.-COOH

CHrCHrCOOH

alcoholes

secundarios a cetonas. p.

ej.

CH,--CHOH-CH

CH20H-CHOH-CH20H

3

~

CH.-CO-CH

3

CH20H-CO-CH

~

2

0H

Y los alcoholes de

los a1úcares

a aldosas y celosas, por ejemplo sorbi tol a

sorbosa.

fata oxidación ha alcanLado

una gran importancia técnica como

una de

la!>

reacciones parciales

en

la

vía

de

la preparación

de la

gluco'a

para tran.,formarla

reducción eleclrolítica de la o-glucosa.

dimiento del

en

ácido

ascórbico.

El

0-'>orbitol

puede fonnar

c

por

·n-

G. oxwla111

transforma con un r

30%

90%

disoluciones que contengan un

\C

oxidan también

de sorbitol a sorllO-

la glicerina o polialcoholes

sa.

Al

igual que el sorbitol

de cuatro, cinco.

seis o siete carbonos (p.

ej.

o-manitol a o-fructosa).

~acterias

HO -

HO -

CH, OH

1

CH

1

CH

1

HC-OH

HO -

1

CH

1

CH,OH

o-sorb1tol

112

0

2

\

H,O

¿

CHOH

1

C=O

1

HO-CH

1

HC-OH

1

HO-CH

HOJI

º~

H0-9_J

11

o

HC

1

HO-CH

~ioquímica

1

1

&~po

CH,OH

CH, OH

L-sorbosa

ác.

L-ascórb1co

poliol-deshidro~e11a.1as

~

1o.1 Formación de acético y bacterias del ácido acético

365

~uperoxidantcs

i.os ;aldehídos. las aldosa., } ejernplo

las celosa<, a los ácidos correspondiente-

por

eldehido ghcólico

L.

diosa

1

p-giucosa

glicolato ~ ~ L-xilonato ~ o-gluconato
glicolato
~
~
L-xilonato
~
o-gluconato

'ª'

p-g luconato a cetogluconato\:

,cétii:o

'e diferencian entre

sJuconato.

distintas cepa., de la-. bacteria-. del ácido

o 5-ceto-

2.5-dicetogluconato a

.,¡

por la capacidad de formar o bien

produce el

2-

G/uconobactu mtlt111oge11um

uavé-.

y se

pjas

del 2-cetogluconato. Este ácido e<, inestable a un valor de pH de 4.5

cree que es el responsable de la coloración pardonegruzca de las colo-

de

G.

111elanoge1111111

(¡nombre!) sobre placas de agar g lucosado.

Tecnolog ía d e

Ja

producció n d e vinag r e. La obtención del vinagre a par-

tir

del

\JOO

o bien del etanol es un problema predominantemente de la téc-

se encamman

un

Según el principio se distmguen

nica de aireación (pág.

siempre a mantener a

las

199).

Los

procedimientos técnicos

y

a.l

líquido que

bacterias

debe oxidar-.e en

contacto rntenso con el oxígeno del aire.

tres

procedimientos:

el

procedimiento de superficie o

de bandejas.

el

de

inmovili1ación y el procedimiento sumergido.

El

proceso en s uperficie e' muy antiguo y se estandari1ó

Orleans.

Si el \ ino '>e coloca en bandeja<, plana'> y

como proceso d e

del vinagre

la\ mosca-;

(Dro.1ophila)

se

encargan

de

rnocularlo. se

fonna

'>Obre

Ja

superficie una

película continua, una cubierta. que -;e denomina también ··madre del \ ma-

gre··

o

mvrnderma aceti.

fatá compuesta por células de

Acetobacter n ·li-

num

que '>e mantienen juntas mediante fibrillas de celulosa (inmovili1adm.).

El proceso de acidificación es muy lento. El proceso se emplea también para

prod ucción doméstica. Con la denominación de procesos de inmoviliza-

fijada' -.obre

la

ción

-.e agrupan a todos aquellos en los que las bacterias están

un

material de sopone (Orujo y 1arcillos en cuba-.

aireada'> y agitadas).

En

el

'"proceso de acidificación r.ípida" el líquido con alcohol se conduce vanas

º~

veces a tmvés de contenedore., rellenos con

bacteriana"

gre para alimentación no requiere prácticamente ninguna fillración, ya que

siguen

implantan los

Procesos

dore,. que pemliten una fuelle aireación y di,ipacton

virutas de haya.

La "columna

\ 1na

se

airea desde abajo.

El proceso tiene la ventaja de que el

Contenedores de hace

pesar de ello,

50

se

años

las

~acteriasestán

"inmovili1adas".

funcionando actualmente sin modificación.

s umergidos

A

para la producción de acético.

Se utilizan fermenta-

de temperatura.

~ioquímicade

la formación

d e

a cético.

Aet•tohacter

>

G/11co11obactcr

lienen

&~po

a/co/iol-, glucosa-

(PQQ)

Ja

y otras

poliol-deshidro~e11a.1asque

hace

7.2).

contienen un

pirrolo-

la

la oxidación de

prostético descubierto

(Fig.

poco. llamado

Estos en1imas están

metoxantina

o

qu111o linquinona

Parte

externa de

locali1ados en

membrana citoplasmátic<i y

catalinm

366 1o. Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

etanol , glicerina o glucosa a Jos ácidos correspondientes (acético, g licéri- co o glucónjco). Los electrones se transfi~rena.la ~ad~na transportadora y se ceden protones al exterior en el espacio penplasmico. La metoxantina también llega al medio de cultivo y al vinagre.

10.2 Producción de otros ácidos orgánicos

Muchos ácidos orgánicos se obtienen a escala industr~al mediant.e.oxida- ciones incompletas con Ja ayuda de hongos. Las ventajas de la ut1hzación de hongos para la obtención de ácido cítrico, ácido itacónico, ácido glu- cónico, ácido málico, etc., se pusieron en evidencia hace mucho tiempo. Se basan sobre todo en la fácil separación de los organismos a partir del caldo de cultivo. Mientras que para separar bacterias hacen falta centrífu- gas y costos energéticos elevados, para la separación de las levaduras y otros hongos bastan procesos de filtración baratos.

10.2.1 Fisiología y biotecnología

El metabolismo de los hongos es ox.jdativo estricto. Esto no significa que los hongos no degraden anaeróbicamente los hidratos de carbono ni qu~ no los

puedan

diciones anaeróbicas no se produce un crec1m1ento s1gmficat1vo y los pro- ductos de fermentación son principalmente el etanol y el ácido lácüco. Otros ácidos orgánicos se producen exclusivamente bajo condiciones aeróbicas.

En Jos hábitats naturales de Jos hongos, el suelo, no tiene lugar nunca una excreción significativa de productos intermediarios. Cuando hay deficien- cias en los nutrientes los hongos obtienen un máximo de energía y de sus- tancia celular gracias a las oxidaciones completas y la asimilación del sustrato. El que en el laboratorio y en la práctica industrial se dé una excreción de numerosos productos metabólicos se debe a un exceso en la oferta de hidratos de carbono y a una cierta "desorganización" metabóli.ca debida frecuentemente a la captación de oligoelementos. Los hongos tie- nen un "sistema glucolítico activo". En los cuellos de botella de los inter- mediarios metabólicos tiene lugar una acumulación de productos inter~e­ diarios, que son excretados directamente o bien después de unas pequenas modificaciones. J.W. FosTER habló de un "metabolismo excesivo". En último término Ja mayoría de las "fermentaciones oxidativas" pueden con- siderarse debidas a un fallo en Ja regulación del metabolismo.

fermentar (¡fermentación de las Jev~d~ras!); ~o ?bs~nte bajo con -

oxidación total

Azúcar ----

Producto intermediario

- modificación y excreción

"' excreción directa

HO-?~

10.2

Producción de otros ácidos orgánicos

367

En muchos casos basta con eliminar un oligoelemento esenc ial , para que un hongo inicie Ja acumulación de productos intermediarios en el medio. v na acción significativa la tienen el zinc, el hierro, el manganeso y el cobre. así como el magnesio, el calcio y el potasio (Fig. 10.1 ).

El ácido láctico es excretado principalmente por mucorales (Rhiwpus nodosus, R. oryzae, R. arrhizus , R. nigricans) y otros ficomicetos (Allo - myces, Saproleg11ia, Blasrocladiella). No es el único producto metabólico como en las bacterias lácticas homofermentativas; junto al ácido láctico aparecen también algunas cantidades de ácido fumárico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido fónnico, ácido acético y etanol. Los rendimientos máximos en ácido láctico tienen lugar en presencia de oxígeno. Como los bongos no requieren unos medios de cultivo complejos y tienen suficien- te con la urea como fuente de nitrógeno, la obtención de ácido láctico en una forma especialmente pura presenta menos dificultades que en el caso de la fermentación láctica por los Jactobacilos.

La producción de ácido fumá rico es una característica típica de varios géneros de mucorales (Mucor, Cunninghamella, Circinella, Rhizopus).

El ácido glucónico es sintetizado por muchos Aspergillus y Penicillium. La producción se basa en la oxidación enzimática de la glucosa por una glucosa-oxidasa excretada por los hongos al medio. Aspergillus niger lo realiza con gran eficacia incluso en disoluciones de glucosa del 30-35%, cuando el ácido va siendo neutralizado por carbonato cálcico.

transfi~ren

~ad~na

industr~al

qu~

Jev~d~ras!); ~o ?bs~nte

inter~e­

HO- EJ

HC-OH

1

o

HO-?~

HC-OH

1

HC

1

CH20H

B·o-glucosa

gluc0$a·OXJdasa

rr

FAD

FAOH,

>-<

o,

H,0 2

Hb-OH El

1

o

HO- ci

HC-OH

H

CH, OH

gluconolactona

1

1

cata/asa

H 2 0

COOH

1

H 2 0

 

HC-OH

1

 

HO- CH

1

HC-OH

1

HC-OH

1

CH,OH

gtuconato

+

1/2 0 2

La glucosa-oxidasa es un enzima que contiene al FAD como grupo pros- tético. En la oxidación de la glucosa se forma como producto primario de la oxidación B-o-glucono-b-lactona, que se transforma posteriormente de forma espontánea o enzimáticamente, por la gluconolactonasa, con captación de agua, hasta gluconato. La glucosa-oxidasa transporta el hidrógeno hasta el oxígeno atmosférico formando peróxido de hidrógeno , Yse escinde en agua y oxígeno mediante la catalasa.

368

1

O. Oxidaciones incompletas

y biotecnología microbiana

2,5

mg/1

MgSO,

Zn'·

1.0

rng/I

Fe'·

KH.PQ,

-

1,0

masa

de

mgll

mlcellO

-

ácido

cllrlCO

Fig.

10.1 Dependencia de la masa de micelio

0.08

mg11

1.2mgZn"11

--

100

rng/I

azucar resídu,

1

y de la cantidad de ácido cítrico

I~

producido con

respecto a la com posición del

medio de c ultivo en

Aspergil/us

niger

después

de nueve

días

de c recimiento.

El

medio completo contiene los

s1gu1entes

componentes (datos

en

gil):

glucosa

140;

nitrógeno

1,05;

KH, PO.

2.5:

MgSQ,.7H20

0,5;

hierro

0,01;

zinc

0,0025;

pH

3,8 (de

SHu,

P.,

M.J . JOHNSON:

J.

Bactenol.

56 [1948)

577).

El

favorecida por un

ácido

oxálico e'

excretado

por

pH alcalino en el

hongo\. medio de cultivo.

mucho~

Su producción

viene

Acerca

de

la

formación

de

á cido

cítrico

por

hongos se ha

trabajado

mucho.

sobre todo bajo el aspecto práctico y económico.

De,pué

de que

hicie~e

~upcrficial"

d~

precaucione~

JC.

WEH~ffR

de.,cubriese

el

árn.lo

cítrico

en

cuhi\OS

de

penicihulll

Mn~·/140

(Citromyces

pfifjáumm)

en

1891. CrnRIF

(1917)

estableció

la'

ba-.e!>

para la obtención industrial del ácu.lo cítrico al de,cubrir. que

A1pagi/111s

11íger

crecía abun<lantcmente en medios de cultivo con un p H inícial de 2.5

de ácido cítrico.

Al

ir

a 3.5 y que entonces excretaba grandes cantida<les

WEH~ffR

mucho~

10.2 Producción de otros ácidos orgánicos

369

aumentando el

El bajo pH inicial tiene la ventaja de que prácticrunente

pH aparecían

ácido glucónico y finalmente <ÍC1do oxálico.

no hay que temer

1as

contaminaciones bacterianas.

ts1a es la ra1ón de que la producción industrial

\C

hicie~e

sin lomar

precaucione~

de

e

1erilidad en el llamado

procedimien10

~upcrficial"

en bandeja

L;i,

cámaras

de

fennen1ac1ón

'un rec1pien1es de aluminio (2

Y

2.5

• 0.15 m) que

\C

llenan a una

a11ura de 8 cm con una disolución de melazas.

8 3Q"C.

El rend11nien10

rnicnlo de

los hongo'

El

es

alto.

se inoculan e incuban de 9 a

creci-

con una disolución

1ransfom1ado por prec1p11ación con

los países

11 días

Puede eliminarse el

medio de

cultivo

y

el

puede u1ili1ar\e de

nuevo cubriéndolos

fresca

caroonato cálcico.

ácido cí1nco <>e recupera del medio

\e CrÍSlaliza

y

\e libera medianlC ácido sulfúrico. f:.n

1 ndustrialtzados la producción de ácido cítrico se huce exclusivamcnle por cultivos

en profundidad.

Se u11lizan fermentadores de 300

000

ha!>ta 400

000

lttros de volu-

men sin peligros de con1aminación. En lugar de mc la1a se empica a1úcar de caña.

Como ejemplo de la optimización de un

produccíón de

la

(Fig.

10.1 ).

un

metabolito darnos

medio de cultivo para favorecer

un estudio antiguo

los

dato\ de

La

con

respecto a los componentes del

Se pone claramente de manifiesto cuando se mantienen constantes

componente que se modifica cuantitati-

vamente. Si se hace un medio de cultivo sencillo con glucosa. libre de cual-

quier oligoelemento por precipitación con hidróxido de aluminio. y se aña-

den los distintos componentes en concentracíones

cular y determinar al

y el ácido cítrico. obteniéndose enton-

Las curvas de los diagramac, permi-

ten establecer: a) El nitrato amónico y e l sulfato magnésico no llenen una influencia específica en el rendimiento en ácido cítrico: estas sales contro-

lan

ces una serie de relaciones (hg.

dependencia en la producción de ácido cítrico por

Aspergí/lus niger

medio de cultivo es especialmente signifi-

cativa.

todas

I~

condiciones excepto un

conocidas. se puede ino-

de cu ltivo

cabo de 9 días de agi tación de los frascos

10.1 ).

la

ma-;a miceliar. el azúcar re'>idual

el

crecimiento del micelio. b) En la dependencia de la concentración en

Si estos ele-

uhóptimo se dan rendimien-

.1un inferiores el crecimiento

zinc, hierro y fósforo aparecen unas cur\'a

mentos permiten únicamente un crecimil.'11111 tos superiores en ácido. Con concentraci1111.:

del

,

1k óptimo típicas.

.1c1do.

micelio

limita también la producción

d~

c) Se obtienen rendi-

y el

cuando

zinc.

acción

suficientes para disminuir el rendimiento (¡la glucosa comercial purificada

a portaóa ya

son

El manganeso tiene una

mientos

se

especialmente

encuentran

en

elevados

do.,

componentes, el

de

medio

hierro

cantidades

µg

limitantes.

2

Mn •/Jitro

inhibitoria significativa; 3

10

µg

Mn~·/140

hierro

de cultivo

g de glucosa en

incremente

la

1

litro de cultivo!) .

excreción

El que la deficiencia en

de ácido cítrico se

aco-

ba,a con toda probabilidad en que el hierro actúa como cofactor de la

nita.w.

El cobre actúa sobre la

arnnítasa

como un antagonista del hierro. En

370 1 O.

Ox i daciones incompletas y biotecnología microbiana

ello se ba<;a una nueva intervención para incrementar el rendimiento en ácido cítrico. Incluso en presencia de pequeñas cantidades de iones de hie- rro en la disol~ción.de melazas ( 1Omg/I) se obtie~enrendimientos máximos cuando a la d1soluc1ón se le añade un exceso en iones de cobre (150 ffig/I).

El ácido itacónico es sintetizado tan sólo por unas pocas cepas de AJpergillus itaco11icus y A. terreus. La producción de ácido itacónico tiene también lugar a pH en tomo a 2.

10.2.2 Química de la producción de ácidos por hongos

No cabe ninguna duda de que en la formación de los ácidos excretados por los hongos durante la transformación de la glucosa participan reacciones del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo "del ácido cítrico"). El mala- to, el fumarato, el succinato y el citrato se sintetizan por la vía del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, y son excretados directamente (Fig. l 0.2).

glucosa

_,,, ~ _z4 "~'"'

Aspergillus

r~ato

Asperg1/lus

zigomicetos

·~

mÍio

1

+rato

SUCC1nato

Asperg1/lus

terreuspH 2

+

to

oxalsucc:inato

Fig. 10.2

~

2-oxoglutarato

~~

Producción de ácidos o rgánicos por hongos.

El ácid o oxá lico se forma por hidrólisis del oxalacetato mediante la oxa- lacetato-hidrolasa:

CO-COOH

oxa/acetato-h1drolasa

HOOC-COOH

+

1

+

H,O

CH,

COOH

CH,

COOH

La formación de ácido itacó nico parte del ácido cis-aconítico. Durante Ja descarboxilación tiene lugar un desplazamiento de electrones en el esque-

disol~ción

r~ato

obtie~en

10.2 Producción de otros ácidos orgánicos

371

teto carbonado, por lo que el doble enlace se desplaza de la posición 2,3 a Ja posición 3,4:

cH 3 - COOH

co-COOH CH 2 -COOH

1

f H2- COOH

HO-C-COOH

1

CH, -COOH

<(H2- COOH

CO,

C-COOH

-

L.

11

CH-COOH

:fH2

C-COOH CH, - COOH

1

El ciclo de los ácidos tricarboxílicos tiene en primer lugar función degra- dativa. No obstante, hay que ver en él un "anillo de distribución" central, que proporciona los componentes previos de un gran número de constitu- yentes celulares. Si se captan productos intermediarios en algún punto del ciclo, otras reacciones deberán asegurar los suministros de oxalacetato. De las dos reacciones anaplerólicas (Fig. 7.7, pág. 257 y 274), la transforma- ción de isocitrato a través del glioxilato con el acetil-CoA hasta malato y succinato, y la carboxilación del piruvato hasta oxalacetato, la reacción de carboxilación es la más importante. El ciclo del glioxilato se utiliza en pri- mer lugar para consumir acetato, ácidos grasos de cadena larga e hidrocar- buros, pero también a otros sustratos que se degradan a través del acetil- CoA como producto intermediario. La glucosa reprime la síntesis de los enzimas clave del ciclo del glioxilato (isocitrato-liasa y malato-sintasa).

~ "~'"' Si el ácido cítrico se sintetizase exclusivamente a partir del acetil-CoA, 1 mol
~
"~'"'
Si el ácido cítrico se sintetizase exclusivamente a partir del acetil-CoA,
1 mol de glucosa conduciría a la formación de por lo menos 2/3 de mol de
citrato; esto es, a partir de 100 g de glucosa se formarían sólo 71, l g de
·~
~
~
~
{
~
·~
~
~
ácido cítrico. Sin embargo, ocasionalmente, se consiguen rendimientos
de 75 y hasta 87 g de ácido cítrico. La comprobación ha permitido esta-
blecer que se fijan grandes cantidades de anhídrido carbónico. El 14 C0 2
añadido se encuentra en el átomo de carbono 6 del ácido cítrico. La trans-
fo rmación de la glucosa hasta el ácido cítrico está representada en el si-
guiente esquema:
~
~~

+

CH2-COOH

1

HO-C-COOH

1

CH2-COOH

372 1 O.

Oxidaciones incompletas y biotecno l ogía microbiana

10.3 Producción de aminoácidos

Con el descubrimiento de Corynebacterium glwamicwn por K1NOSHl1A (1957) se abrió una nueva época en el desarrollo de la utilización industrial de los procesos de oxidación incompleta. Esta bacteria excretora de ácido L-glutámico se aisló mediante una técnica de "screening" sencilla, el méto- do "bioautográfico". Un gran número de bacterias del suelo se transfirió mediante calcos (pág. 495) sobre distintos medios de cultivo, se las dejó crecer y a continuación se mataron mediante radiaciones ultravioletas. Las placas se cubrieron con un medio basal en el que se había suspendido una cepa bacteriana auxotrótica para el ácido glutámico. Después de una nueva incubación, el crecimiento de esta bacteria indicadora señalaba aquellas colonias iniciales que habían excretado ácido glutámico.

crecimiento de esta bacteria indicadora señalaba aquellas colonias iniciales que habían excretado ácido glutámico.
crecimiento de esta bacteria indicadora señalaba aquellas colonias iniciales que habían excretado ácido glutámico.

~

~

~

El ácido L-glutámico se forma sólo bajo condiciones muy aeróbicas. Pruebas en fermentadores de 50 m 1 con medios de cultivo que contenían urea como fuente de nitrógeno y un 10% de glucosa, dieron al cabo de 40 horas a 30"C 50 g de L-gluta- mato/I, esto es, un rendimiento de 0,6 moles de glutamato por mol de glucosa.

La degradación de la glucosa tiene lugar aparentemente a través de la vía de la fructosabifosfato y a continuación a través del citrato, el 2-oxogluta- rato hasta L-glutamato. En la formación de oxalacetato no participa el ciclo del glioxilato, sino una carboxilación del piruvato, al igual que e n la formación de cítrico por Aspergillus niger. Prácticamente todo el C02 añadido al medio de cu ltivo se recupera en el grupo cx.-carboxílico del ácido glutámico. La excreción se basa aparentemente en una acumulación del 2-oxoglutarato como consecuencia de un defecto en la 2-oxoglutara- to-deshidrogenasa. En ausencia de amonio se excreta 2-oxoglutarato. En la producción industrial de glutamato se está añadiendo recientemente acetato en lugar de glucosa como sustrato.

1 Citrato

1

-

L-glutamato

1socitrato

y

co,

2-oxoglutarato

NH;

Las cepas de Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium divarica1111n excretoras de ácido L-glutámico requieren biotina. La concentración de biotina en el medio de cultivo es de significación decisiva en la acumula- ción del ácido; 2,5 µg de biotina/litro de disolución son concentraciones óptimas. Si las concentraciones son inferiores el crecimiento es escaso:

concentraciones superiores de biotina favorecen el crecimiento y reducen el rendimiento en ácido glutámico (Fig. 10.3).

~ona

10.4 Transformación de sustancias por los microorganismos

Dependencia de la formación

de ácido L-glu táml co en

,.,tum glutamícum de la concentración de biotina del m edio (de HUANG, H.T. en:

progr. industr. Microbio!., 5 (1964] 57).

flg.10.3

Corynebac-

~

E

'l!!

·ª

:>

~

~

·<

40

30

20

10

o +--"""'T---

o

s

---

10

Biotina (µgil)

373

_

-,.-

25

para la producción de otros aminoácidos se pueden obtener mutantes auxotróficos de Corynebacteriwn glutamicum. Mutantes que requieran homoserina secretan en condiciones apropiadas 20 g de L-lisina/litro de medio de cultivo. Otros mutantes de C. glutamicum, de Enterobacteriá- ceas y Pseudomonadáceas producen L-homoserina, L-valina, L-isoleucina, L-triptófano, L-tirosina y otros aminoácidos.

En Japón se han desarrollado otros métodos para la obtención de ácido inosínico y de ácido guanílico. Estos nucleótidos 5' se utilizan como con- dimentos y para dar sabor.

10.4 Transformación de sustancias por los microorganismos

La elevada especificidad, así como el elevado rendimiento que se conse- guía en las oxidaciones llevadas a cabo por las bacterias del ácido acético, y sus utilizaciones industriales, especialmente en la producción de sorbo- sa, despertó el interés a partir de los años treinta por el estudio de los microorganismos en lo referente a sus propiedades catalíticas en la trans- fonnación de productos naturales y también de sustancias, tanto celulares como no. Los microorganismos realizan sobre una gran cantidad de sus- tancias modificaciones altamente específicas: oxidaciones, hidrataciones, hidrólisis. esterificaciones, condensaciones, metilaciones, descarboxila- ciones, deshidrogenaciones, desaminaciones, aminaciones, entre otras. Además estas transformaciones biológicas son estereoespecíficas. Estas transformaciones pueden ser realizadas tanto por actinomicetos y otras bacterias, como por hongos superiores e inferiores.

Éxitos especialmente importantes se han conseguido en la síntesis micro- biana de esteroides. La síntesis química de la cortisona y de la hidrocorti - ~ona requiere más de 30 pasos, y discurre con un rendimiento inferior. Si in tervienen microorganismos la cortisona puede conseguirse en 13 pasos. Uno de los puntos más difíciles en la síntesis es la introducción de un

374 1O.

Oxidaciones incompletas

y biotecnología microbiana

-

grupo hidroxilo en

la posición

11

del esqueleto del esteroide. La rcal iian

algunos

hongos

mfcriorc.,

(Rhi:.o¡nis

arrhi:.us.

Curvularia

lw1at<1

C111111i118lu1111ella blaf t•1h

1 N11w) )

Streptom\'Ces fradiae.

Daremos

a con

1

nuación

como

ejemplo

dá'>ICO

la

transfonnación del

compuesto

S

de

RE1CHSl EJN

en h1drocor11

ona mediante una oxigenación específica.

 

HO-CH

"c~º

··OH

HO-CH

2

~~ ~.)

o

o~

11-<lesoxicortosol

(compuesto S

de

Reocnst111n)

hodrooortosona

(~

eortlsol)

Junto a e-.ta oxigenación,

reospecíficamente mediante

esteroide.

deshidrogenación

dobles enlaces, a reducción de grupos cetónicos y oxónicos, etc.

muchos hongos

oúge11asas

son capaces de hidroxilar cste-

casi todos los puntos de la molé-

a la

la introducción de

cula

del

Otras acciones

de

grupos

en1imáticas microbianas afectan

a

hidroxilos alcohólicos,

c

Rhlzopvs

Irn

c

/

Penictll1u71

oW '

Lenz1tes, CoHetotnchum

Pez1za

Rh1zopus

sp

RhtwfJUS arrh1zus

Como ejemplo de una r eacció n d e a di ción indicaremos la síntesis de fe ml-

acctilcarbinol, un

efedrina.

duras queda acilado.

producto intennediario importante

en

la

síntesis de

la

leva-

la fom1a-

de

El

bentaldehído añadido a un cultivo en fennentación

aparentemente

de

la misma forma que en

ción

de acetoína

por

la-.

le\

adura<,.

por transferencia del

'·acetaldeh fo

o

activo"

(Fig.

7.6.

pág. 256)

al acetaldehido.

Las transformaciones po.,t

-

riores en el fcnilacctilcarbinol

son transfom1aciones química<>.

NH

-CH

H

N-CH

-~--<~ ~b-¿1

 

.

 

OH

~I'

CH

fenolacetolcarb<nol

7 ~H-CH3

~C-C-CHJ

efedrina

~11

OH

H

-~N\

?-aminope~icilánico

"c~º

-

10.5 Producción de antibióticos

i.u ohtención del

sión

)

bacteria

esci-

cnl imá tica de una su'>tancia con ayuda de microorganismos. Alguno-,

la.,

es de

ácido 6-aminopenicilánico ofrece un ejemplo de

la

, que contienen una

acilasa

específica

escinden

f?rmando

el ácido_?-aminope~icilánico

'!lle

a

hongo.,

pi:nicilina-.

oue'º un punto de partida para la obtenc1on de pcmc1hna"

naturab,

'>eml'>mtétic a\.

 

H

H

()- cH,- CO-NH+f--SxCH,

H,N

O

H

H

jj

SX CH,

 

-~N\

O

-CH,

COOH

 

\

"CH,

~~ ~.)

COOH

 

t>enolpenlCllona

(penlCl[ina

G)

o~

(~

10.5 Producción

de antibióticos

El de.,cubrimicnto de

la penicilina y

otros antibióticos abrió

un

nuevo y

amplio

campo a la Microbiología

industrial.

Las bacterias y

lo.,

hongos

producen

"sustancias

una gran vegetales secundarias"

cantidad

de

sustancias

que,

conjuntamente

con

las

se designan

como metabolitos secun-

darios. Muchas de estas sustancias tienen un papel importante como medi-

microorga-

camentos,

estimulantes,

aditivos en

la alimentación, etc. Los

ni smos han a lcanzado una gran imporcancia económica como productores

-~--<~ ~b-¿1

~I'

de metabo litos secundarios.

antibióticos,

han

los límite'>

bolitm

en el

los

desarrollo de nuevos antibióticos semisintéticos,

se ven

los meta-

utili/ación

la consi -

microorganismos.

El

descubrimiento y

Ja

la

investigación

de

así como el

adquirido un

valor incalculable en

terapia médica. Aún no

aplicación

de

La

ba'>ada en

numerosa\

y

descubrimiento, modificación

por

los

y

-.ecundarios producidos

con

deración

per

ecuente de

de

pcctiva.,

lo'>

en

la obtención y selección de mutantes.

mecanismos

de

regulación. abre

la'> posibilidades de aplicación.

amplia\

10.5.1 Organismos

y descubrimiento

Desde el '>1glo x1x se conocen ya las relaciones simbiótica-. ) antagónica., entre los microorganismos. El punto de partida para el e-.clarec1m1ento del

p

inhibía el cre-

rinc1p10

1928)

material

de

la antibiosis,

lo dio

la observación

(A.

F1

1

\1lr-< G .

de que la colonia de un hongo

(Pe11icilliu11111otat11111)

cin11ento

de

lo'>

C\tafilococos.

El

compuesto

excretado

por

este

Pe11icilli11111

y

que difundía

a través del

agar, se

denominó

penicilina.

Desde entonces -,e han aislado numerosas sustancias con acción antibiót1·

 

ca.

Los antibióticos

son sustancias de

origen biológico.

que inhiben

el

~H-CH3

los microorganismos ya a concentraciones

muy bajas.

Se

~C-C-CHJ

crecimiento de diferencia por lo

menos entre sustancias de

acción

inhibidora (bacterios

~11

lática. fungistática) y de acción

letal

(bactericida, fungicida, etc).

376 10. Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

Microorganismos productores

pales de antibióticos son hongos del grupo de Jos aspergilales, los actino.

micetos y algunas otras bacterias. Desde el

química de los compuestos producidos, los estreptomicetos ocupan el pri- mer Jugar. Hasta ahora se han caracterizado profundamente un total de 2000 antibióticos; no obstante, únicamente 50 antibióticos se utilizan en la quimioterapia. El número de las actividades antibióticas descritas es aún mayor; además muchos grupos de microorganismos no han podido ser estudiados suficientemente ni se han podido comprobar sus actividades antagónicas, debido a que se trata de bacterias y hongos inferiores muy difíciles de cultivar.

S ignificación de los antibióticos para el microorganismo productor. Aún está sin aclarar cuál es el significado de los antibióticos para los orga- nismos que Jos producen en su propio hábitat en el suelo. Los antibióticos se producen a través de vías biosintéticas específicas, que se incluyen den- tro de las del metabolismo secundario. Las vías metabólicas y los enzimas que conducen a los mctabolitos secundarios no son imprescindibles para el

crecimiento

bióticos, así como el aparato genético necesario, representan un lastre para

el organismo que debería haber sido eliminado por dcleción en el proceso evolutivo. Partiendo de la base de que únicamente se mantiene aquello que tiene un sentido, hemos de ver en los antibióticos unas sustancias que ofre- cen una ventaja al productor en su propio hábitat, en el suelo, actuando por ejemplo, conlra los competidores que utilicen el mismo sustrato. Sin embargo, estas relaciones antagónicas casi no son demostrables en el s uelo, ya que la producción es cuantitativamente muy b<tia y los antibióticos inhi- ben también al organismo productor.

Continuamente nos vamos haciendo a la idea de que durante la evoluci ón también puede haberse ido arrastrando un material genético innecesario. incluso cuando signifique un lastre (bajo las condiciones experimentales utilizadas hasta el momento). La naturaleza es probablemente más con- servadora de lo que se había considerado en los primeros tiempos de la era de la Biología Molecular. Por ello, se cuenta a los antibióticos y otros metabolitos secundarios cuya utilidad inmediata para las células produc- toras no ha podido ser demostrada, entre las "virutas metabólicas" o como productos aparecidos en "el terreno de juego del metabolismo". Con ello queda claro que el metabolismo secundario de las bacterias, los hongos y las plantas ofrece todavía un campo importante para el conocimiento de la evolución de Jos organismos.

Demostración d e la producción de antibióticos. Los primeros antibió- ticos se descubrieron casualmente debido a la formación de halos de inhibición. Sobre placas de agar en las que se había sembrado una bac-

d e antibióticos.

Los productores princ¡.

punto de vista de Ja divers idad

y e l mantenimiento celular. Por tanto, la síntesis de los anti-

10.5 Producción de antibióticos

fig. 10.4 Puede reconocerse la segregación de antibióticos por las bacterias y hongos por la apa- rición de halos de inhibición en las placas de agar

de forma regular con bacterias indica-

dOras (Staphy/ococcus aureus).

,nbradas

377

teria indicadora de forma que tuviera un crecimiento confluente, queda- ba alrededor de las colonias de hongos o de estreptomicetos un halo sin crecimiento; el antibiótico procedente de esta colonia y difundido a tra- vés del agar determinaba la formación de un halo de inhibición en el tapiz continuo de bacterias (Fig. 10.4). Como bacterias indicadoras se utiliza- ron microorganismos representativos. Para la determinación cualitativa de un productor de antibióticos es suficiente con sembrarlo en el centro de una placa de agar ordinario, sembrar la bacteria indicadora de forma radi al con el asa en forma de estría (test de Ja estría; Fig. 10.5). Tras la incubación puede saberse el espectro de acción del antibiótico en base al grado de la inhibición del crecimiento sobre los distintos organismos indicadores. Los antibióticos se diferencian entre sí por su acción sobre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, las levaduras, los derma- tófilos y oleos microorganismos de un modo característico.

Penicthna G

Tetraciclina

¿

Griseofulv1na

Flg. 10.5 Prueba por estría para determinar los espectros de acción de tres an- tibióticos. (1) Staphylococcus aureus; (2) Streptococcus; (3) Escherichia colt, (4) Pseudomonas aeruginosa; (5) Gandida a/bicans; (6) Tricophyton rubrum. En el cen- tro de una cápsula de Petri cubierta con agar que contenga peptona e hidrolizado de caseína se coloca un trozo de papel de filtro embebido en 10 µg del antibiótico que se desea determinar. Con ayuda de un asa de platino se han sembrado radialmente por estría los organismos indicadores desde el 1 hasta el 6. Algunos organismos no han crecido en el halo de difusión (de WALLHAUSSER, K .H., H. ScHM10T: "Sterilisation , Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie. Thieme, Stuttgart 1967).

378 10. Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

1:100

110000

1'.100000

2. Siembra en placa

i'~·~~·~f.~~~~----,--,--,-mediOde---

 

cultivo

estufa de

agua dest.

cápsula de

especial

cultivo 6

esténl

Petro

días a 25'e

-------

4 . Valoración ' de la placa pulvenzada

irmen = pro.blema

inóc lo

u

hmp¡eza --

5. Prueba por estria para determinar el espectro bactenano

coloma central

muestra

agua dest

del suelo

esténl

3 Pulvenzador

para pulvenzar la placa

-JE

placa

cultivada

©

••

=

::;:-.

g

Cl

con el germen prueba

16 horas en la e_stufa de cult<Vo

a 37ºC

r-- --+-

-----~

8. Determinación de la actividad y de la estructura quimiea

si la actividad es superior a

1:128

---¡---

preparado punfocado

 

L.

9. Determinación del espectro de acción

+

11. 1nvivo

+====--===::=:

BBBB~ i BBB6 i

i

1 50

1.100

1 200

1 400

1.800

1.1600

l. limite de act1vtdad = último tubo con crec1m1ento inhibido

(estudio con animales)

Determinación de

a) actMdad

b)

c) efectos secundarios

compatiblhdad

Fig. 1 0.6 Pasos a seg ui r en un p ro grama de determ in ació n d e ant ibióticos (de WALLHAUSSER, K.H., H. SCHMIDT. Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, Chemo· therapie. Thieme, Stuttgart 1967).

ne~

progra~a

es~~

I'~

desd~

di~tintas sustancia~.

~ma

.~.

10.5 Producción de antibióticos

379

¡,a mayoría de los antibióticos se descubrieron en el curso de un progra- ma de prospección ("screening"). En la figura 10.6 se indican distintos pasos de un progra~a de es~~ tipo, desd~ la suspensión de la muestra de suelo hasta la expenmentac1on sobre animales; el esquema no requiere ninguna explicación.

la determinación cuantitativa de la

acción de un antibiótico se utiliza el test de difusión en placa (véase Fig.

10.7), el test de las diluciones y también otros métodos. Para la realiLa- ción del test de difusión en pl aca se llenan éstas con un medio de cul- tivo inoculado con la bacteria indicadora y hasta un nivel determinado. Sobre estas placas se colocarán posteriormente las disoluciones que se quieran comprobar, del siguiente modo: a) en agujeros previamente pre- parados, o b) pipeteándolas en cilindros de vidrio o metálicos, o c) impregnando un papel de filtro cortado en discos que se coloca sobre la superficie del agar. En los casos positivos se ve después de la incubación un halo de inhibición, cuyo diámetro es proporcional al logaritmo de la concentración del antibiótico si las condiciones de experimentación son constantes (composición del medio de cultivo, grosor del medio, densi- dad del inóculo. tiempo de incubación y temperatura de incubación, etc. ) (Fig. 10.7).

i'~·~~·~f.~~~~----,--,--,-mediOde--- peterminación c uantitati va. Para

~

-----~

~

Fig. 10.7 Prueba de difusión en placa pa ra deter- min ar cu antitati vamente un ant ibiótico . En los papeles de filtro colocados en la superficie sembrada del agar se habían vertido distintas cantidades del antibiótico. El diámetro del halo de inhibición nos da una medida de la concentración del antibiótico (según lAHNER, H.: Biologie der Antibiot1ca. Springer, Berlín

1965).

En el test de las diluciones seriadas el antibiótico cuya acción se puede deten11;nar se añade a un medio de cultivo inoculado con el organismo ind1cauor de forma que se \ .rn :.aeiendo diluciones a la mitad y ~ma vez transcurrido el tiempo de · .cubación se determina aquella concentración mínima en Ja que ya no I'~ posible el crecimiento (concentración bacte- riostática mínima).

Se han desarrollado procedimientos especiales para <letennir:ir 1 " '' "crill- ne~ sinergísticas y antagónicas entre di~tintas sustancia~. así como Pª'ª •·· determinación de los efectos sobre otros organismos (pr · "Ll ' .~. helmin- tos, algas, tejidos celulares, virus).

380

1

O.

Oxidaciones incompletas

y biotecnología microbiana

10.5.2 Antibióticos de importancia terapéutica

A continuación presentaremos algunos antib16t1cos de aplicación qu in

terapéutica.

El primer puel.to

lo ocupa aún

el

antibiótico

producido

0

_

Por

Pe11icillium

1101a111111,

P.

chr)'soge1111111

y

por

otros hongos. la p e ni cilina

sobre todo

al

haberse conseguido

la producción

de penicilinas

semisi

1

té~

tica<., (escisión del

ácido 6-aminopenicilánico

y

<.,u<.,titución por otras

<.:aJe.

nas laterales).

pcmc1hna sobre el

prácticamente inocuo

Ya hemo.,

indicado anteriormente el punto de ataque de la

54). Para el hombre e,

metaboli-.mo bacteriano (pág.

y -.ólo un bajo porcentaje de los indi,iduos tratado,

con ella puede presentar reacciones alérgicas.

pe11icili11asa

de

penicilinas (Fig.

10.8).

Muchas bacteria-. producen

e inactivan a la penicilina por rotura del anillo

Por !>ustilución del ácido 6-aminopenieilánit:O por ácidos clorado'> pu eden

semi-

sinteti1arse cientos

.,intéticas no se abren por acción de la

se también por vía oral gracias a su estabilidad frente a lo'> ácidos.

l3- lactám i1:o.

Muchas penicilinas

penicilinam

y pueden administrar-

penrcihn-adlasa

1

1

1

1

H

H

O-cH 2-COJ.NH

¡.+sxCH3

OJ.N\"

CH 3

: COOH

penOc:i!ina G

A

()-o-cH-CO-

1

CH3

leootolína

Q:-

OCH

3

metocdina

0-rH-CO-

1

NH2

ampicitona

Q--rH -co-

1

COOH

catbenooloN

Flg.

10.8

Puntos de ataque de

los enzimas bacterianos

penicillnasa

y

penici·

lfn-acilasa

sobre la penicilina G. Por transformación del ácido 6-aminopenicllánico

los cloruros ácidos de los restos ácidos indicados

penicilinas

más aba¡o

(sustitución de A) con

obtenerse las

pueden

semisintéticas fenet1cliina, meticilina, ampicilina

y

carben1c1hna.

Las

ce fal os p o rina s

'>011

excretadas

por

Ct

1

plwlo.1pori11m.

La cefalosporina

C

posee

una

especie

del

hon~o

un

anillo 8-lac1ámico }

i.:~

semejante a la penicilina (Fig.

titución del

10.9).

Por rotura de la cadena lateral

y

su~­

ácido 7-cefalo1,porínico mediante otras cadenas laleralcs puc-

H~l+-CO-CHC~

~

O

o~

*)~~

té~

10.5 Producción de antibióticos

381

den

c uya acción es semejante a la de los derivados de la penicilina.

producirse cefalosporina'>

semisintétícas (cefalotina.

cefalondma ).

La

estre ptomicina

!>e

aisló

a partir de

un medio

de cultivo

de

Strepto-

1'1\'et'J

griseus

y es producida también por olras especies de

S1repto1111•ces.

Es tá

pentosa

compuesta por tres

unidades:

N-metil - 1.- 2 - glucosamina,

una

y

un derivado del inositol con dos restos de guanidina (Fig.

metil -

10.9).

La

estreptomicina debe el éxito de su aplicación a la acción sobre una serie

que no son atacable'> por

secunda-

en la lucha con-

las enfermedades vegetales.

cloranfenicol) se encontró en primer Jugar en culti-

de bacteria'> ácido-resi\tentes

la pt:ntcílina.

rias.

tra

En el

hombre

'>C

La cloromicetina

y Gram negativas.

dan

muchas reacciones alérgicas

La estreptomicina -.e utili1a también en veterinaria

(=

y

vos

de

Streptomyces 1e11e::.uelae.

pero también puede

obtenerse

por vía

cefalosponna

e

estreptomicina A

HO-CH

1

H~l+-CO-CHC~

CH;PH

cloromocetina

Sar - L- Pro

1

L-MeVal

1

0 -

D

1

- Val

1

L-Thr

~

O

tetrac1chna

L- Pro-Sar

o~

1

o - Val

1

1

l - MeVal

1

_!,-Thr-0

 

*)~~

 
 

CH3

CH3

 

actinomicona O (C .)

 

hon~o

Fig .

10.9

Fó rm ul as es tr uct urales de c efal ospor ln a

e,

es tre pto mi cina A,

cloro-

i.:~

ITllcetlna

(=

cloranfenico l),

tetraciclina

y

actlnomlclna

O (=

actinomlclna

C,).

su~­

L·Thr -'

L·treonina;

o-Val

=

o-valina:

L-Pro

=

L·prollna; Sar

=

sarcosina;

L-MeVal

=

N·metil·L·valma.

382 10. Oxidaciones incompletas y biotecnología microbiana

sintética (Fig. 10.9). Es extraordinariamente estable y actúa contra muchas bacterias Gram negativas, pero también contra espiroquetas, rickettsia~ actinomieetos y virus de gran tamaño.

Las tetraciclinas son excretadas por estreptomicetos (entre ellos Streptomyces aureofaciens). Químicamente están muy relacionadas y pro- ceden del esqueleto del naftaceno (Fig. 10.9). Las más conocidas son la clorotetraciclina (aureomicina), la oxitetraciclina (terramicina) y la tetra- ciclina. Se caracterizan por tener un amplio espectro de acción y por su buena tolerancia.

Entre los macrólidos se cuentan antibióticos de distintos orígenes con una masa molecular relativamente alca, que se caracterizan por poseer un anillo lactónico macrocíclico (erilromicina, carbomicina A, picromicina y otros) .

La actinomicina se aisló en 1940 como el primer antibiótico producido por estreptomicetos. Se trata de una mezcla de varias sustancias, que tie- nen en común un cromóforo de fenoxazona; éste está sustituido por vari as cadenas polipeptídkas distintas (Fig. 10.9).

Como último grupo debemos citar los antibióticos polipeptídicos (gra- micidina S, polimixina, bacitracina, ristocetina, enlre ou·os). La polimix1- na B está constituida por un anillo de siete aminoácidos con una cadena lateral peptídica (Fig. 10.10). Los antibióticos polipeptídicos tienen una alta afinidad por la membrana citoplasmática; por ello son igualmente tóxicos para las bacterias como para los eucariotas y por tanto no se utili- zan en clínica. Debido a su capacidad para transportar de forma selectiva iones a través de la membrana se han utilizado en investigación como ionóforos (apartado 7.7). La valinomicina facilita, por ejemplo, el trans- porte de iones potasio a través de la membrana. Está formada por un ani- llo de doce miembros con valina, 2-hidroxiisovalerato y lactato como componentes. de forma que el ion potasio cabe en el espacio interno de la molécula. Debido a su contenido en valina y valerato el complejo valino- micina-K es li pófilo en su cara externa y es transportado fácilmente a tra- vés de la capa lipídica de la membrana. La adición de valinomicina a una suspensión de células conduce por tanto al empobrecimiento de las célu- las en iones potasio.

En la industria farmacéutica la producción masiva de antibióticos ya no se realiza en ningún caso con las cepas originales, sino siempre mediante

mutantes superproductores . El hongo de FLEMING

producía aproximada-

mente 3 µg de penicilina/mi, las cepas utilizadas actualmente producen por lo menos una cantidad 2000 veces superior. Este incremento en el ren- dimiento se debe a la mutación y selección de cepas más activas. a la mejora de los medios de cultivo y a la investigación de l as condicione~ óp11111a~ de cultivo. Una vez se conocen las vías biosintéticas de mucho~

'

efe~

10.5

Producción de antibióticos

383

óp11111a~

Flg. 10.10 Pol imixina B. L-Dab =ácido 2 ,4-dia- minobutírico; L-leu = L·leucina; o-Phe = o-fenil· alanina; L·Thr =L-treonina; la cadena lateral alifá- tica es el ácido 6-metiloctánico.

'

L Dab- t-Leu

/

L- Dab

L-Thr

0-Phe

t

L-Dab

""L - Dab /

t

L-Dab

t

L-Thr

t

L- Dab

1

efe~

antibióticos se está en disposición de incrementar sensiblemente los ren- dimientos por mutación y por una selección dirigida de mutantes.

10.5.3 Micotoxinas

Las micotoxinas son metabolitos secundarios de hongos con acción tóxi- ca sobre el hombre y animales. Un productor de micotoxinas es por ejem-

plo, Claviceps purpurea, el cornezuelo del centeno (apartado 5.4). Los alcaloides que sintetiza, derivados del ácido lisérgico (ergotamina, ergo-

toxina) desempeñan un

vasculares, migrañas, y corno alucinógenos. Aunque la porción principal del corneL.uelo del centeno (Seca/e cornutum) se produce aún actualmen-

te por in fecció n artificial del centeno fund idad de otras cepas, entre ellas C. te interesante.

Muchos hongos. entre ellos Jos hongos de sombrerillo y los mixomicetos, son productores de venenos muy activos y son sustancias orgánicas par- cialmente poco investigadas desde el punto de vista químico. Mostrarían probablemente acciones interesantes. Entre ellas se encuentran también las toxinas de las formas venenosas de los basidiomicetos Amanita pha- lloides (amanitatoxina), A. pantherina, A. muscaria e In ocybe patoui/lar- dii (atropina fúngica y muscarina). La investigación de la inmensidad de metabolitos secundarios de los hongos no ha hecho más que empezar. Las micotox inas han vuelto a sali r a Ja luz públi ca cuando miles de pavos jóve- nes murieron a causa de alimentos contaminados con aflatoxinas. Las aflatoxinas son derivados de la cumarina y los forman algunas cepas de Aspergillus jlavus, A. parasiticus, A. oryzae y otros hongos, Y pueden

con C. purpurea, el cultivo e n pro- paspali, parece ser económicamen-

papel significativo e n la terapia de enfennedades

384 1 O.

Ox i daciones incompletas y biotecnología microbiana

encontrarse en todos los alimentos "enmohecidos" (frutos secos, cereales frutos oleaginosos y piensos). Tienen propiedades cancerígenas.

:' M

~vx:3

10.6

aflatoxina B,

Vitaminas

'

Actualmente las vitaminas se añaden de fonna rutinaria a los alimentos y

a los piensos, y por ello se producen en grandes cantidades. Aunq ue

muchas vitaminas se obtengan por vía de la síntesis química, la producción

de riboflavina, vitamina B 12 y

microorganismos. La riboOavina es producida en cantidades de gramos por litro mediante ascomicetos (Ashbya gossypii y Eremothecium ashbyii) así como también por levaduras (Candida) y bacterias (Clostridium).

La vitamina 8 12 se sintetiza exclusivamente por microorganismos. Es esencial para los animales. Han de tomar las vitaminas con la alimentación

o como un preparado vitamínico. La vitamina producida por las bacterias

intestinales, entre ellas E. coli, no puede ser absorbida por los animales. Una adaptación para acceder a las vitaminas del interior intestinal se ve en

los roedores, en los que la coprofagia está muy extendida. Para la produc- ción industrial de vitamina B 1 2 se emplean algunas bacterias. en cuyo metabolismo los corrinoides desempeñan un papel decisivo, como por ejemplo, las propionibacterias, clostridios, estreptomicetos y otras bacte- rias metanogénicas.

vitamina C está condicionada todavía a los

Los carotenoides se utilizan como aditivos alimentarios y dan a la yema del huevo una tonalidad amarilla (i incluso en invierno!). Se aíslan a partir del micelio de úgomicetos (Blakesleea trispora y Choanephora circinans). No obstante, la síntesis química compile con la biotecnología microbiana.

La inclusión de un paso de bioconversión en la síntesis de la vitamina C .

la oxidación del o-sorbitol a L-sorbosa, ya lo hemos mencionado (aparta-

do 10.1 ). Actualmente se trabaja en la construcción de una cepa de Erwinia mediante ingeniería genética para la transformación directa de glucosa en ácido 2-ceto-L-gulónico, que por acidificación da directamen-

te ácido ascórbico.

Los métodos habituales para el cultivo de bacterias, levaduras y otros hon- gos se están utilizando cada vez más para la producción de células anim a-

~vx:3

1O.7 Exopolisacáridos

385

tes y vegetales. Para el crecimiento de células vegetales sobre medios de cultivo sintéticos se están extendiendo métodos que permiten que estas células puedan crecer en fermentadores de varios miles de litros. En estas condiciones las células vegetales sintetizan enzimas y metabolitos secun- darios en cantidades diez o cien veces superiores que en las plantas intac- tas. Sorprendentemente, también se acumulan sustancias que en la planta se sintetizan muy poco o incluso no son detectadas. Por ello, cabe esperar que en un futuro sea posible producir alcaloides, glucósidos, esteroides, ácidos orgánicos y otros metabolitos secundarios también con ayuda de células vegetales.

1o.7

Exopolisacáridos

Para elevar la viscosidad de los líquidos se utilizan desde hace tiempo limos vegetales. En su lugar han ido apareciendo varios exopolisacárid os bacterianos (apartado 2.2.5) (Tab. 10.1 ). Como aditivo para helados, budi - nes, cremas y para el recubrimiento hidrófilo de raíces para que manten- gan la humedad se utilizan los alginatos. Los polisacáridos obtenidos a

Tab. 10.1

Exopolisacáridos de producción microbiana y su utilización.

Producto

Origen microbiano

Utilización

Dextrano

Leuconostoc mesenteroides, sustituto de plasma sanguí-

(a-1,6-glucano)

Klebsie/la, Acetobacter, neo, adsorbente en la indu- estreptococos tria bioquímica

Alglnato (ácidos manurónico y gulurónico unidos por enlace

Azotobacter vinelandii, Pseudomonas aeruginosa

helados, flanes instantáneos, cremas; apresto de textiles y papel; recubrimientos hidrófilos de raíces vegeta-

1,4-glucosídico)

les, heridas y árboles

Xantana (celulosa sustituida con cadenas laterales trisacarídicas)

Xanthomonas campestris

aditivo de bebidas y queso fundido; cremas batidas, flanes instantáneos; estabilizante de emulsiones

Pululano (grupos de maltotriosa unidos por enlaces 13-1,

6-glucosídicos)

Aureobasidium (syn. Pu/fu- /aria =Dematium) pullulans

cubiertas de alimentos

Curdlán

Alca/igenes faeca/is

gelificante de cremas; no se

(13-1,3-glucano)

var. myxogenes

degrada en el intestino, por ello es pobre en calorías

386

10. Oxidaciones incompletas

y biotecnología microbiana

partir de algas

duetos obtenidos con

cación múltiple

marinas

van siendo sustituidos de forma creciente por pro

Una ap h

la ayuda de

lm.

limos

A;otobacrer

formados

y

Pseudomonas.

por

Xa11tho111011as

la tienen

campes .

a partir de e\ta bacteria patógena de vegetales. Están for-

1,4-glucosídicos

(igual

xantanas

mentidos

e

petróleo. Para la preparación de budine-.

li1a el curdlán que

utili?ación del dextrano como su'>tituto de pla<,ma sanguíneo y como base

del sephadex (adsorbente) ya hemo\ in-.istido en el apartado

tris.

la xantana.

madas

por cadena'>

que

la

de

glucm.a

enlatadas

por

cadenas

enlaces

B-

laterales

de

celulosa)

y

so¡x)rtan

trisacáridos.

L is

ah.

se util11an

y

en

como espesantes en

la elaboración de producto<,

la industria cosmética.

aditivo-. en

no e-.

el

agua

para cmuJ<

de extracción

ionar tintas de imprenta

de

los yacimientos

oe

incluso como

y \opas pobres en calorías se ut. ·

mtestino humano.

Acerca de

2.2.5.

I.1

degradado en el

10.8 Enzimas

La

extraído del estómago de los rumian tes y las

tratamiento de las pieles

sos

oferta de enómas

re11i11a

ut ili tada habitualmente en

faci litan

la

producción

del q ueso du ro

se ha

lJ

proteasas

necesarias para el

Los proce·

a parti r de excrementos pul verizad os.

e l

acceso

a

estos

e nzimas,

y

han

10.2).

microbianos

ampl iado

El cuajo util i

ut ili1ables en biotecnología (T ab.

zado habitualmente en la producción de la cuajada de la leche se ha suMi-

tuido por la

re11i11a

producida por

Mucor rouxii

y otros hongos. En el curso

de la producción de alcohol hay que obtener azúcares a partir del almidón.

ahora ya no hay que

partir del

grano gem1inado de cereales, sino que se

añade

ami/asa

íúngica al almidón.

Para obtener fructosa a partir de almi-

dón .

que

tiene

mayor poder edulcorante que

la sacarosa o

la glucosa.

s

transforma el almidón por la

cx-amilam

y la

g/ucoamilasa

a glucosa. y ést.

en

un elevado

porcentaje a

fructosa mediante la

glucosa-isomerasa.

Para

la degradación

del

almidón

también resulta

apropiada

la

pu/11/a11asa

que

hidroli?a uniones a - 1.4-glucosídicas y a- 1.6-glucosídicas. DiYersos prepa- rados relativamente termotolerante\ de esto'> enzimas se obtienen de baci-

los. estreptomiceto-. )

intenta obtener celulo'a

barata a partir de madera y obtener a1úcar a partir de paja mediante

para

sustrato de la producción de etanol.

bactenm. lácticas. Las

en

detergentes.

También

Triclwderma

\e

proteasas

1-iride

y las

lipasas

se uti -

ce/11

lizan como

lasas

de

adillvo-.

origen

microbiano (de

o

Penicillium)

Lo\ en1imas indicados hasta ahora so

exoenzimas;

son

liberados

por

lo-.

microorganismos y

se

recuperan

de

medio de cultivo.

Entre los entima<, aislado-. a partir de sistemas celulares.

preferentemente

bacterias.

y

que

ofrece

la

industria

bioquímica,

se

encuentran la.,

e11do1111c/N1sas

y otros en1imas de aplicación en ingenie n

genét ica.

La

tecnología genética ha abierto las puertas

a

nu evas

posibili

dades de

utililación de los e n1 imas microbianos e n la Bio tecnología.

10.8 Enzimas

387

T•b·

10.2

Enzimas de producción mic robiana

y

su utilización.

Nombre del enzima

Origen microbiano

Utilización

y reacción catalízada

lfMllna

Mucor rouxii

obtención de queso duro

coagulación de la caseína de la leche

 

lnllflrla SS

Asperg1/lus oryzae

obtención de azúcar

hidróhs1s de sacarosa

levaduras

y

otros hongos

para golosinas

p,.oteasas

8ac1/lus subtilis

y

aditivos de pro·

hidróhs1s de proteína

otras bacterias, tam-

duetos de lavado:

bién hongos

curtidos

Pectlnasa

y

enzimas

hongos

y

Erwinia

clanflcac1ón de

pectlnolítlcos

 

zumos de frutas

hidrólisis de pectina

 

Llpasa

hongos

y

Pseudomonas

curtidos, aditivos de

hidrólisis de lfpidos

 

productos de lavado

Glucoss -oxldsss

Aspergíllus niger

obtención de ácido

oxidación a gluconato

Gluconobacter oxydans

glucónico

Hexoss-/somersss

Streptomyces

obtención de fructosa

isomenzación de

a partir de glucosa

fructosa

Am llsss

Bac1/lus subtilis,

obtención de jarabe

hidrólisis de almidón

Aspergtllus

spec.,

de glucosa. eliminación

otros hongos

del apresto de almidón

Ce/u/asas

Tnchoderma

viride

glucosa de celulosa

hidrólisis de celulosa

Penicillium

 

Ju mo a lo' productos procedentes de las transformaciom:s microhiuna' 'l.'

mkro biana, ,

La

producen desde

hace

pocos

año-.

las primeras

(apartado

p rote ína'

15.5 )