Master : physique des matériaux

instrumentations et mesures

Compte Rendu de la visite du centre

Partie Théorique
La chromatographie

Définition
La chromatographie est une technique de séparation permet d’identifier et de quantifier les
constituants d’un mélange.

On peut distinguer deux types de la chromatographie :

1. Chromatographie en phase liquide.

2. Chromatographie en phase gazeuse.

La chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique
d'analyse quantitative, qualitative et séparative principalement utilisée dans le domaine de la
chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines variés tels
que la chimie organique et la biochimie. Elle recouvre la chromatographie sur couche mince
(CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase liquide en colonne
ouverte ou à basse pression, et la chromatographie en phase liquide à haute performance
(HPLC).
Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés entraînés par un liquide
(phase mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube
(colonne chromatographique) , soit fixé sur une surface inerte.
La séparation s'opère suivant les interactions chimiques ou physiques des analytes avec la
phase mobile ainsi qu'avec la phase stationnaire.

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) — mais on trouve plus

fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high pressure liquid chromatography) depuis les
années 1990 — est une technique de séparation analytique et/ou préparatrice de molécules
présentes dans un mélange. Cela permet d'adapter les méthodes chromatographiques usuelles
sur un montage haute pression.

Principe :
Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est
introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles
interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne
chromatographique.
La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système
chromatographique.
Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique.
Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la
phase stationnaire.
En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés
par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

Les différents modes de séparation

Il existe différents modes de séparation en chromatographie en phase liquide :

• l'adsorption
• le partage (80% des séparations)
• l’échange d'ions
• l'exclusion
Les trois premiers types utilisent la polarité des solutés pour les séparer.

L’appareillage :

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, comme toutes les techniques

de chromatographie, une technique qui permet de séparer des molécules d'un mélange
éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux
composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition.

Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance
active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à
l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer
et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction
de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.

L’appareillage :
La spectroscopie de masse
Définition
La spectrométrie de masse est une technique permettant de déterminer la masse d’une
molécule ou d’une association de molécules. Grâce à sa sensibilité (des limites de détection de
l’ordre d’attomole sont souvent atteints), sa sélectivité et sa possibilité de faire des analyses
quantitatives rapides, la spectrométrie de masse joue un rôle important dans plusieurs
domaines, comme l’antidopage, la protéomique, la médecine… Les spectromètres de masse
sont de plus en plus performants, ils offrent de très haute résolution et des précisions en masse
de l’ordre <1 ppm, permettant de proposer la composition élémentaire d’une molécule, d’une
séquence peptidique … De plus la spectrométrie de masse est un outil très efficace qui offre la
possibilité de sonder la structure d’une molécule, et d’expliquer une rupture ou un
arrangement d’une liaison en phase gazeuse.
Source d’ions :
Les ionisations EI et CI, qui nécessitent un certain niveau de vide, sont préférentiellement
utilisées en couplage avec la chromatographie en phase gazeuse (la CI fonctionnant à partir
d'une source EI). En revanche, les deux sources à pression atmosphérique (electrospray et
APCI) dites à « ionisation douce », sont principalement utilisées en couplage avec la
chromatographie en phase liquide.

Son principe est le suivant : à pression atmosphérique, les gouttelettes de solutés sont formées
à l'extrémité d’une fin capillaire portée à un potentiel élevé. Le champ électrique intense leur
confère une densité de charge importante. Sous l'effet de ce champ et grâce à l'assistance
éventuelle d'un courant d'air coaxial, l'effluent liquide est transformé en nuage de fines
gouttelettes (spray) chargées suivant le mode d'ionisation. Sous l'effet d'un second courant
d'air chauffé, les gouttelettes s'évaporent progressivement. Leur densité de charge devenant
trop importante, les gouttelettes explosent en libérant des microgouttelettes constituées de
molécules protonées ou déprotonées de l'analyte, porteuses d'un nombre de charges variable.
Les ions ainsi formés sont ensuite guidés à l'aide de potentiels électriques appliqués sur deux
cônes d'échantillonnage successifs faisant office de barrières avec les parties en aval
maintenues sous un vide poussé (<10−5 Torr). Durant ce parcours à pression élevée, les ions
subissent de multiples collisions avec les molécules de gaz et de solvant, ce qui complète leur
désolvatation. En faisant varier les potentiels électriques appliqués dans la source il est
possible de provoquer des fragmentations plus ou moins importantes.
L'avantage de cette méthode d'ionisation comme pour l'APCI est l'obtention d'ions
multichargés, pour les macromolécules, polymères. Elle permet d'autre part de générer une
ionisation « douce » : des ions moléculaires sont formés en majorité.
Un faisceau laser pulsé est utilisé, généralement dans le domaine des ultraviolets, pour
désorber et ioniser un mélange matrice/échantillon cocristallisé sur une surface métallique, la
cible.
Les molécules de matrice absorbent l'énergie transmise par le laser sous forme de photons
UV, s'excitent et s'ionisent. L'énergie absorbée par la matrice provoque sa dissociation et son
passage en phase gazeuse. Les molécules de matrice ionisées transfèrent leur charge à
l'échantillon. L'expansion de la matrice entraîne l'échantillon au sein de la phase gazeuse
dense où il va finir de s'ioniser.
L'ionisation de l'échantillon a donc lieu soit dans la phase solide avant la désorption, soit par
transfert de charge lors de collisions avec la matrice excitée après désorption. Elle conduit à
la formation d'ions monochargés et multichargés de type [M+nH] n+, avec une nette
prépondérance pour les monochargés.
Des électrons émis par un filament rencontrent les molécules qui entrent dans la source : lors
de la rencontre, si l'énergie cinétique des électrons est suffisante, un électron est arraché de la
molécule M, la transformant en un ion radical M+o. Celui-ci peut ensuite se fragmenter
suivant son énergie interne. L'EI conduit ainsi à un spectre assez fourni, avec de nombreux
fragments, très riche en informations structurales.

Les échantillons liquides sont directement introduits dans un nébuliseur pneumatique. Sous
l'effet d'un jet d'air ou d'azote, le liquide est transformé en fin brouillard. Un chauffage assure
la désolvatation des composés. Ces derniers sont ensuite ionisés chimiquement à pression
atmosphérique : en général, la phase mobile vaporisée joue le rôle de gaz d'ionisation et les
électrons sont obtenus à partir de décharges d'électrode couronne. L'ionisation des composés
est très favorisée lors de ces techniques car la fréquence des collisions est élevée à pression
atmosphérique.
L'APCI est une technique analogue à l'ionisation chimique (CI), elle fait appel à des réactions
ions-molécules en phase gazeuse, mais à pression atmosphérique et conduit essentiellement à
la formation d'ions [MH] + ou [M-H]−.

Elle permet d'analyser des molécules non vaporisables sous vide (grosses molécules
biologiques). L'ionisation est effectuée par expulsion en phase vapeur des ions contenus dans
un échantillon liquide à la suite d'un bombardement d'atomes rapides (Ar ou Xe). Les
molécules ainsi ionisées n'ont pas beaucoup d'énergie interne, la fragmentation est donc
faible mais l'ion moléculaire est facilement reconnaissable et la masse moléculaire est facile à
déterminer. L'échantillon est mélangé en solution à une matrice liquide non volatile (glycérol,
thioglycérine, alcool m-nitrobenzylique). Un faisceau à haute énergie (de l'ordre de 4
à 10 KeV) d'atomes neutres (Ar ou Xe) est envoyé sur l'échantillon et la matrice dans la
chambre de collision causant ainsi les phénomènes de désorption et d'ionisation. Les ions
préexistants en solution sont expulsés en phase gazeuse et accélérés vers l'analyseur.
En plus du dispositif EI ci-dessus, un gaz réactif est introduit dans la source et ionisé par
impact électronique. S'ensuit une série de réactions qui donne naissance à des ions pouvant
réagir avec les molécules d'analyte arrivant dans la source. Ce type de réactions ions-
molécules produit principalement (en mode positif) des ions [MH] +, et [M+adduit+H]+,
permettant ainsi d'accéder à la masse moléculaire de l'analyte.
Le méthane, l'isobutane et l'ammoniac sont parmi les gaz d'ionisation chimique les plus
utilisés.
Pour la détection de molécules globalement électronégatives, comportant des parties
halogénées, on peut faire appel à l'ionisation chimique négative. Le principe est de charger
négativement ces molécules en les bombardant d'électrons qui seront capturés par les atomes
électro attracteurs. Du fait de la forte probabilité de capture de l'électron, ce type d'ionisation
peut être 1000 fois plus sensible que l'ionisation chimique positive.

Analyseurs de masses :
Rappelons qu’il existe quatre technologies différentes pour trier, selon leur rapport m/z, les
ions issus d’une source d’ions :
— l’analyseur magnétique (B) ;
— l’analyseur quadripolaire (Q) ;
— les trappes (T), selon deux variantes :
• « Trappe ionique de Paul » (trappe classique cubique ou, récemment, trappe linéaire,
LTQ),
• « Trappe ionique de Penning », associée à une analyse par Transformée de Fourier
(FT/MS) ;
— le temps de vol (TOF/MS) - Time Of Flight Mass Spectrometry.

Ces analyseurs sont combinables de multiples manières, en associant 2 analyseurs (MS-MS)

ou plus (MSn), pour des performances et des sélectivités accrues.
Les détecteurs :
Le détecteur le plus fréquent dans les GC-MS et LC-MS commerciaux est le
« Multiplicateur » qui effectue la conversion ion-électrons par émission secondaire
d’électrons, après impact de l’ion incident sur une surface.
Le dispositif amplifie le courant initial produit par conversion électrons-électrons,
également par des mécanismes d’émission secondaire.

Le couplage chromatographie-spectrométrie
de masse
Un couplage chromatographie-spectrométrie de masse consiste à réaliser un appareillage, ou
une méthodologie analytique, permettant de réunir en série plusieurs sous-ensembles
traversés successivement par les échantillons à analyser.
La réunion de la partie chromatographique au spectromètre de masse pose un ensemble de
problèmes spécifiques, absents lorsque chacun est utilisé indépendamment. L’idéal est de
trouver au final un compromis permettant à chaque élément de fonctionner dans ses
conditions optimales.
Classiquement, conception et réalisation de l’interface se sont longtemps traduites par l’ajout
d’un troisième élément pouvant être complexe, d’où parfois son prix élevé jusqu’à être très
supérieur à la simple addition des deux parties (quelquefois dans des proportions
considérables). Cette notion d’interface distincte est beaucoup plus floue dans les appareils
intégrés modernes.
On parle de couplage en ligne (on-line coupling) lorsque l’opérateur n’intervient à aucun
moment entre le dispositif chromatographique et la source du spectromètre de masse. Ce type
de couplage se retrouve dans la majorité des systèmes commerciaux actuels.
Des modes de couplages discontinus (off-line coupling ) sont parfois mis en œuvre lorsqu’il
n’existe aucun moyen réaliste d’effectuer une transition directe. L’opérateur, ou un robot, doit
intervenir pour effectuer une manipulation, par exemple évaporer un solvant, effectuer une
extraction ou la préparation d’un dérivé, avant de passer à l’étape suivante. C’est le cas des
méthodes chromatographiques sur des supports planaires, ou des méthodes de spectrométrie
de masse par désorption d’une surface ou d’une matrice solide (MALDI).
 Schéma simplifié d’un couplage classique chromatographie-spectrométrie de masse avec
source d’ions sous vide.

C’est un schéma simplifié de la plupart des GC-MS actuels et des premiers systèmes LC-MS
qui, en voulant adhérer à ce modèle, ont souvent abouti à des impasses.
La source d’ions se trouve sous vide et le principal problème d’interfaçage consiste à y
raccorder la colonne chromatographique.
Conditions de vide dans le spectromètre de masse

Quel que soit le couplage chromatographique, GC-MS ou LC-MS, l’analyseur de masse doit
toujours être sous vide afin de ne pas perturber l’action du champ de force (magnétique ou
électrique, selon le type d’analyseur) dirigeant le mouvement des ions entre leur source et le
détecteur.
Les pressions habituelles de fonctionnement des analyseurs sont de 10–3 à 10–4 Pa, les
quadripôles et les trappes tolèrent généralement des pressions environ 5 fois plus élevées que
les appareils magnétiques.
Ces pressions dépendent des quantités de gaz admises à l’intérieur du spectromètre de masse
par l’interface, de l’efficacité des systèmes de pompage pour le vide et des impédances
pneumatiques des canalisations qui évacuent les gaz vers les pompes à vide.
Partie instrumentation
Schéma explicatif de l’installation :
Les éléments principaux de LCMC - 8030

Grâce aux spectromètres de masse LCMS-8030, Nous valorisons nos analyses quantitatives et
bénéficions d’une productivité et de performances immédiates.

• Ultra-Fast swtiching, inversion de polarité ultrarapide jusqu’à 5 msec sans perte de

sensibilité.
• Ultra-Fast scanning, vitesse de balayage ultrarapide jusqu’à 30 000 u/sec.
• Ultra-Fast MRM (Multiple Reaction Monitoring) suivi alterné de plusieurs transitions
métastables), acquisition MRM ultrarapide 555 MRM par seconde, la plus élevée jamais
atteinte.

• Y compris lors des mesures ultrarapides, l’Ultra-Fast MS fournit des données fiables et
reproductibles.
• Technologie UFsweeper diminue considérablement la contamination croisée.
• Excellente linéarité avec une large échelle dynamique.
• Maintenance aisée de la source sans rupture du vide.

• Le nouveau LCMS-8030 offre une sensibilité qui convient aux applications les plus
exigeantes à un faible niveau de concentration en matrices complexes.

• Logiciel d’optimisation des transitions et de la source intégrée et simple de mise en œuvre.

 Chromatographie
Spectrométrie
gazeuse
de masse

Le gaz vecteur utilisé dans notre cas est l’hélium He.

L’appareil est constitué aussi d’un four dont la température peut atteindre 450°C
La colonne est placée à l’intérieur du four, dans notre cas la colonne est du 30 m de langueur
et 0.25 mm de diamètre.
Les ions se chargent par impact électronique et l’intensité du courant d’électrons ionisants qui
pénètrent dans la source (généralement dénommé courant « trappe »), et de l’énergie des
électrons (souvent 70 eV) et ils sont détectés à l’aide d’un seul analyseur quadripolaire.

Conclusion
La spectroscopie de masse et la chromatographie sont des techniques très importantes à la
séparation et l’analyse des composantes chimiques, elles sont complémentaires et le choix
entre les deux types des chromatographies est une question de volatilé.