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CALLAO-2018-PERÚ
20. Los informes de la práctica realizada deben ser presentados a la semana siguiente
manteniendo el siguiente formato: Carátula, Introducción, Materiales y Métodos, Resultados,
Discusión y Conclusiones, y Bibliografía.
21. En el informe puede adicionarse la solución de un cuestionario sobre un grupo de preguntas,
relacionados al tema, elaborado por el profesor.
INTRODUCCIÓN
Las primeras prácticas están relacionadas a las técnicas de observación microscópica de los
microorganismos, la segunda parte relacionada al cultivo y caracterización macroscópica de
colonias microbianas, la tercera parte correspondiente a las técnicas que demuestran la actividad
de ciertos agentes antibacterianos y por último el estudio de los hongos. Estos trabajos prácticos
de laboratorio son complementarios a los temas que se desarrollan en las clases de teoría.
PRÁCTICA N° 1
Objetivos
Procedimiento
Probeta
Pipeta
Gradilla
Placa de Petri
Embudo aforado
Matraz Kitasato
Jarra de anaerobiosis
Microscopio compuesto
Contador de colonias
Estufa
Equipo que contiene una cámara de calentamiento con flujo de aire seco
caliente, utilizado para la desecación de material biológico y para la
esterilización al seco (150 a 180 °C) de materiales de vidrio o metálicos.
Autoclave
Incubadora
Centrífuga
pH metro
Portaobjetos y cubreobjetos
Láminas de vidrio que se utilizan para la preparación de montajes de muestras de células o tejidos
y la preparación de los frotis microbianos.
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Otros procedimientos
PRÁCTICA N° 2
OBJETIVOS
PROCEDIMIENTO
Observación 1 Observación 2
b. Observación de levaduras
Observación 3 Observación 4
2. Coloración simple
En una lámina portaobjetos, con la ayuda de una asa de siembra extender una gota de
fermento o suspensión de levaduras y dejar secar en el ambiente.
En otra lámina realizar el extendido de una gota de yogurt y dejar secar en el
ambiente.
Luego, realizar la fijación de las muestras, pasando por la llama del mechero el lado
que no contiene la muestra (3 veces).
Cubrir las muestras con azul de metileno al 0,1 % durante un minuto. Luego de este
tiempo, descartar el exceso del colorante y lavar con un chorro de agua.
Dejar secar y observar las coloraciones con el objetivo de inmersión.
Dibujar la forma de las levaduras (Observación 5) y bacterias (Observación 6).
Observación 5 Observación 6
a.
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b.
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2. En las células microbianas, después de la fijación con lugol, que estructuras celulares se
hacen visibles.
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Investigación:
PRACTICA N° 3
OBJETIVOS
Los métodos de coloración compuesta son utilizados con la finalidad de establecer respuestas
diferenciales entre grupos microbianos con el fin de aproximarse a su identificación o
reconocimiento. Dos técnicas de coloración compuesta o diferencial son las más comunes: La
técnica de Gram y la coloración alcohol ácido resistente o técnica de Ziehl Neelsen.
En la coloración alcohol ácido resistente se usa como principio diferencial el alto contenido de
lípidos en la pared celular de las micobacterias, especialmente el de la cera D.
PROCEDIMIENTO
1. Técnica de Gram
a. Frotis o extendido
La muestra (sarro dental, hisopado faríngeo, agua residual, yogurt, etc) se coloca en el
centro de una lámina porta objetos y con un asa de Kolle se extiende en la superficie
media.
b. Fijación
c. Coloración primaria
Se cubre el frotis con el colorante primario cristal violeta o violeta de genciana durante
un minuto, tiempo luego del cual se lava el exceso con un chorro de agua destilada.
d. Mordiente
El frotis se cubre con una solución de lugol (solución de yodo y yoduro de potasio)
durante un minuto, tiempo luego del cual se lava el exceso.
e. Decoloración
Se realiza cubriendo el frotis con alcohol cetona por un periodo de tiempo aproximado de
10 segundos. Luego se lava con agua destilada.
Se hace cubriendo el frotis con safranina durante un minuto, tiempo después del que se
lava con agua destilada.
g. Observación al microscopio
Observación 1 Observación 2
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3. Que relación existe entre la composición de la pared celular de las bacterias Gram negativas
y la decoloración con alcohol cetona.
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Cuestionario e investigación:
PRACTICA N°. 4
COLORACIONES ESPECIALES
INTRODUCCIÓN:
Las observaciones más detalladas de las estructuras de los microorganismos, tales como las
Endosporas, cápsulas, flagelos y corpúsculos meta cromáticos, requieren de métodos especiales
en la utilización de tintes básicos.
OBJETIVOS:
PROCEDIMIENTO:
A partir de un cultivo de Bacillus, extender la muestra con el asa de siembra, sobre la lámina
portaobjetos.
Fijar la muestra el calor y cubrir con Verde de Malaquita. Esperar que caliente hasta la
aparición de vapores por 5 minutos.
Resultados: Se deberá observar a las esporas de color verde y al resto del cuerpo bacteriano de
color rojo. Se determinará la posición de la espora dentro de la célula bacteriana, puede ser
terminal, sub terminal o central, dependiendo de la especie.
Observación
La muestra de saliva o esputo de persona resfriada, proceder a extender igual que para la
coloración de bacterias ácido-resistentes, y fijar a la llama.
Colorear con Fucsina básica o con Safranina, con suaves calentamientos hasta la salida de
vapores blancos durante 1 minuto.
Lavar con solución de Sulfato de Cobre al 20% a chorro continuo.
Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos.
Lavar con agua destilada y secar al aire.
Se colocan en un extremo del porta objeto dos gotas de nigrosina o de tinta china y se hace
una extensión por el método de los dos portaobjetos. Se deja secar y se observa al
microscopio con objetivo de inmersión.
Resultados: En el primer caso se observarán diplococos con una cápsula de color azul suave y
las células acompañantes de color violeta o rosado (dependiendo del colorante utilizado).Y en la
segunda técnica, el fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la cápsula como un halo
blanco que las envuelve
Observación
Extender la muestra de saliva con sarro dentario sobre la lámina portaobjetos y fijar la
muestra al calor.
Colorear con Azul de Metileno por 5 minutos.
Lavar con agua corriente.
Secar y observar.
Resultados: Se observarán a los bacilos largos y ligeramente gruesos de color azul claro.
Observación
CUESTIONARIO:
PRÁCTICA N° 5
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
Objetivos
Procedimiento
El equipo que se utiliza para esta forma de esterilización se llama autoclave. Consta de doble
pared de acero inoxidable que encierra una cámara de aire que actúa como aislante. En la cámara
interna se calienta agua hasta hervir y producir vapor de agua que satura la cámara elevando la
presión y temperatura hasta niveles que destruyen o matan incluso esporas de bacterias y hongos
que son muy resistentes a la ebullición y desecación. En este equipo es posible esterilizar
materiales metálicos, de vidrio, de fibra de celulosa o nitrocelulosa, de poli estireno resistente a la
esterilización y medios de cultivo o soluciones acuosas. También se pueden esterilizara tejidos o
fluidos contaminados con microorganismos patógenos.
Que modificación del protocolo usual de este método aplicaría para esterilizar un medio o
sustrato que tiene alta diversidad y densidad de microorganismos (suelo) productores de
estructuras de resistencia como esporas.
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El equipo utilizado para esta forma de esterilización es la estufa u horno que consta de un sistema
de resistencias que calienta el aire y lo impulsa mediante un ventilador a la cámara interna donde
se encuentran los materiales para esterilizar.
Al igual que el autoclave consta de doble pared de acero inoxidable que forma una cámara
externa de aire que actúa como aislante. En este equipo pueden esterilizarse materiales metálicos
y de vidrio. La esterilización de materiales de fibras de celulosa o nitrocelulosa se limitan a
temperaturas inferiores a 150 °C y soluciones o medios de cultivo no pueden ser esterilizados a
través de la estufa.
Haga un esquema de la posible estructura de una estufa indicando la ubicación de las resistencias
que calientan el aire y de la dirección de flujo del aire caliente.
Que combinaciones de temperatura, presión y tiempo fueron indicados como recomendables para
lograra la esterilización de materiales.
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Marque con una X cual de los siguientes materiales pueden ser esterilizados con seguridad
mediante la estufa.
Preguntas de investigación
PRÁCTICA N° 6
MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVOS
Existen varias formas de clasificar los medios de cultivo. Una forma muy básica de clasificarlos
es identificándolos como medios de cultivo sólidos y líquidos de acuerdo a su consistencia, como
simples o compuestos de acuerdo a su composición. La clasificación que utilizaremos en la
presente práctica es por la composición y función del medio de cultivo:
1. Medios nutritivos
2. Medios enriquecidos
Son los que además de los elementos mínimos necesarios poseen sustancias que mejoran
la calidad nutricional del medio de cultivo y es utilizado para el crecimiento de
microorganismos exigentes. Ejemplos Caldo infusión cerebro corazón y Agar sangre
(tiene como base un medio nutritivo al que se le agrega sangre desfibrinada en un 5 %)
donde pueden crecer cepas de Streptococcus, Staphylococcus, Campylobacter jejuni,
Helicobacter pylori.
3. Medios selectivos
Son los que poseen elementos o sustancias que ejercen una condición de selectividad, es
decir inhiben el crecimiento de un determinado grupo taxonómico microbiano y
favoreciendo de este modo el crecimiento de otro gripo taxonómico. Ejemplo el Agar
EMB (Eosin Methylene Blue) y Agar MacConkey para el crecimiento selectivo de entero
bacterias (coliformes) e inhibición de cocos Gram positivos. Agar Manitol Salado para el
crecimiento selectivo de cocos Gram positivos como Staphylococcus y Estreptococos y la
inhibición de coliformes. Agar Sabouraud para el crecimiento selectivo de mohos y
levaduras y la inhibición de bacterias.
4. Medios diferenciales
PROCEDIMIENTO
Indicar en cada elemento o sustancia que compone el Agar Plate Count si se constituye en fuente
de carbono (C), fuente de nitrógeno (N), fuente de cofactores enzimáticos y/o vitaminas (Vit) y
que condición o factor de crecimiento permite regular: pH, presión osmótica (). Observe el
ejemplo descrito para el Agar Nutritivo.
Destapar y exponer al contacto con el aire una placa de Petri conteniendo Agar Plate Count
durante dos minutos con el fin de que esporas o células vegetativas de hongos y bacterias se
adhieran sobre el medio de cultivo y generan colonias luego de su incubación a 30 °C durante 48
horas.
Indicar en cada elemento o sustancia que compone el Agar Sangre (con medio base sangre) si se
constituye en fuente de carbono (C), fuente de nitrógeno (N), fuente de cofactores enzimáticos
y/o vitaminas (Vit) y que condición o factor de crecimiento permite regular: pH, presión osmótica
().
Sangre desfibrinada 50 ml
pH = 6.8 .2 a 25 °C
Modo de esterilización:
Completar el cuadro para el Agar EMB según corresponda. En la columna con ( I ) anotar (Inh)
si la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es
actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
Completar el cuadro para el Agar Manitol Salado según corresponda. En la columna con ( I )
anotar (Inh) si la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si
la función es actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
pH = 6.8 .2 a 25 °C
Modo de esterilización:
En el Agar EMB sembrar mediante el asa de Kolle una muestra de agua servida o agua de
uso recreacional. Incubar a 37 °C por 24 – 48 horas.
En el Agar Manitol Salado sembrar mediante el asa de Kolle una suspensión de agua de
queso triturado en una proporción de 10 % (10 g queso - 90 ml de agua destilada estéril).
Incubar a 37 °C por 24 – 48 horas.
En el Agar Sabouraud sembrar mediante el asa de Kolle agua de lavado de fruta (lavar
una muestra de uvas en agua destilada estéril). Incubar a 30 °C por 24 – 48 horas.
Medios diferenciales
Completar el cuadro para el Agar TSI según corresponda. En la columna con (I) anotar (Inh) si la
actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es
actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
Completar el cuadro para el Agar LIA según corresponda. En la columna con (I) anotar (Inh) si
la actividad del componente es inhibir el crecimiento de modo selectivo o (Ind) si la función es
actuar como indicador de la ocurrencia de una reacción.
PRACTICA N° 7
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
INTRODUCCIÓN
En la Naturaleza, los microorganismos viven casi siempre en mezclas. Por tanto, es necesario,
antes de estudiar las características de un microorganismo en particular, que éste sea aislado en
un cultivo puro. El procedimiento general para lograr el aislamiento de un microorganismo en un
cultivo puro, consiste en usar un medio de cultivo y condiciones de incubación que estimulen el
crecimiento y que inhiban el crecimiento de otros organismos acompañantes. La esencia para
tener éxito en el cultivo de microorganismos es tratar de practicar una técnica aséptica. Esta
técnica requiere la preparación de un medio de cultivo estéril y la manipulación de los cultivo en
condiciones que eviten la contaminación con sustancias extrañas.
OBJETIVOS
PROCEDIMIENTO
Antes de realizar la siembra, se debe plaquear los medios de cultivo, preparados durante el
desarrollo de las prácticas anteriores. El procedimiento se realizará en asepsia, para evitar la
contaminación.
Primero, se calentarán los medios de cultivo y esperar a que se vuelvan al estado líquido,
en el Baño María a 90° C.
Se tomará cada placa Petri estéril y delante del mechero se le adicionará un volumen de
15 ml del medio de cultivo enfriado a 55° C.
Se sellará la placa y se esperará a que solidifique el medio para proceder a invertir la placa
e incubar.
Tomar el inóculo de la muestra, con la pipeta Pasteur, Flamear previamente la boca del
tubo antes y después de extraída la muestra.
Depositar una gota del inóculo sobre la superficie del medio. Cerrar la placa a la llama del
mechero y devolver el sobrante de la muestra al tubo de cultivo.
Calentar al mechero la espátula de Drigalsky y esterilizar. Destapar con la mano izquierda
lo necesario para introducir la espátula.
Diseminar la gota del cultivo con la espátula, por la superficie del medio. Desechar la
espátula.
Rotular los datos sobre el dorso de la placa Petri, escribiendo: Nombre del grupo, tipo de
siembra y fecha.
Incubar a 37° C durante 24 a 48 horas, colocando las placas en la estufa en posición
invertida.
RESULTADOS
Hacer esquemas de cada uno de los métodos de aislamiento, y describir cuidadosamente, sobre lo
realizado en práctica. Los alumnos deberán estar alertas por revisar sus aislamientos, sobre todo
por si se produjera contaminación en alguna placa, ésta deberá ser descartada de inmediato.
CUESTIONARIO
Explique las recomendaciones generales que se debe tener en cuenta para realizar un
adecuado aislamiento de microorganismos.
¿Cuáles son las muestras problemas que pueden tomarse y cuáles son las normas
específicas para colectarlas?
¿Cuál es la finalidad del aislamiento de microorganismos?
¿Qué es un CLON?
Explique los métodos para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias.
¿Si desea realizar recuento de células bacterianas, qué método de siembra emplearía? ¿Por
qué?
PRACTICA Nº 8
MORFOLOGÍA DE COLONIAS
INTRODUCCIÓN
Las colonias son masas microbianas definidas separadas entre sí. Cada colonia, no viene a ser
sino el resultado de la multiplicación logarítmica de una célula depositada en un punto del medio
sólido, que en condiciones óptimas de crecimiento forma su progenie con sus características
distintivas de especies o grupos bacterianos.
La morfología de las colonias puede depender de varios factores: naturaleza del medio para el
vigor del crecimiento, temperatura y tiempo de incubación, modo de división celular y tipo de
movimiento post-fisión; en consecuencia, una variedad de bacteria tiende a formar
constantemente el mismo tipo general de colonia cuando crece sobre el mismo medio y bajo
iguales condiciones. De esta manera, por sus caracteres ayuda grandemente a la identificación.
Los principales caracteres tomados en cuenta para la descripción de una colonia son: forma,
tamaño, borde, elevación, textura de la superficie, consistencia, grado de adherencia al medio,
cromo génesis.
OBJETIVO:
Reconocer los diversos parámetros que se toman en cuenta para describir una colonia
bacteriana.
Relacionar la morfología colonial con la capacidad tintorial.
PROCEDIMIENTO:
RESULTADOS
Determinar la descripción de las colonias con la morfología celular y Gram. Así por ejemplo:
EJERCICIO
De las colonias seleccionadas, haga la descripción en el siguiente cuadro, según las características
indicadas:
CUESTIONARIO:
PARTE III
PRACTICA N°. 9
I. INTRODUCCIÓN:
II. OBJETIVOS:
1. Baño María, Incubadora, autoclave, estufa esterilizadora, cámara con luz UV.
2. Cultivo en caldo de una bacteria, Agar nutricio, Sacarosa o Cl Na, Cristal violeta.
3. Tubos estériles, Placas Petri estériles.
4. Mechero, alcohol, algodón, asa de siembra.
IV. PROCEDIMIENTO:
V. RESULTADOS:
Control
c/colorante
COLORANTE
s/colorante
VI. CUESTIONARIO:
PARTE IV
PRACTICA N°. 10
I. INTRODUCCIÓN:
Los hongos son organismos no fotosintéticos que proliferan como una masa de
filamentos ramificados, entrelazados (hifas) conocido como micelio. Las formas
miceliales se llaman mohos, y los que no forman micelio y son unicelulares levaduras.
El estudio de los Hongos se realiza a nivel macroscópico y microscópico.
El estudio macroscópico se realiza a partir del cultivo puro, describiéndose al
detalle sus características más importantes: Aspecto, Superficie, Color, Difusión del
pigmento en el medio y velocidad de crecimiento.
En el estudio microscópico se realiza; un examen directo con Azul de Lactofenol
y/o utilizando al método de la cinta adhesiva; y la técnica de microcultivo para estudiar
las estructuras de reproducción de los hongos.
II. OBJETIVOS:
III. MATERIALES:
IV. PROCEDIMIENTO:
EXAMENT DIRECTO:
2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de
los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de
conidias que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que
realmente interesa, los conidióforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el
definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su
interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se
seccionarán con un bisturí.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede
amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se
formen burbujas entre los dos vidrios.
AISLAMIENTO DE MOHOS.
De una muestra de moho de pan o de una fruta, con la ayuda del asa de siembra
coger un micelio y sembrar en puntura sobre la superficie de un agar para cultivo
de hongos.
Incubar a 25 ºC por 72 horas a 7 días.
TÉCNICAS DE MICROCULTIVOS:
Microcultivo en Lámina.-
Siembra:
Con el bisturí cortar un trozo de ASG de 0.5 x 0.5 cm. y depositarlo
sobre una lámina porta objeto.
Con el asa de siembra en ángulo recto recoger una pequeña porción del
cultivo de hongos y depositarlo en el centro de uno de los lados del
Montaje:
Con ayuda de una pinza, levantar la laminilla y depositarla sobre una
lámina porta objeto donde previamente se ha colocado una gota del
colorante (azul de lactofenol), quitar el exceso de colorante con papel
filtro (o papel higiénico) y sellar la lámina con esmalte de uñas.
Eliminar cuidadosamente el trozo de agar de la lámina portaobjeto con
ayuda de un bisturí, o asa de siembra; depositar una gota de azul de
lactofenol sobre la lámina portaobjeto, cubrir con la laminilla, eliminar
el exceso de colorante y sellar con esmalte de uñas.
V. CUESTIONARIO:
BIBLIOGRAFÍA
Paginas Web: