Diagnóstico molecular de patologías

hematológicas
Clase 10: Diagnóstico Molecular II

En biología molecular hay 3 procesos o partes importantes que definen en sí lo que vamos a
realizar:
- Extracción
- Preparación de los reactivos
- Identificación
En el laboratorio de biología molecular estas áreas deberían estar delimitadas, ya que, se debe
tener mucho cuidado con la contaminación. Al ser técnicas sensibles, cualquier error en el
procedimiento puede errar los resultados, los cuales, se aprecian al final y conllevan a la
repetición de la técnica. Como buenas prácticas se debe respetar la limpieza de campanas para
evitar la contaminación.
Muestras
- Las muestras utilizadas para hematología son sangre, plasma y médula ósea.
- Se puede hacer extracción desde líquidos estériles como LCR, Líquido pleural, sinovial.
- Líquidos de lavado gástrico, orina, deposición. Esta última no es muy buena para trabajar
porque se concentran virus y bacterias. Es una de las muestras más complejas para
trabajar, ya que, acarrea muchas fibras, glucosa, etc. Siendo todos éstos, inhibidores de
una reacción de PCR.
- Hisopados y aspirados nasofaringeos. Cada día se hacen más paneles de virus
respiratorios y se hacen por biología molecular.
- Lavados bronquio-alveolares y expectoración se utilizan para el estudio de tuberculosis
- Extracción de huesos (más complejo), cartilagos
- Muestras de ganglios, o de cualquier tipo de tejido, biopsias (dependiendo de la técnica
pueden estar fijados o embebidos en parafina)
Tipos de extracción
- Manual  Silica, incubación a alta velocidad
- Automatizadas  Técnicas con utilización de perlas magnéticas
Muestras para hematología y biología molecular
- Es importante la toma de muestra para las determinaciones hematológicas por biología
molecular, ya que, hay anticoagulantes que inhiben la reacción
- La heparina es conocida como un inhibidor de las reacciones por biología molecular
- Para cualquier técnica se van a utilizar tubos con EDTA y en el caso que no hubiese se
podría realizar con tubos con citrato
- Se debe tener en consideración la estabilidad de cada técnica y lo que se quiera detectar,
por ejemplo, la mutación del factor V de leiden es una mutación super estable se puede
tomar un tubo con EDTA el viernes y no pasa nada si la determinación se hace el día
 lunes, distinto es si llega una MO o SP para estudio de LMC para la detección del
cromosoma Philadelfia porque para la determinación de esto se utiliza el RNA, y todo lo
que sea para RNA se degrada mucho más rápido que lo que es DNA.
- Las estabilidades siempre van a depender del fabricante, en los insertos van a ir las
indicaciones de duración de los tubos, si una vez extraida la muestra se puede congelar
a -20, -70, o si la muestra se debe mantener en refrigeración. Todo esto va a depender
del fabricante.
- A veces lo que llega es el tubo rojo de vidrio, que es donde se toma la muestra de LCR y
estos ya vienen con EDTA.
Extracción
- Manual
Silica  Corresponden a tubos que vienen con sílica, y la base es la adsorción y absorción según
la polaridad de las sales que se ponen en la reacción. Entonces los ácidos nucleicos de por sí
tienen carga (-) y de naturalmente vienen cubierto con una molecula de H2O. Por lo tanto,
producto de las sales se va a crear un entorno hidrofóbico que va a hacer que el DNA se una a
la membrana de silica de las columnas, mientras tanto todo el resto se eluye. Es importante que
la elución se haga en un buffer que tenga baja salinidad o lo más común es eluir con H2O
- Automatizada
MagNA Pure LC  Es un equipo bastante amigable para hacer extracciones y se demora
alrededor de 30 minutos. Se pueden realizar 8 muestras en paralelo.
(*) Hay equipos más grandes que permiten realizar la extracción de 48 muestras en paralelo y
se demora 40 min.
(*) Mientras más complejas las muestras, estás van a requerir mayor tratamiento previo.
Lo primero que se hace es una lisis y una disrupción de la célula, después se agregan las perlas
magnéticas, de manera que las perlas se mezclen con lo que este presente en la muestra. Luego
las perlas suben con el material enganchado; las perlas van a ir agarradas a un imán con lo que
se quiere y luego se procede a lavar el resto, la idea de esto es realizar la purificación.
Preparación de reactivos
- Lo importante siempre es que los protocolos se cumplan
- Siempre deben estar los primers, dNTP, la polimerasa, cofactores (Mg2) y el buffer
Proceso resumido
- Ácidos nucleicos que se obtuvieron tras la extracción
- Preparación de la master mix que consiste en mezclar los reactivos
- Termocicladores
- Cuando se habla de equipos abiertos quiere decir que se trabaja con reactivos de distinta
marca.
Estudios hematológicos que se pueden realizar por biología molecular
- Mutaciones del factor V y protrombina
- JAK2 mutación puntual que se encuentra en distintos tipos de patología
- Hemocromatosis
 - Leucemias  Promielocitica y la traslocación (15;17), y el gen de fusión PML/RARa.
Traslocación 9;11 y la 9;22.
Leucemias
Entre las leucemias agudas tenemos la leucemia promielocitica aguda (M3). El 10% de los casos
se presenta en pacientes jóvenes. Se produce una traslocación recíproca entre el gen PML y el
gen RARa. Entre los cromosomas 15 y 17. En el cromosoma 15 se interrumpe el gen PML y en
el cromosoma 17 hay un quiebre en el gen RARa que corresponde al receptor del ácido retinoico.
La sintesis de PML/RARa se da en todos los casos de leucemia promielocitica, en cambio, la del
ácido retinoico se da en el 70-80% de los casos. Esto es importante, porque si se quiere detectar
algo en general, se busca encontrar lo que siempre se va a expresar.
El gen PML esta presente en los cuerpos nucleares, los cuales, son importantes en el control del
crecimiento celular, por lo tanto, cuando hay un quiebre en estos se produce una proliferación
descontrolada de la célula.
En la leucemia promielocitica aguda, destaca la detección de un hibrido PML/RARa y es
importante hacer la detección por biología molecular porque permite tener una sensibilidad mayor
y se puede detectar una enfermedad mínima residual, lo cual, en pacientes con leucemias es
muy importante. En enfermedad mínima residual el paciente esta casi controlado, puede seguir
con sus controles más espaciados en el tiempo y además tiene implicancia en la toma de
medicamentos.
PML tiene 3 puntos importantes
- Bcr1  70% de las leucemias
- Bcrd  23% de las leucemias
- Bcr2  En el resto de los casos y puede estar entre 6-7%
Detección por biología molecular
Extracción del material genético y una vez que extraido, una de las formas de amplificación es
por curva del melting. Siempre va a haber una curva de control para así saber en qué punto se
encuentra lo que se está midiendo, de manera de poder interpolarlo. La temperatura de melting
tiene relación con la fluorescencia que se detecta, las bases nitrogenadas van a llegar a un punto
con el alza de temperatura y ahí se va a poder determinar la temperatura de melting, de manera
de que se pueda diferenciar entre las otras temperaturas, la base nitrogenada presente.
Características técnicas
- Es una técnica de corta duración, se demora aprox. 1 hora.
- Se recomienda siempre usar un gen de referencia que sea representativo, lo cual, es
importante para saber si se tiene muestra, para saber si la muestra no está inhibida o
para indicar otras cosas como la cantidad del gen que se está expresando
- En la leucemia promielocitica y en la LMC (Bcr/abl), es importante usar genes que sean
representativos en cuanto al volumen versus lo que se quiera detectar. Por ejemplo, años
atrás se utilizaban genes de referencia como G6PD, pero la expresión de ésta en las
células es mucho mayor comparado con el gel abl, que corresponde a un gen endógeno
que tiene una relación bastante similar con Bcr. Entonces, esto permite hace una
 cuantificación significativa y real, vesus el gen que se va a expresar 6 veces por célula
con uno que se expresa 1 vez por célula.
- Las curvas lineales dependiendo de la marca, fabricante. Se genera una curva estándar
según los reactivos que se están utilizando. Los rangos a determinar van a depender de
la sensibilidad de la técnica que se este utilizando.
- Los resultados en aprox. 1 hora para leucemias son resultados bastante rápidos.
- Son importantes las técnicas de biología molecular porque permiten ver si el paciente
entró en remisión de la enfermedad y para monitorear la enfermedad mínima residual
Acción de los medicamentos  M3
- En general, lo que hacen los medicamentos es bloquear algún sitio de la reacción para
evitar la proliferación celular, en este caso, lo que hace es reprimir la proliferación del
RARa.
Síndromes mieloproliferativos
- PV
- Trombocitosis esencial
- Mielofibrosis primaria
- LMC
Mutación JAK2
- En el 2005, se identificó la mutación JAK2, en donde, se produce un reemplazo en la
proteína que codifica para una ser fenilalanina por una valina en la posición 617. (JAK2
V617F).
- En el 95% de los pacientes con PV se puede encontrar la mutación y en la mitad de los
casos de trombocitosis esencial o en la mielofibrosis primaria.
- JAK2 es importante porque casi todas las PV lo presentan y se puede detectar en la mitad
de los otros casos. Por lo tanto, detectar esta mutación es importante tanto para el
diagnóstico como para el seguimiento de la patología.
Métodos para la detección de JAK2
- Hay distintas técnicas que permiten la detección de JAK2, en este caso, hay un “paper”
de unos autores que hicieron la técnica en Argentina, la cual, corresponde a una técnica
nueva que recibe el nombre de High resolution Melting (HRM)
- Consiste en una técnica que ocupa la tecnología de detectar una curva de Melting pero
con algunas variaciones, por ejemplo, se dice que requiere de una PCR de alta eficiencia,
en donde se requiere de un software, las curvas de fusión se generan a partir de la
emisión de fluorescencia, en donde, los intercalantes de DNA se ponen entremedio y con
el aumento de la temperatura se va a detectar lo que se quiera detectar.
- Mediante High Resolution Melting (HRM) se pueden detectar variaciones más especificas
que por una curva de Melting normal, ejemplo, detectar PMF de una única base.
- La sensibilidad de esta técnica llega alrededor del 95%
Mutaciones del factor V de Leiden y de protrombina
- Se asocian a un mayor riesgo de trombosis venosa (más común) y arterial (menor %).
- Las mutaciones del factor II (protrombina) y Factor V de Leiden se producen por un
cambio bases de un G por un A.
 - Estas mutaciones son las que detectan la mayoría de los kits
- Estas mutaciones están presentes en el 2 – 5% de la población general (el diagnóstico
tiene que ver si la mutación es homo o heterocigota)
- Mutaciones en ell factor II y V representan factores de riesgo que son independientes.
Hay una persona que puede tener la mutación de protrombina pero no necesariamente
la del factor V de Leiden.
- Ejemplo: Persona normal que va a expresar los alelos, y no por presentar una
amplificación va a significar que tenga la mutación. Heterocigoto se va a detectar la
mutación en una curva y en la otra también (en este caso son factor V y II, por eso hay 2
curvas). Esta técnica se puede aplicar para la determinación de las 2 mutaciones.
LMC
- El cromosoma Philadelfia es lo más estudiado en esta patología, en donde, ya en el 1845
se habían descrito los primeros casos de la presencia de este cromosoma
- 1960 ya se estudia una clara asociación entre el cromosoma Philadelfia y la LMC
- 1973 se establece que el cromosoma Philadelfia correspone al resultado de esta
patología, en donde, se produce una traslocación reciproca entre el cromosoma 9 y 22
- 1983 se descubren los genes involucrados en esta traslocación recíproca y se propone
que lo que puede llegar a provocar esta traslocación es desregular la actividad tirosin
kinasa de la célula
- 1985 mediante citogenética se empiezan a cuantificar la metafases que presentan
cromosoma Philadelfia positivo
- 1990 se descubre la proteína P210, la cual, se produce producto de esta traslocación, sin
embargo, también hay otras proteínas que se generan P190 y la P230
- 1992 llegaron a la conclusión de si que esta traslocación desregula la actividad tirosin
kinasa, quizás se podría utilizar inhibidores para ver la actividad y ese fue el píe para el
desarrollo de los fármacos de hoy en día
- 2001 comenzaron los estudios clínicos en pacientes con imatinib que originalmente se
llamó ZTI571 que es un inhibidor de la actividad tirocin kinasa como tal y bloquea el sitio
de fosforilación
- 2007 hubo un desarrollo de cómo se podía cuantificar el cromosoma positivo, si se podía
hacer por PCR cualitativa o cuantitativa.
- En la mayoría de los casos la etiología es desconocida, y solo un 5% de los pacientes
con LMC se asocian a causas conocidas como las radiaciones ionizantes o agentes
químicos como el benzol o los solventes, etc.
- La organización internacional de la LMC establece que la incidencia de la presentación
de la patología es de 2 cada 100 mil habitantes, es inusual en niños. Y el cromosoma
Philadelfia de puede presentar en algunas leucemias linfáticas agudas, por lo tanto,
cromosoma Philadelfia no es igual a LMC, lo que sí es que es más representativo en la
enfermedad.
- La edad de presentación es de los 50-60 años
- El 90% de los casos se diagnostica en estadios temprano de la enfermedad, que
corresponde a la fase crónica como tal de la leucemia. La fase crónica puede durar de
meses a años. En la fase acelerada los blastos ya comienzan a salir a SP y en la fase
blastica se puede encontrar > 30% de los blastos en SP y por lo tanto, corresponde a la
fase más grave
Diagnóstico LMC
- El paciente llega al médico por cefalea, baja de peso inexplicable, sangramientos
inusulaes, anemia, dolor en el hipocondrio derecho, hepatomegalia.
- En el laboratorio clínico se parte por un chequeo normal que incluye un hemograma como
examen de base y si las sospechas son demasiadas se pasa a punción lumbar, se
realizan estudios citogenéticos, FISH. En citogenética normal se pueden observar los
núcleos que están en metafase, se puede observar la estructura cromosomica, lo cual,
es muy útil para el diagnóstico.
- El estudio citogenético se puede realizar mediante muestras de sangre o muestras de
MO, al igual que el FISH
- La citometría de flujo es importante porque se utilizan paneles de leucemia para el
diagnóstico
- RT-PCR para la detección  Al usar RNAm la estabilidad de la muestra es mucho menor,
ya que, el RNA se degrada muy fácilmente. Las muestras no pasan de los 3 días
refrigeradas. Esto es super importante porque al ser una técnica cuantitativa, con el pasar
de los días se va a ir perdiendo material genético.
- Sospecha clínica se da en pacientes que tienen leucocitosis permanente sin ninguna
causa determinada.
- El primer acercamiento puede ser mediante citogenética, % de basófilos y blastos (si el
paciente tiene blastos circulantes). Aquí la sensibilidad va a ser limitada porque va a
determinar 1 célula normal por cada 20 células.
Laboratorio de DM
- Abl codifica 2 proteínas que tiene función tirosin kinasa, el gen abl lo que hace es inhibir
el crecimiento celular. El bcr codifica para una forma principal y se pueden encontrar 3
puntos de quiebre en este gen, el rol de bcr está en la trasducción de señales. La fusión
bcr/abl genera un proteína de 210 kd que tiene una función carcinogénica.
- La metodología por excelencia para la determinación de RNA es la técnica de RT-PCR
- La extracción es diferente, ya que, el RNA se purifica de una forma distinta. Se debe tener
cuidado de no degradar el RNA presente en la célula.
- La técnica se puede realizar en sangre como en MO
- Primero se realiza un RT-PCR y luego la PCR
- En cuanto, a la cuantificación del transcrito se debe realizar una relación con el % del gen
bcr/abl involucrado en la reacción.
- Se debe hacer la curva de calibración (siempre) para saber el punto en el cual se va a
encontrar la muestra.
- Cuantificación absoluta en donde se termina la PCR y se tienen las curvas que están en
Log.
- Se pueden utilizar distintas metodologías para detectar lo mismo en biología molecularr
- Por ejemplo, en cuanto a la detección del gen bcr/abl, este ha sido detectado en un nivel
de 3,051 en escala internacional
Tratamiento de LMC
- Comenzó con la utilización de interferón alfa, sin embargo, éste tenía muchos efectos
adversos
- Trasplante de MO es acotado a algunos pacientes (pacientes menores a 55 años)
- Lo más usado es quimioterapia y los inhibidores de la tirosin kinasa que van a evitar la
proliferación de la célula
- Cada vez hay más productos en el mercado que van enfocados a lo mismo, porque hay
pacientes que desarrollan una resistente al medicamento o hay pacientes que tienen
mutaciones precisamente en el sitio de acción del medicamento interrumpiendo su acción.
- (*) La proliferación de bcr/abl activa señales de trasducción y lo que va a hacer el
medicamento es bloquear la señalización, es decir, inhibe la unión con el sustrato. Al
inhibir la fosforilación no se tiene producción de ATP, por lo tanto, toda la cascada de
señalización termina en una apoptosis celular.
Monitoreo de LMC
- El monitoreo es importante debido a las etapas en las que se va a encontrar al paciente
- El monitoreo se puede expresar mediante resultados en escala internacional o por
reducción logaritmica
- La disminución de bcr/abl puede ser en 1 log, 2 log, 3, 4, 5 log. Las técnicas moleculares
lo van a detectar en toda la escala, y se supone que mientras más cercana a la detección
de la escala, más especifico va a ser porque va a detectar una menor cantidad circulando,
pero lo importante es que lo va a detectar igual. Por lo cual, los kits que detectan entre 4
a 5 log, corresponden a kits más sensibles.
- Según el número de células con cromosoma Philadelfia que se tengan y que tengan un
10% en relación a las células, se dice que se está en una respuesta hematológica
completa, con una respuesta citogenética completa, con una respuesta molecular mayor
o en una respuesta molecular completa, y ya en vía de remisión de la enfermedad.
Niveles de respuesta molecular
- 1 log = 10% de bcr/abl y que corresponde a una respuesta molecular nula
- 4 – 5 log  Corresponde a una respuesta molecular mayor.
Indicaciones para la realización de una PCR en tiempo real en pacientes con LMC
- Puede ser en el momento del diagnóstico, antes del inicio de la terapia para saber el
escenario en el que se encuentra el paciente
- Cada 3 meses luego de iniciado el tratamiento
- En caso de respuesta molecular mayor cada 3 meses primero, luego cada 3 a 6 meses,
de manera de ir monitoreando al paciente, en cuanto, a la disminución de los niveles o si
hay alguna recaida.
- En niveles aumentados de bcr/abl cada 1 a 3 meses; se refiere a las recaidas de los
pacientes
Aumento significativo
- Se define como un aumento de más de 5 veces el valor previo o se define como el medio
log de aumento
 - Ejemplo 1: Paciente en el último control tiene 0,5 y ahora tiene 2, esto no es significativo,
pero si el mismo paciente tiene 0,5 y luego 3, este valor si es significativo
- Ejemplo 2: Paciente en el último control tiene 0,001 y sube a 0,005, aquí se produjo un
aumento de 50 veces. En este caso el resultado se está expresando en log.
- Si un paciente sigue con los aumentos, se debe revisar la presencia de otras mutaciones,
en general, mediante secuenciación para ver si se requiere de otro inhibidor para el
tratamiento.
Detección de secuencias del gen BCR-ABL mediante RT-PCR en pacientes con
leucemia

- El cromosoma Philadelphia descrito por Nowell y Hungerford en 19601, es la anormalidad

citogenética más común observada en leucemias. Esta anormalidad cromosómica es
originada por una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 t(9;22)(q34;q11)2.
- En el cromososma 22 se encuentra la región BCR (breakpoint cluster region),
denominada también gen BCR, en el cual se puede distinguir la región mayor (M-bcr)
entre los exones 12 y 16 (originalmente descritos como exones b1-b5), la región menor
(m-bcr) ubicada entre los exones e2’ y e2 y la micro región (µ-bcr) ubicada en el exon
193-5.
- Cuando una parte del gen ABL (Abelson) localizado en el cromosoma 9, es transferida e
insertada dentro del gen BCR se origina el gen de fusión BCR-ABL. Los puntos de ruptura
más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones: 1(e1), 12(b2), 13(b3) y 19(e19) y
el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exon 2(a2), generando
los reordenamientos e1a2, b2a2 o b3a2 y el e19a2. Los productos de estos
reordenamientos corresponden a proteínas de fusión de 190 kd (p190BCR-ABL), de 210 kd
(p210BCR-ABL) y de 230 kd (p230BCR-ABL), asociadas principalmente a leucemia linfoblástica
aguda (LLA), leucemia mieloide crónica (LMC) y LMC neutrófila respectivamente4,6-9.
- Normalmente el gen ABL codifica una proteína de 145 kd, con actividad tirosinaquinasa
que juega un rol crítico en el control y proliferación celular. Además se le ha asociado un
rol en la respuesta celular al estrés genotóxico. En cambio las proteínas generadas del
gen de fusión BCR-ABL tienen actividad tirosinaquinasa aumentada, lo que favorece la
proliferación neoplásica de las células hematopoyéticas a nivel de células primitivas
pluripotenciales, tanto en la LMC como en la LLA10-12. Recientemente se ha introducido
como tratamiento en la LMC, la droga Gleevec (STI 571) que actúa precisamente
inhibiendo la actividad de la tirosinaquinasa, con la cual se ha logrado respuestas clínicas
en un alto porcentaje de pacientes con LMC, especialmente en la fase crónica o en la
fase acelerada13,14.
- El gen de fusión BCR-ABL está presente en más del 95% de las LMC y su detección tiene
importancia diagnóstica6,15,16. Se ha visto que se negativiza el gen de fusión BCR-ABL
con terapias prolongadas de Interferón Alfa16 y la detección de este gen post-trasplante
alogénico de médula ósea, es considerado un predictor independiente de recaída15,18,19.
En pacientes con LLA se ha detectado en el 3-5% de los niños y en el 20-30% de los
adultos6,7,16,20,21. Su presencia es un factor de mal pronóstico y de riesgo independiente;
presentando los pacientes una remisión de corta duración, por lo que se recomienda
terapias más agresivas y/o considerar el trasplante de médula ósea18,20,21,23,24. En la LMA
se ha detectado el gen de fusión BCR-ABL en el 2% de los casos y sobre el 30% en la
leucemia bifenotípica, siendo en ambas también un factor de mal pronóstico16,25-27.
- Durante varias décadas la detección y estudio de anormalidades citogenéticas se ha
realizado mediante el análisis o mapeo cromosómico. Actualmente técnicas de biología
molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido
 identificar más de 50 translocaciones cromosómicas, muchas de las cuales han
demostrado ser específicas para distintos subtipos de leucemias. Una de las técnicas
más usadas, es la PCR con transcripción reversa (RT-PCR), mediante la cual a partir de
secuencias del ARN mensajero es posible detectar transcriptos de fusión del gen BCR-
ABL e identificar diferentes reordenamientos según el punto de ruptura dentro del gen
BCR con una mayor sensibilidad y especificidad que con el estudio citogenético15,28,29. De
este modo, el uso de la técnica de RT-PCR entrega mayor información para el diagnóstico
y pronóstico de las leucemias, como también es de gran utilidad en la detección de la
enfermedad residual mínima (ERM) durante la remisión clínica15,20,23,29.
- Aun cuando la técnica de RT-PCR está disponible en nuestro país, no existe información
sobre la detección del gen de fusión BCR-ABL mediante esta técnica en pacientes con
leucemia; sólo existen trabajos donde se ha utilizado citogenética y Southern Blot para la
detección del cromosoma Philadelphia y reordenamientos del gen BCR,
respectivamente30,31.
- Dada la escasa información existente en nuestro medio y considerando que en la IX
región el diagnóstico de los pacientes con leucemia no cuenta con el estudio citogénetico
ni molecular, nos propusimos detectar transcriptos de fusión que codifican las proteínas
p210BCR-ABL y p190BCR-ABL, mediante RT-PCR, en pacientes con leucemia mieloide crónica
y pacientes con leucemia aguda.