FOSFOENOL CARBOXINASA MITOCRONDRIAL 2

REGULACIÓN Y ADAPTACIÓN METABÓLICA QUE PERMITE EL CRECIMIENTO TUMORAL INDEPENDIENTE DE GLUCOSA

RESUMEN

Las células cancerosas se adaptan metabólicamente para proliferarse bajo limitación de nutrientes. Aquí se utiliza una
combinación del estudio transcripcional- metabolómica y análisis de red para identificar rutas metabólicas que
admiten la proliferación de células tumorales independiente de glucosa. Encontramos que la carencia de glucosa
estimula un reordenamiento del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y los primeros pasos de la gluconeogénesis para
promover la proliferación celular independiente de glucosa. La limitación de glucosa promovió la producción de
fosfoenolpiruvato (PEP) por una elevación de glutamina y mediante la acción de la Fosfoenol piruvato carboxinasa
mitocondrial 2 (PCK2). Bajo estas condiciones, un derivado de glutamina, La PEP(ácido fosfoenol pirúvico) se usó para
alimentar las vías biosintéticas normalmente sostenidas por glucosa, incluyendo la biosíntesis de serina y purina. Se
requirió la expresión de PCK2 para mantener la proliferación de células tumorales bajo glucemia limitada en
condiciones in vitro y crecimiento tumoral in vivo. La expresión elevada de PCK2 se observa en varios tipos de tumores
humanos y en tejido tumoral de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC). Nuestros resultados se basan
en definir un papel para PCK2 en el metabolismo de las células , reprogramación que promueve la proliferación celular
independiente de glucosa y resistencia al estrés metabólico en tumores humanos.

Introducción

Uno de los fenotipos metabólicos primarios observados en células transformadas es un aumento en la glucólisis
aeróbica (el '' efecto Warburg ''), que está marcado por un aumento en la captación de glucosa y producción de lactato.
La glucosa se usa para generar ATP a través de la glucólisis o fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), mientras
que los productos glucolíticos intermedios también funcionan como sustratos clave para la biosíntesis
macromolecular, como suministro de carbono para la síntesis de aminoácidos no esenciales (NEAAs), y como
intermedios del metabolismo de un carbono, nucleótidos, y lípidos.

Otro nutriente clave para la proliferación de células cancerosas es el NEAA glutamina, las células proliferativas se
mantienen en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) utilizando glutamina como un sustrato anapleurótico para generar
-cetoglutarato mitocondrial (-KG) y posteriores intermedios biosintéticos. La glutamina permite que el ciclo del
ácido tricarboxílico (TCA) funcione como una fuente de combustible para la producción de ATP y como centro
biosintético. Gran parte de nuestra comprensión del metabolismo de las células tumorales se basa en los programas
metabólicos comprometidos por las células cancerosas in vitro, donde la disponibilidad de nutrientes es excesiva. Sin
embargo, las concentraciones de glucosa en tumores pueden ser limitantes, de 3 a 10 veces más bajo que en tejidos
no transformados, debido a una combinación de vascularización reducida del tumor y altas tasas de consumo de
glucosa por las células cancerosas. Por lo tanto, las células tumorales deben representar estrategias para crecer y
sobrevivir en ambientes metabólicamente desfavorables.

Bajo condiciones limitadas de glucosa , las células son capaces de participar en la fosforilación oxidativa (OXPHOS),
para lograr una mayor capacidad de proliferación. La glutamina puede compensar parcialmente la glucosa para que
mantenga la función del TCA en condiciones de estrés metabólico. La acetilcoenzima A (CoA) se puede generar de la
glutamina a través de la carboxilación reductora de -KG (-cetoglutarato mitocondrial) en condiciones de hipoxia o
función mitocondrial reducida. De manera similar la función del ciclo del ácido tricarboxilico TCA se mantiene en
células privadas de glucosa a través de la producción de piruvato derivado de glutamina, que puede convertirse en
acetil-CoA y oxidarse en la mitocondria. Sin embargo la eficiencia del ciclo del ácido tricarboxilico y de la fosforilación
oxidativa no puede explicar completamente la proliferación celular bajo limitación de glucosa porque los compuestos
intermedios glucolíticos todavía se requieren para generar los precursores biosintéticos esenciales para la división
celular. Aquí utilizamos perfiles metabólicos y transcripcionales para caracterizar las vías del crecimiento celular
tumoral independiente de la glucosa. Usando este análisis de nivel de sistemas, identificamos alteraciones en
metabolismo de la glutamina y los primeros pasos de la gluconeogénesis como adaptaciones metabólicas clave para
que las células tumorales proliferen bajo condiciones de baja glucosa. Aquí describimos un papel para el
fosfoenolpiruvato mitocrondrial (PEP) y la carboxiquinasa (PEPCK-M o PCK2) en la mediación de la adaptación de
células tumorales a la limitación de glucosa, que facilita el crecimiento tumoral in vivo.

RESULTADOS

La integración de datos basada en la red de nodos metabólicos revela diferencias en las células tumorales adaptados
a proliferación independiente de glucosa

Para tener una idea de cómo se puede mantener la proliferación celular en condiciones escasas de glucosa,
examinamos la proliferación de las líneas celulares de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) A549 y H1299, que
son capaces de proliferar en medio carente de glucosa pero no de glutamina (Figura 1A).

Realizamos un nivel de sistemas de análisis de metabolitos intracelulares aislados de células A549 cultivadas durante
48 horas en ausencia de glucosa. La abundancia relativa de metabolitos en células A549 muertas de glucosa se
muestra en la Figura S1. El análisis de enriquecimiento del conjunto de metabolitos (MSEA) de estos datos reveló el
enriquecimiento en metabolitos implicados en la degradación de aminoácidos (ciclos de amoníaco, ciclo de la urea),
el ciclo de TCA, el metabolismo del glutamato y la gluconeogénesis (Figura 1B).

análisis de enriquecimiento para vías metabólicas reguladas diferencialmente inducidas por la privación de glucosa. Las células A549 se cultivaron
en presencia o ausencia de glucosa durante 48 horas antes de que se determinara la abundancia de metabolitos mediante GC o LC-MS (véase el
perfil completo de metabolitos en la figura S1).

A continuación, integramos la secuenciación de ARN (ARN-seq) basada en los perfiles metabólicos para construir un
análisis basado en la red de posibles flujos metabólicos. Para rastrear todas las posibles transformaciones metabólicas
de los átomos marcados, construimos una red metabólica donde los nodos individuales son átomos de carbono
individuales conectados por los bordes (líneas de conexión) correspondientes a las reacciones químicas (totalizando
alrededor de 30,000 bordes). A partir de esto, identificamos una subred basada en la conectividad y los cambios en la
abundancia del metabolito y la expresión del gen de enzimas metabólicas en condiciones de privación de glucosa
(Figura 1C).
Análisis de la red metabólica integrada para células A549 cultivadas en presencia (Glc +) o ausencia (Glc \ alpha) de glucosa durante 48 horas. La dirección y la
magnitud del cambio de veces en la expresión de la enzima o la abundancia de metabolitos entre las condiciones se indica en una escala de color rojo (enriquecido
en Glc \ beta) a verde (enriquecido en Glc +). Las enzimas están representadas por bordes (líneas de conexión entre metabolitos), con el color del borde que indica
el cambio de pliegue y el grosor que refleja la importancia de la expresión diferencial. Los nodos redondos representan metabolitos, con la abundancia diferencial
de cada metabolito indicada por el tamaño del nodo. Las principales características de la privación de glucosa identificadas por el análisis de red se destacan por
títulos en negrita y sombreado de fondo

A partir de este análisis basado en redes, identificamos cinco módulos metabólicos principales regulados
diferencialmente en células A549 sometidas a proliferación independiente de glucosa: glucólisis, el ciclo de
TCA, metabolismo de glutamato / prolina, metabolismo de inositol y metabolismo de serina (Figura 1C). Los
nódulos para la glucólisis y la producción de lactato se redujeron significativamente, como se esperaba, en
células A549 cultivadas en condiciones libres de glucosa. Por el contrario, los genes implicados en el
metabolismo de inositol y prolina se regularon positivamente bajo la extracción de glucosa, mientras que la
concentración intracelular de varios aminoácidos (serina, aspartato, asparagina, triptófano y glicina) también
se elevó. MSEA (análisis de enriquecimiento del conjunto de metabolitos) reveló el enriquecimiento en
metabolitos implicados en el metabolismo del glutamato y la gluconeogénesis (Figura 1B). Esto es digno de
mención porque la glutamina es un sustrato gluconeogénico conocido. Hay una mayor transaminación de
glutamato a -KG (a través de ASNS (asparagina sitetasa) y BCAT1(Transaminasa de aminoácidos de
cadena ramificada), que es consistente con la dependencia creciente de glutamina de las células A549. La
red también destacó una regulación al alza significativa en la conversión de oxaloacetato (OAA) a aspartato
(a través de GOT1(aspartato aminotransferasa citoplasmática)) y PEP (a través de la enzima gluconeogénica
PCK2). Finalmente, los niveles aumentados de serina y glicina se combinaron con la regulación positiva
transcripcional de la fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), una enzima que dirige los intermediarios
glucolíticos hacia la ruta de la biosíntesis de la serina. Tomados en conjunto, estos datos sugieren un papel
activo de la glutamina como fuente de carbono y nitrógeno para el metabolismo de aminoácidos, que puede
lograrse a través del transporte de malatoaspartato y los primeros pasos de la gluconeogénesis en
condiciones de baja glucosa.

La glutamina mantiene el metabolismo del ciclo de TCA y los niveles de la PEP intermedia glicolítica en
condiciones sin glucosa
Nuestro análisis de red metabólica transcripcional indicó niveles aumentados de metabolismo de glutamina
en células A549 que proliferan en ausencia de glucosa. Para caracterizar cómo se metaboliza la glutamina
en condiciones libres de glucosa, se cultivaron células A549 en presencia de 13C-glutamina uniformemente
marcada (U- [13C] -Q). El metabolismo convencional de U- [13C] -glutamina en células tumorales se ilustra en
la Figura 2A.

Modelo de anapleurosis dependiente de glutamina en el ciclo de TCA. U-

[13C] -Q alimenta la anaplerosis del ciclo de TCA a través de a-KG a OAA a
través de succinato, fumarato y malato. El metabolismo oxidativo de la
glutamina produce citrato m + 4, mientras que la carboxilación reductiva
de la glutamina da como resultado el citrato m + 5. Gln, glutamina; Ac-CoA,
acetil-CoA

Similares 13C patrones de etiquetado se observaron en

glutamato y en el ciclo TCA intermedios (a-KG, succinato,
fumarato y malato) en condiciones libres de glucosa y repleto
de glucosa (Figura 2B), lo que indica que la glutamina sigue
siendo utilizado como un sustrato anapleurótico para el ciclo
de TCA cuando la glucosa es limitada

Proporción de glutamato y a-KG que contiene cinco carbonos 13C (m + 5) y la proporción de succinato, fumarato, malato y
aspartato que contiene cuatro carbonos 13C (m + 4) en células A549 cultivadas durante 12 horas en presencia (+) o ausencia (-)
de glucosa sin marcar. Las células se cultivaron con U- [13C] -Q durante las últimas 6 horas.

Los niveles de glutamato, succinato y aspartato derivados de 13C-glutamina aumentaron bajo condiciones
de extracción de glucosa, mientras que los niveles de muchos de los metabolitos del ciclo de TCA
disminuyeron bajo la extracción de glucosa (Figura S2A), consistente con el análisis de red en la Figura 1C.
La producción de citrato a partir de glutamina se alteró notablemente en células A549 bajo extracción de
glucosa. Observamos un aumento significativo en la proporción del conjunto de citrato marcado de U- [13C]
-glutamina, como se muestra por la gran disminución de citrato sin marcar en condiciones sin glucosa
(Figura 2C). El aumento en el etiquetado de citrato de U- [13C] -glutamina se debió a aumentos tanto en la
carboxilación reductora de a-KG (m + 5 citrato) como en la aparición de una molécula de citrato
completamente marcada (m + 6 citrato) (Figura 2C).
 Isotopólogos de masas del conjunto de citratos en células A549 cultivadas como en (B)

Los niveles de citrato m + 6 fueron insignificantes en células A549 cultivadas en presencia de glucosa, pero
aún no habían alcanzado el nivel de establididad después de 6 horas de marcado con U- [13C] -glutamina
en condiciones sin glucosa (Figura 2D)

Contribución de los isotopólogos de masa de citrato (m + 4, m + 5 ym + 6) al conjunto de citrato total en células A549. Las células
se preincubaron en presencia o ausencia de glucosa durante 6 horas antes de la incubación con U- [13C] -Q (tiempo 0). Los
extractos celulares se cosecharon en los momentos mostrados

La formación de citrato m + 6 puede ocurrir cuando se usa U- [13C] -glutamina para generar tanto OAA como acetil-
CoA, requiriéndose esta última la formación de piruvato m + 3 a partir de 13C-glutamina (figura S2B). Se ha demostrado
previamente que la descarboxilación del malato derivado de glutamina (m + 4) puede generar piruvato m + 3 a través
de la actividad de la enzima málica. Alternativamente, PEPCK puede generar PEP (m + 3) de OAA, seguido de la
conversión de PEP a piruvato por piruvato quinasa (PK). Encontramos que, aunque la abundancia total de piruvato era
menor en células A549 que crecían en condiciones sin glucosa, la mayoría de piruvato (m + 3) en estas células se
derivaba de 13C-glutamina (Figura 2E).

E: Arriba: abundancia relativa (Rel) y contribución de U- [13C] -Q a piruvato en células A549

cultivadas como en (B). Abajo: proporción del conjunto de piruvato marcado por U- [13C] -Q
a lo largo del tiempo en células A549 cultivadas como en (D).

F: Abundancia relativa y proporción del conjunto de PEP marcada de U- [13C] -Q a lo largo del
tiempo en células A549 cultivadas como en (E).
Además, observamos un aumento significativo en la PEP derivada de U- [13C] -glutamina específicamente en células
A549 que crecen en condiciones libres de glucosa (Figura 2F).
 Número de células x103

biosíntesis de proteínas
reciclaje de amoníaco
ciclo del ácido cítrico
ciclo de la urea
transcripción rna
metabolismo del glutamato
gluconeogénesis
tiempo señalización de insulina
ciclo de glucosa-alanina
Número de células x103

metabolismo alanina
señalización de prostaciclina
cadena de transporte de electrones mitocondrial
transporte malato-aspartato
Valor P
metabolismo de glicina, serina y treonina

Doblar el enriquecimiento
tiempo

Figura 1. La integración de datos basada en la red revela nódulos metabólicos distintos en células tumorales adaptadas
a la proliferación independiente de la glucosa. (A) Proliferación de células A549 y H1299 durante 96 horas en medio repleto
de nutrientes (+ Glc, + Q), medio sin glucosa (Glc, + Q) o medio sin glutamina (+ Glc, Q). Los datos se representan como media
± SEM para réplicas biológicas (n = 5).
(B) Metabolito establece el análisis de enriquecimiento para las vías metabólicas reguladas diferencialmente inducidas por la
privación de glucosa. Las células A549 se cultivaron en presencia o ausencia de glucosa durante 48 horas antes de determinar
la abundancia de metabolitos por GC o LC-MS (ver el perfil completo de metabolitos en la Figura S1).
(C) Análisis de redes metabólicas integradas para células A549 cultivadas en presencia (Glc +) o ausencia (Glc) de glucosa
durante 48 horas. La dirección y la magnitud del cambio doble en la expresión de la enzima o la abundancia de metabolitos
entre las condiciones se indica en una escala de color rojo (enriquecido en Glc) a verde (enriquecido en Glc +).
Las enzimas están representadas por bordes (líneas de conexión entre metabolitos), con el color del borde que indica el cambio
de pliegue y el grosor que refleja la importancia de la expresión diferencial. Los nodos redondos representan metabolitos, con
la abundancia diferencial de cada metabolito indicada por el tamaño del nodo.
Las principales características de la privación de glucosa identificadas por el análisis de la red se resaltan mediante títulos en
negrita y sombreado de fondo.

De acuerdo con el análisis de red (Figura 1C), la producción de
lactato se redujo significativamente en las células A549 privadas
de glucosa (Figura S2C), y la U- [13C] -glutamina no se usó para
su síntesis. Por el contrario, la glutamina se utilizó en la síntesis
de piruvato y PEP (Figura S2D). Las células H1299 mostraron
aumentos similares en m+6 citrato, m+3 piruvato y m+3 PEP
derivados de 13C-glutamina específicamente cuando crecen en
condiciones de extracción de glucosa (figura 2G). La presencia
de piruvato m + 3 y citrato m + 6 sugiere que estas células están
experimentando ciclos de piruvato (Yang et al., 2014), usando
glutamina para mantener la función de TCA cuando la glucosa no
está disponible.
Se requiere PCK2 para la producción de PEP derivada de
glutamina
Figura 2. Redirecciones de retirada de glucosa.
Metabolismo de glutamina para mantener el TCA Ciclo y
para la producción de PEP.
(A) Modelo de anapleurosis dependiente de glutamina en
el ciclo de TCA. U- [13C] -Q alimenta la anaplerosis del ciclo
de TCA a través de a-KG a OAA a través de succinato,
fumarato y malato. El metabolismo oxidativo de la
glutamina rinde citrato m+4, mientras que carboxilación
reductiva de la glutamina da como resultado citrato m +
5. Gln, glutamina; Ac-CoA, acetil-CoA.
(B) Proporción de glutamato y a-KG que contiene cinco 13C
carbonos (m + 5) y la proporción de succinato, fumarato,
malato y aspartato que contienen cuatro 13C carbonos
(m+4) en células A549 cultivadas durante 12 horas en
presencia (+) o ausencia (-) de glucosa sin marcar. Las
células se cultivaron con U- [13C] -Q durante las últimas 6
horas.
(C) Isotopólogos de masas del conjunto de citratos en
A549 células cultivadas como en (B).
(D) Contribución de los isotopólogos de masa de citrato
(m+4, m+5 y m+6) al conjunto de citrato total en células
A549. Las células se pre incubaron en presencia o
ausencia de glucosa durante 6 horas antes de la
incubación con U-[13C] -Q (tiempo 0). Los extractos
celulares se cosecharon en los puntos de tiempo que se
muestran.
(E y F) Contribución de la glutamina al piruvato y PEP en
células A549 privadas de glucosa.
(E) Arriba: abundancia relativa (Rel) y contribución de U-
[13C] -Q para piruvato en células A549 cultivadas como en
(B). Abajo: proporción del grupo de piruvatos etiquetados
por U- [13C] -Q a lo largo del tiempo en células A549
cultivadas como en (D).
(F) Abundancia relativa y proporción del PEP grupo
etiquetado de U- [13C] -Q a lo largo del tiempo en células
A549 cultivado como en (E).
(G) Proporción del isotopólogo de masa m+6 de citrato
(arriba) y abundancia relativa de U- [13C] –Q incorporado
en piruvato (centro) y PEP (abajo) en células H1299
cultivadas como en (B).
(B-G) Los datos se representan como media ± SEM de tres
culturas independientes.
Ver también la figura S2.
Nuestros resultados de RNA-seq indicaron que la expresión de la
forma mitocondrial de PEPCK (PCK2) se incrementó en células
A549 tras la extracción de glucosa. Sin embargo, no se
detectaron lecturas de secuencia para PCK1, la forma citosólica
de PEPCK (datos no mostrados). De acuerdo con esto, el
silenciamiento de PCK1 en células A549 no afectó los niveles
totales de proteína PEPCK (Figura S3A). Estos datos sugieren
que PCK2 es la única isoforma PEPCK expresada en células
A549, de acuerdo con hallazgos recientes (Leithner et al., 2014).
A continuación, investigamos el papel de PCK2 en el
metabolismo de glutamina silenciando la actividad de PCK2 en
células A549 y H1299 usando ARNi (Figura 3A) o ácido 3-
mercaptopicolínico (MPA), un inhibidor específico de PEPCK
(Urbina et al., 1990). La conversión de U- [13C] -glutamina a PEP
(Figura 3B) se estimuló por la privación de glucosa como antes,
pero se redujo notablemente en células que expresan PCK2 en
horquilla corta ARN (ARNhc) o se tratan con MPA (Figura 3C). El
flujo de glutamina en PEP también se ablacionó en células A549
privadas de glucosa que expresan PCK2 shRNA (Figura S3B).
Este efecto pareció ser específico para la formación de PEP
porque la inhibición de PCK2 no afectó significativamente
Figura 3. Producción de PEP a partir de glutamina en células muertas de glucosa es dependiente de
PCK2
(A) Inmunotransferencia para PCK2 y actina sobre lisados de células A549 y H1299 que expresan control o
PCK2 shRNA. PCK1 (1) y PCK2 (2) representan dos diferentes shRNAs dirigidos a PCK2.
(B) Esquema para el ciclo de piruvato mediado por PCK2 propuesto. Totalmente etiquetado OAA (m+4) está
hecho de U- [13C] -Q. La actividad PCK2 produce PEP totalmente etiquetada (m+3) de OAA. El piruvato se puede
hacer usando PEP a través de la actividad de piruvato cinasa, y esto puede reingresar al ciclo de TCA como acetil-
CoA.
(C) Abundancia relativa de la incorporación de U- [13C] -Q en PEP en células A549 y H1299 que expresan shRNA
de control o PCK2 o tras el tratamiento con PEPCK inhibidor de MPA. Las células se cultivaron en presencia o
ausencia de glucosa durante 12 horas, con U- [13C] -Q añadido durante las últimas 6 horas de incubación. A la
derecha: se usaron células A549 tratado con DMSO (vehículo) o MPA durante la incubación de 12 horas. Con,
control.
(D) Abundancia relativa de la incorporación de U- [13C] -Q en piruvato en células A549 y H1299 que expresan
shRNA de control o PCK2 o tras el tratamiento con PCK2 inhibidor de MPA. Las células se incubaron como en
(C).
(C y D) Los datos se representan como media ± SEM de tres culturas independientes.
Ver también la Figura S3.

TCA ciclo anaplerosis de glutamina en células A549 independientemente de

disponibilidad de glucosa (Figura S3C).

Para abordar si PCK2 contribuyó al ciclo de piruvato en célilas A549 que crecen
bajo limitación de glucosa (Figura 3B), se midió la formación de m + 3 piruvato
(Figura 3D) y m + 6 citrato (Figura S3D) en células que expresan PCK2 shRNA.
Celulas A549 expresando PCK2 shRNA exhibido etiquetado reducido de
piruvato (m+3, Figura 3D) y citrato (m + 6, Figura S3D) de U- [13C] -glutamina
específicamente en condiciones de extracción de glucosa.Del mismo modo, el
tratamiento con MPA redujo la producción de piruvato m + 3 de U- [13C] -
glutamina en células A549 que crecen en ausencia de glucosa (Figura 3D).

La PEP derivada de glutamina se usa como un intermediario biosintético

bajo condiciones de baja glucosa

La reducción de m+3 piruvato y m+6 citrato sobre la inhibición de PCK2 (Figura

3D, Figura S3D) fue puesta en comparación con la reducción en m+3 PEP
observada en células NSCLC ex-presionando PCK2 shRNA (Figura 3C), lo que
sugiere que la glutamina-derivada de la PEP puede formarse en un fin distinto al
ciclo del piruvato. Nuestro análisis indicó un aumento específico en la vía de
biosíntesis de serina en células A549 privadas de glucosa (Figura 1C). Por lo
tanto, evaluamos 13C enriquecido en serina y glicina en células A549 cultivadas
con U-TCl-glutamina sin glucosa. El 13C derivado del carbón es detectado es la
serina (Figura 4A, Figura S4A) y glicina (Figura 4B; Figura S4A) de células A549
sometidas a proliferación independiente de glucosa. Las células H1299
demostraron un cambio similar hacia la glutamina dependiente de serina y glicina
en biosíntesis bajo condiciones libres de glucosa, lo que indica que la glutamina
puede sustituir la glucosa como fuente de carbono para la biosíntesis de serina
(Figuras 4C y 4D; Figura S4B) la contribución de 13C glutamina derivada de
carbono a los grupos de serina y glicina de células A549 privadas de glucosa las
células aumentaron exponencialmente con el tiempo y lo hicieron no alcanzar el
etiquetado de estado estacionario durante el período de etiquetado de 6 horas
(Figures 4A y 4B). De hecho, la contribución de C-glutamina- alcanzó reservas
derivadas de carbono a serina celular y glicina
40% y 20%, respectivamente, cuando las células A549 carecen de glucosa
fueron marcados continuamente con C-glutamina durante 48 horas (Figuras
S4C y S4D).

A continuación, abordamos si PCK2 podría regular la producción de serina y

glicina derivadas de 13C-glutamina en células tumorales. El silenciamiento de
PCK2 en células A549 eliminó la capacidad de la glucosa que carecía de células
para producir serina (Figura 4E) y glicina (Figura 4F) de U- [13C] -glutamina.
Flujo de 13C-glutamina en la serina la vía de biosíntesis fue ablacionada
completamente en glucose starved células que expresan PCK2 shRNA (Figuras
S4E y S4F). El tratamiento de las células A549 con MPA también bloqueó la
glutamina dependiente producción de serina (Figura 4G).

Nuestra hipótesis es que se exporta PEP generada a partir de OAA de las

mitocondrias (Passarella et al.2003; Satrústeguiet al. , 2007), convertido por la
enolasa en 3-fosfoglicerato (3-PG), y luego dirigido a la vía de biosíntesis de
serina por la actividad de PHGDH (Figura 4H). Para probar esto, medimos 13C
enriquecido en serina (del trazador U-13Cl-glutamina) en Células A549 con
enolasa o expresión de PHGDH silenciadas usando pequeños RNAs
interferentes (siRNAS) (Figura S4G). Aunque los niveles de serina 13C-marcada
de U-13c-glutamina aumentó significativamente sobre la privación de glucosa en
las células control, las

células transfectadas con siRNAs que apuntan a ENO1 o PHGDH muestran una
marcado reducción en biosíntesis de glutamina dependiente de serina(Figura
S4H)

La serina y la glicina derivadas de glucosa contribuyen a la síntesis de

nucleótidos de purina necesarios para la proliferación celular (Lunt y Vander
Heiden. 2011). Por lo tanto, investigamos si la glutamina podría sustituir a la
glucosa en el suministro de carbono para la biosíntesis de purinas mediante el
enriquecimiento de medición de U-13C-glutamina en el nucleótido de purina
ATP. Detectamos un aumento significativo en la abundancia de derivados de
glutamina ATP en células cultivadas en condiciones sin glucosa, que era
bloqueado en células tratadas con MPA (Figura 4) porción de ATP (12%) se
marcó a partir de U-13C] -glutamina, con la mayoría del etiquetado en m + 3
(Figura 4J).

Se requiere PCK2 para la célula cancerosa independiente de la glucosa

Proliferación y tumor Crecimiento in vivo

Silenciamiento de PCK2 por siRNA (Figura 5A) o shRNA (Figura S5B) bloqueó
la capacidad de las células A549 y H1299 para proliferar en el ausencia de
glucosa. De acuerdo con el requerimiento de enolasa y PHGDH para mediar en
serina biosina dependiente de glutamina por biosintesis (Figura S4H), la
reducción de estas enzimas también redujo la proliferación de células A549 en
condiciones sin glucosa (Figure 5B). La viabilidad celular no se vio afectada por
PCK2, ENO1 o PHGDH independientemente de la disponibilidad de glucosa
(Figura S5C).

Para evaluar el impacto de PCK2 en el crecimiento tumoral in vivo, A549 y

células H1299 que expresan control o específicos de PCK2 shRNAs (Figuras
S5D y S5F) se inyectaron en los flancos de ratones desnudos, y el crecimiento
tumoral se evaluó durante 65 días (Figures 5Cy 5E). La mayoría de los tumores
que expresan control, los shRNA crecieron constantemente con el tiempo. Sin
embargo, tumores que expresan PCK2 shRNA no pudo establecerse y crecer
sustancialmente in vivo (Figuras 5C y 5E). Esto se reflejó en el peso reducido de
tumores que expresan PCK2 shRNA al final del experimento (Figuras 5D y 5F).
La expresión de la proteína PCK2 fue prontamente en tumores de control de
etapa final, mientras que la supresión de los niveles de proteína PCK2 se
mantuvieron en tumores derivados de células que expresa PCK2 shRNA
(Figuras S5E y S5G).

Los factores inducibles por hipoxia HIF-1α y EPAS1 Regulación de la

expresión de PCK2 bajo limitación de glucosa

A continuación, examinamos los mecanismos de regulación de PCK2 por

disponibilidad de glucosa Expresión de ambos PCK2 I mRNA (Figura 6
condiciones de limitación de glucosa. La actividad de PCK2 es también depende
de la producción de guanosina mitocondrial trifosfato (mtGTP). mtGTP es
generado por SUCLG2 forma de succinil-CoA sintetasa (SCS) en el ciclo de TCA
(Starket al., 2009). Encontramos que la expresión del SUCLG2 transcripción
(Figura 6C) y su metabolito producto succinato (Figura S2A) se elevó en células
A549 privadas de glucosa. Notablemente, la expresión de SUCLA2, la forma
generadora de ATP de SCS, no se vio afectada por la disponibilidad de glucosa
Figura 6C). De acuerdo con el requisito de la expresión de SUCLG2 para la
actividad de PCK2, el silenciamiento de SUCLG2 (Figura S6A) condujo a una
reducción en la proliferación independiente de glucosa de las células A549
(Figure 6D), similar a lo que se observó cuando se silenció PCK2

(Figura 5A). El silenciamiento de SUCLA2 no afectó a la glucosa-independiente

de proliferación colgante de células A549 (Figura 6D; Figura S6A). Los factores
de transcripción inducibles por hipoxia HIF-1a y EPAS1 /HIF-2a puede promover
la expresión de PCK2 en tumor mutante K-ras células (Chun et al., 2010). Para
probar el papel de HIF-1a y EPAS1 en control dependiente de glucosa de la
expresión de PCK2 en nuestro sistema, estos genes fueron silenciados en
células A549 (Figura S6B). Glucosa- dependiente a la simulación de PCK2
mRNA no se alteró en células A549 que expresan siRNA HIF-1α se reducen
parcialmente

Derribo de EPAS1 (figura S6C). Sin embargo, silenciando ambos HIF-1α y

EPAS1 condujo a una reducción de ~ 25% en la expresión de ARNm de PCK2.
Del mismo modo, el silenciamiento de HlF-1a y EPAS1 impidió la completa
inducción de proteína PCK2 por extracción de glucosa (Figura 6E). Finalmente,
evaluamos el impacto de la expresión de HIF durante la proliferación
independiente de glucosa. Derribo de HIF-1α y EPAS1 solo tuvo efectos mínimos
sobre la proliferación celular, mientras que silenciar ambos, deterioró la
 capacidad de las células A549 para proliferar sin condiciones sin glucosa (Figura
6F).

Figura 4. Serina, glicina y el ATP se obtienen a partir de la glutamina tras la retirada de la glucosa en una forma dependiente de PCK2

(A-D) U- [13C] -Q incorporación en serina y glicina en células privadas de glucosa. Las células A549 (A y B) o H1299 (C y D) se cultivaron durante 12 horas
en presencia o ausencia de glucosa, seguido de cultivo con U- [13C] -Q durante las últimas 6 horas de la incubación de 12 horas. Se muestra la proporción
de serina (A) o glicina (B)

por U- [13C] -Q en células A549 a lo largo del tiempo. También se muestran los niveles de serina derivada de U [13C] -Q (C) y glicina (D) en células H1299
privadas de glucosa.

(E-G) Abundancia relativa de la incorporación de U- [13C] -Q en serina (E y G) y glicina (F) en células A549 que expresan control y PCK2 shRNA (E y F) o
después del tratamiento con MPA (G). Las células se cultivaron en presencia o ausencia de glucosa durante 12 horas y luego se cultivaron con U- [13C] Q
durante las últimas 6 horas de 12 horas de incubación.

(G) Las células A549 se trataron con DMSO (vehículo) o MPA durante la incubación de 12 horas.

(H) Esquema del marcado de serina mediado por PCK2 de OAA. Totalmente etiquetado OAA (m + 4) está hecho de U- [13C] -Q. La actividad PCK2 produce
PEP totalmente etiquetada (m + 3) de OAA. La serina y la glicina se pueden hacer usando PEP a través de las actividades de enolasa y PHGDH. Eno, enolasa.

(I) Abundancia de 13C-ATP en células A549 cultivadas con U- [13C] -Q durante 48 horas en presencia o ausencia de glucosa. Las células se trataron con
DMSO (vehículo) o MPA a lo largo de la incubación de 48 horas.

(J) isotopólogos de masa del conjunto de ATP en células A549 cultivadas como en (I).

(A-G e I-J) Los datos se representan como media ± SEM de tres cultivos independientes.
Figura 5. Las células cancerosas requieren PCK2 para mantener la proliferación independiente de la
glucosa y el crecimiento tumoral in vivo.

(A) Proliferación de células A549 y H1299 en medio sin glucosa durante 96 horas después de la
transfección con control o PCK2 siRNA.
(B) Proliferación de células A549 en medios sin glucosa más de 96 h después de la transfección
con el indicado siRNAs.

(A y B) Cada punto de datos en (A) y (B) representa el número promedio de células de cinco pozos
en un pozo de 384 plato.

(C – F) Se inyectaron células A549 y H1299 en el flanco de ratones desnudos. Crecimiento de

tumores derivados de células A549 que expresan control (n = 6) o shRNA dirigido a PCK2 (n = 7) (C)
y de H1299 células que expresan cualquier control (n = 7) o shRNA, la orientación de PCK2 (n = 7)
(D) se muestra durante 65 días. Los pesos tumorales al final del experimento son también
mostrados para las células A549 (D) y H1299 (F). Los datos se representan como media ± SEM. **
p <0.01, *** p <0.001.

La expresión del PCK2 es desregularizada en el c

A continuación investigamos la expresión de PCK2 en tumores humanos a través del análisis de los
conjuntos de datos de expresiones de una variedad de tipos de tumores en el “The Cancer Genoma
Atlas TCGA” (Atlas del genoma del Cáncer) (Figura 7A). La expresión de PCK2 mas alta se encontró en
la tiroides, vejiga, seno, riñón y el tejido canceroso de pulmón de células no pequeñas (Figura 7A). A
continuación nos preguntamos si se observó expresión elevada de PCK2 en subconjuntos de tumores
dentro de diferentes tipos de tumores. Consideramos la fracción relativa de tumores con un puntaje
de Z para PCK2> 2 (ilustrado por puntos atípicos en los gráficos de caja en la Figura 7A y resumidos en
el fondo). El PCK2 se sobreexpresó en 8,8% del carcinoma de las células escamosas de los (uno de los
principales subtipos de NSCLC) las muestras de los conjuntos de datos TCGA analizados fueron la
fracción más grande de todos los tipos de tumores examinados.

También evaluamos los niveles de proteína PCK2 en muestras tumorales aisladas de pacientes con
NSCLC humano. Ejemplos de expresión de la proteína PCK2 en tejido normal y tumoral de los pulmones
de siete pacientes con NSCLC se muestran en la Figura 7B, mientras que la Figura S7 presenta niveles
de proteína PCK2 en tejido normal y tumoral de cada uno de los 29 pacientes analizados. La
cuantificación de la expresión de proteína PCK2 en estas muestras de tumores primarias humanas de
cáncer de pulmón reveló un aumento significativo de los niveles de proteínas de PCK2 en 15 de 29
(52%) (En p <0.05, prueba de Kruskal-Wallis) en comparación con tejido normal compatible con el
paciente (Figura 7C) y comparado a una disminución en la expresión de PCK2 en solo el 10% de los
tumores (3 de 29, p <0,05). En conjunto, estos datos indican que la expresión de PCK2 está enriquecida
en varios tipos de tumores, incluido en NSCLC.

DISCUSIÓN

La glucosa es una importante fuente de carbón para la proliferación de células y es usada para generar
tanto ATP como precursores para la síntesis macromolecular (Lunt and Vander Heiden, 2011). Sin
embargo, se reduce la disponibilidad de glucosa combinado con la gran demanda de nutrientes por
las células cancerosas puede provocar estrés metabólico en los tumores. (Cantor y Sabatini, 2012;
Jones y Thompson, 2009). La evidencia indica que las células cancerosas y algunas células no malignas
pueden comprometer a la glucosa metabolismo independiente para mantener la proliferación celular
y la disponibilidad cuando la glucosa es limitada (Birsoy et al., 2014; Blagih et al., 2015; Glick et al.,
2014; Le et al., 2012; Pasto et al., 2014).La células tumorales son capaces de usar sustratos alternativos
para las necesidades biosintéticas y bioenergéticas, ganarían una supervivencia y ventajas
proliferativas en microambientes con recursos limitados. Usando un análisis a nivel de sistemas que
combina tanto transcripcional como el perfil de datos metabólicos, identificamos la enzima
gluconeogénica PCK2 como un regulador clave de la flexibilidad metabólica de las células tumorales.
Nosotros demostramos aquí que PCK2 media una derivación metabólica en respuesta a la privación de
glucosa que suministra carbono a partir de la glutamina, en lugar de glucosa, para generar
intermediarios de la vía glucolítica requerido para la biosíntesis y la proliferación celular. Nuestros
datos implican la reprogramación metabólica dependiente de PCK2 como un mecanismo para el
crecimiento de células tumorales independientes de glucosa. El metabolismo del ciclo TCA y OXPHOS
son esenciales para mantener la homeostasis energética en células privadas de glucosa. Esto es logrado
en parte por el ciclo de piruvato dependiente de glutamina a través de la actividad enzimática málica
(Guay et al., 2007). Nuestros datos indican que el ciclo de piruvato también puede ser mediado por
PCK2 en células tumorales privadas de glucosa, similares a las observadas en las células β pancreáticas
(Stark et al., 2009). Sin embargo, el silenciamiento de PCK2 en las células A549 con escasez de glucosa
solo afectan modestamente al ciclo del piruvato, lo que sugiere destinos alternativos para PEP en las
células tumorales. Encontramos que la producción de PEP dependiente de PCK2 también podría
proporcionar células tumorales que crecen en un ambiente bajo en glucosa con un suministro de
productos intermedios glucolíticos necesarios para mantener la proliferación celular. La biosíntesis de
serina es una vía metabólica clave para la proliferación celular, aportando carbono a muchos procesos
anabólicos, tales como biosíntesis de proteínas, glutatión, nucleótidos y fosfolípidos (Locasale, 2013;
Vander Heiden et al., 2011). Bajo condiciones de crecimiento estándar, ya sea serina exógena o serina
de novo generada a partir del intermediario glucolítico 3-PG puede ser utilizado para el crecimiento
anabólico (Chaneton et al., 2012; Labuschagne et al., 2014; Locasale et al., 2011). Aquí demostramos
que la glutamina puede sustituir a la glucosa en serina y la biosíntesis de glicina en células tumorales
con expresión elevada de PCK2. Curiosamente, a pesar de la disponibilidad de serina exógena y glicina,
aún se requería PHGDH para la proliferación de células tumorales bajo condiciones de baja glucosa, lo
que sugiere que el flujo a través de esta vía contribuye al crecimiento celular incluso cuando los
productos finales del camino son abundantes. La amplificación de PHGDH se observa en algunos
cánceres (Locasale et al., 2011; Possemato et al., 2011), que puede proporcionar flexibilidad
metabólica a los tumores al alimentar la biosíntesis de serina a partir de múltiples fuentes de carbono.
Nuestros resultados también indican que la glutamina puede usarse como fuente de carbono para la
biosíntesis de nucleótidos en condiciones de privación de glucosa. Dos carbonos en nucleótidos de
purina son derivados de la glicina, y se proporcionan dos unidades de un solo carbono por N10-formil-
tetrahidrofolato, que adquiere la mayor parte de sus unidades de carbono de la serina (Lunt y Vander
Heiden, 2011). Por lo tanto, la biosíntesis de serina de novo podría explicar la C-glutamina, patrones
de etiquetado que observamos en ATP. Otra posibilidad es que el gliceraldehído 3-fosfato derivado de
C-glutamina ingresa a la parte no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato para generar 5-fosforibosil -
pirofosfato (PRPP) para la biosíntesis de nucleótidos. No está claro si la glutamina es suficiente para
suministrar los intermedios glucolíticos para generar nucleótidos azúcares o si estos provienen de
otros nutrientes en células muertas de glucosa. El aumento del metabolismo de glutamina / glutamato
forma solo un nodo de la red de adaptación metabólica mediada por PCK2, sugiriendo que otros
sustratos pueden alimentar a la red para ayudar a suministrar productos intermedios biosintéticos.
Trabajo reciente sugiere que PCK2 puede mediar la conversión de lactato a PEP en células de cáncer
de pulmón (Leithner et al., 2014), aunque esto requiere un suministro de lactato del microambiente
tumoral porque se encuentra muy poco lactato en las células tumorales que experimentan privación
de glucosa. Otros sustratos anapleuróticos capaces de generar OAA podrían funcionar como sustratos
dependiente de PCK2 para la producción de PEP bajo condiciones de baja glucosa, como aminoácidos
de cadena ramificada (BCAA), que pueden ingresar al ciclo TCA a través del metabolismo de propionil-
CoA (Stark y Kibbey, 2014).
Figura 6. La expresión de PCK2 está regulada por disponibilidad de glucosa

(A) expresión relativa de ARNm de PCK2 como se determina por qPCR. A549 células fueron cultivadas
en la presencia o ausencia de glucosa durante 48 horas. Los niveles de transcripción se determinaron
en relación con los niveles de ARNm de ACTB y normalizado en relación con expresión en el tiempo 0.
Los datos se representan como media ± SEM.

(B) Inmunoblot para PCK2 y actina sobre lisados de células A549 y H1299 incubadas en presencia o
ausencia de glucosa durante 48 horas.

(C) Expresión relativa de ARNm medida por RNA-seq en células A549 cultivadas en presencia o ausencia
de glucosa durante 48 horas los datos relativos fueron expresados con la expresión de SUCLG2 en
células cultivadas bajo condiciones de glucosa completa. Los datos son la media ± SEM de tres culturas
independientes. * p <0.05.
(D) Proliferación de células A549 en medios sin glucosa más de 96 h después de la transfección con el
indicado siRNAs. Cada punto de datos representa el número promedio de células de cinco pozos en un
pozo de 384 placa (media ± SEM).

(E) Inmunoblot para PCK2 y actina sobre lisados de células A549 transfectadas con los ARNip indicados
y se trató con o sin glucosa durante 48 horas.

(F) Crecimiento de células A549 en medio sin glucosa más de 96 horas las células A549 se transfectaron
con el siRNAs indicados antes de la siembra para el crecimiento. Cada punto de los datos representa
el número promedio de células de cinco pocillos en una placa de 384 pocillos (media ± SEM).

Figura 7. La expresión de PCK2 aumenta en el cáncer humano

(A) Diagrama de caja de la distribución de los niveles de expresión de ARNm de PCK2 en relación con
el ACTB en los estudios de cáncer de TCGA. Los estudios fueron seleccionados para representar todo
el espectro

de niveles de expresión El diagrama de caja se recortó en el valor de expresión relativa de 0.05.

(B) Inmunoblot para PCK2 en tres muestras individuales de muestras de tejido normal y tumoral de
pacientes con CPCNP. Se utilizó F1-ATPasa como control para

carga de proteínas

(C) Cuantificación de inmunoblots para la expresión de PCK2 de tejidos normales y tumorales

emparejados por el paciente. Los pacientes (n = 29) se clasifican según el cambio porcentual en

Expresión de PCK2 en muestras tumorales en relación con tejido normal compatible con el paciente.
La significación estadística se determinó mediante una prueba de Kruskal-Wallis. * p <0.05.

Ver también la Figura S7.

aminoácidos de cadena ramificada (BCAA), que pueden ingresar al TCA ciclo a través del metabolismo
de propionil-CoA (Stark y Kibbey, 2014). Fructosa-1,6-bisfosfatasa, otra enzima involucrada en la
gluconeogénesis, puede promover la viabilidad de la metástasis células de cáncer de mama al
aumentar el metabolismo de glutamina y BCAA Chen et al., 2015). De hecho, aminoácidos de cadena
ramificada la transaminasa 1 (BCAT1) se regula significativamente en nuestro metabolismo la red,
como lo son los niveles de BCAA (leucina, valina y isoleucina). b-oxidación de lípidos puede
proporcionar otro carbono fuente de crecimiento biosintético bajo limitación de glucosa (Vacantiet al.,
2014).

PCK2 parece ser un gen regulado por glucosa porque ambos Los niveles de ARNm y proteína se inducen
significativamente con la glucosaretirada en las células tumorales. La actividad PCK2 también depende
de mtGTP,que es generado por la forma SUCLG2 de SCS en el mitocondrialmatriz (Stark et al., 2009).
Expresión de SUCLG2 yEl ARNm de PCK2 es estimulado por la extracción de glucosa, lo que sugiere
unaesfuerzo coordinado para mejorar la actividad de PCK2 bajo bajo nivel de glucosacondiciones
Nuestros datos indican que HIF-1a y EPAS1 / HIF-2ª actuar sinérgicamente para inducir la expresión de
PCK2 y facilitar la proliferación en condiciones sin glucosa. Aunque HIF-1a tiene estado implicado en
gluconeogénesis y regulación de PCK1expresión en el hígado (Choi et al., 2005; Tajima et al.,
2009),PCK1 no se expresó abundantemente en células NSCLC, ni tampoco HIF-1a solo requerido para
la expresión de PCK2, lo que sugiere un mayor papel destacado para EPAS1 / HIF-2a en la glucosa
dependiente control de PCK2. Por lo tanto, aunque los HIF desempeñan papeles prominentes en la
regulación metabólica durante la hipoxia (Mucaj et al., 2012),

El re-cableado dependiente de HIF del ciclo de TCA a través de PCK2 ayuda proporcionar a las células
tumorales flexibilidad metabólica adicional para crecimiento celular independiente de glucosa. Hasta
la fecha, se ha prestado poca atención a PEPCK en el contexto de cáncer. Aquí presentamos evidencia
de metabolismo mediado por PCK2 adaptación en células tumorales y expresión elevada de PCK2 en
humanos subconjuntos de tumores, incluido NSCLC. Nuestra hipótesis es quePCK2 podría proporcionar
una ventaja de crecimiento selectivo a las células tumorales creciendo en ambientes pobres en
nutrientes, lo que les permite usar PEP, suministrado por glutamina u otros sustratos anapleuróticos,
para apoyar el metabolismo del ciclo de TCA y los intermedios glucolíticos para la biosíntesis. En este
sentido, se dirige al metabolismo mediado por PCK2la adaptación puede ser una estrategia efectiva
para ciertos tipos de cáncer subtipos, particularmente NSCLC.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

CULTIVO DE CÉLULAS

Las líneas celulares A549 y H1299 se obtuvieron de la ATCC. Las células eran cultivado en medio
de crecimiento (DMEM [células A549] o medio RPMI [células H1299]) suplementado con 10%
de suero bovino fetal (FBS), penicilina, estreptomicina, glutamina y aminoácidos no esenciales
(para células H1299). Para la limitación de glucosaexperimentos, las células se cultivaron en
DMEM libre de glucosa y glutamina complementado con 10% de FBS dializado (Wisent) y
glutamina (2 mM) y glucosa (25 mM) agregada según sea necesario. La caída de PCK2 se logró
usando vectores lentivirales de shRNA de la colección de ARNh del Consorcio RNAi (TRC) (Los
números de identificación se enumeran en los Procedimientos experimentales suplementarios).
Lentiviral los sobrenadantes se generaron como se describió previamente (Huang et al., 2012).

Derrumbamiento transitorio de PCK2, ENO1, PHGDH, HIF1A, EPAS1, SUCLG2 y SUCLA2 se logró
utilizando SMARTpool ON-TARGETplus ARNsi reactivo (compuesto por cuatro siRNAs
individuales para cada objetivo) de GE Dharmacon. El inhibidor de PEPCK MPA se obtuvo de
Santa Cruz Biotechnology.

ENSAYOS DE VIABILIDAD Y PROLIFERACIÓN CELULAR

Las células se sembraron en placas de 384 pocillos (500 células / pocillo) en medio de
crecimiento como descrito previamente (Vincent et al., 2015). Después de 24 horas, el medio
de crecimiento se reemplazó por medio nuevo que contenía glucosa 25 o 0 mM. Las células eran
fijado con 4% de formaldehído, teñido con tinción de ADN Hoechst, y luego el el número de
células se determinó por recuento de núcleos. Las imágenes fueron tomadas usando un sistema
de imágenes de alto contenido Opereta y analizado usando Harmony high software de imágenes
y análisis de contenido (PerkinElmer). La viabilidad celular se determinó por exclusión de
colorante de viabilidad por citometría de flujo usando yoduro de propidio (PI). Las células se
analizaron usando un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter), y los datos se analizaron
usando el software FlowJo (TreeStar).

PERFILADO DE METABOLITOS POR GC-MS Y LC-MS

Los metabolitos celulares se extrajeron y se analizaron mediante cromatografía de gases

espectrometría de masas (GC-MS) o cromatografía líquida (LC) –MSutilizando los protocolos

descritos anteriormente (Dupuy et al., 2013; Faubert et al.,2014; McGuirk et al., 2013). Para GC-
MS, los extractos de metabolitos se derivaronutilizando N- (terc-butildimetilsilil) –N-
metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) comodescrito previamente (Faubert et al., 2013). Ácido D-
mirístico (750 ng / muestra) fue agregado como un estándar interno para los extractos de
metabolitos y metabolitos abundancia se expresó en relación con el estándar interno y
normalizado al número de celda. La cromatografía líquida se realizó utilizando un
ultraperformance 1290 Infinity Sistema LC (Agilent Technologies) equipado con un Scherzo 3
mm, columna de 3.03150 mmSM-C18 (Imtakt). LC-MS análisis se realizó en una masa Q-TOF de
precisión precisa Agilent 6540 de ultra alta definición (UHD) espectrómetro (Agilent). Para
experimentos de análisis de trazadores de isótopos estables (SITA),las células se cultivaron con
U- [13C] –glutamina (isótopos de Cambridge) para el indicado veces. La distribución de
isotopómeros en masa se determinó utilizando un algoritmo personalizado desarrollado en la
Universidad McGill (McGuirk et al., 2013).

ANÁLISIS RNA-SEQ E INTEGRACIÓN DE DATOS BASADOS EN RED

Para los experimentos de ARN-seq, las células A549 se cultivaron en presencia o ausencia

de glucosa (25 mM) durante 48 horas antes de la extracción del ARN. Síntesis de cDNA y
biblioteca la construcción se realizó como se describió anteriormente (Jha et al., 2015). Las
bibliotecas fueron secuenciadas en el Centro de Genómica Aplicada (SickKids, Toronto) usando
un HiSeq 2500 (Illumina) usando una secuencia de 50 3 25 pares de pares de pares. Para
construir la red metabólica integrada ilustrada en la Figura 1, A549 las células se cultivaron en
medio que contenía glucosa 25 o 0 mM durante 48 horas antes a extracción o análisis de ARN o
metabolito. Integración de metabolito y los conjuntos de datos de expresión de ARN se
realizaron como se describió previamente (Jhaet al., 2015). Detalles adicionales se proporcionan
en el Experimental Suplementario

Procedimientos.

INMUNOTRANSFERENCIA Y PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL

Los lisados de líneas celulares o tejido NSCLC se sometieron a SDS-PAGE y western

secante como se describió anteriormente (Vincent et al., 2011). Anticuerpos primarios

a PCK2 y actina, así como a la secundaria anti-conejo y anti-ratón conjugada con HRP

los anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaling Technology. Todo humano

Inmunotransferencia de lisado tisular de NSCLC se incubaron con fluorescencia etiquetada

anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-ratón y analizados y cuantificados

utilizando un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey Sa (LI-COR Biosciences). qPCR

se realizó como se describió anteriormente (Faubert et al., 2013). Secuencias de cebador

han sido descritos previamente (Faubert et al., 2013) o están listados

en la Tabla S1.

ENSAYOS DE XENOINJERTO TUMORAL

Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en McGill
Universidad. Células A549 y H1299 que expresan el control o el ARNh dirigido PCK2 se contaron
(2 millones de células / inyección), se resuspendieron en 50% de Matrigel / 50% de PBS (200 ml
/ inyección), e inyectado por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos (Charles River
Laboratories). La longitud del tumor (l) y el ancho (w) fueron medido cada 3-4 días con
calibradores, y se calculó el volumen del tumor (V)(V = 1/2 (lxw2)). Después de 65 días, los
ratones fueron sacrificados, y los tumores fueron disecados y pesados.

ANÁLISIS DE DATOS TCGA

Datos de TCGA para 35 estudios de tumores que contenían datos de expresión de ARNm

se accedió usando la R-interface cgdsr al cBio Cancer Genomics Portal (Cerami et al., 2012; Gao
et al., 2013). Para cada conjunto de datos, expresión de PCK2 relativo a ACTB se determinó para
cada muestra de paciente. Nueve estudios con diferentes tejidos del espectro completo de
expresión relativa de PCK2 fueron analizados.

PACIENTES CON NSCLC Y MUESTRAS DE TEJIDO

La recolección de muestras, los detalles de la cohorte y la extracción de muestras han sido

descrito previamente (Vincent et al., 2011, 2014). En resumen, tres muestras distintas de tejido
tumoral de pulmón y pulmón normal adyacente desde el margen de resección tomado,
congelado instantáneamente en nitrógeno líquido, y almacenado a 80 ° C hasta su posterior
análisis. Solo muestras de tumor NSCLC que comprenden al menos el 90% del tejido tumoral se
analizado. Los tejidos se homogeneizaron en tampón de lisis NP40 al 1% usando un
Polytronhomogeneizador para generar lisados tisulares para el análisis de SDS-PAGE

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Las estadísticas se determinaro n usando la prueba t de Student emparejada usando el software

Prism (GraphPad) a menos que se indique lo contrario. Los datos se calcularon como la media ±
SEMpara triplicados biológicos a menos que se indique lo contrario. Significancia estadística se
representa en cifras de la siguiente manera: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001,

**** p <0.0001.

NÚMEROS DE ACCESIÓN

El número de acceso para los datos de secuenciación en bruto y procesados informados en

este documento es GEO: GSE66556.

INFORMACIÓN SUPLEMENTARIA

La información suplementaria incluye siete figuras, una tabla y suplementos

Procedimientos experimentales y se pueden encontrar en este artículo en http: //

dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.08.013.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Weacknowledge M. Hetzel, J. Pawade, M. Sohail y L. Phillips para la colección

de tejido NSCLC. W. Reintsch brindó asistencia técnica, y S.

Huang proporcionó acceso a los shRNA. Este trabajo fue apoyado por subvenciones

del programa de capacitación McGill Integrated Cancer Research (a E.E.V.

P.P.C., y B.R.F.); el Gobierno de la Federación Rusa (a A.S.,

074-U01); los Fonds de recherche Sante'Que'bec (a T.G.); la confianza de Wellcome

Seeding Drug Discovery Award (a J.M.T); y CIHR (MOP-93799), el Terry

Fox Foundation, y Cancer Research Society (a R.G.J.).

Recibido: 23 de febrero de 2015

Revisado: 23 de junio de 2015

Aceptado: 17 de agosto de 2015

Publicado: 15 de octubre de 2015