Breve Reacción en Cadena de la Polimerasa Fragmento hibridación

reversa Line Probe ensayo para detectar y genotipo de un amplio

espectro de tipos del Virus del Papiloma Humano
Evaluación clínica y Seguimiento
Willem JG Melchers , * Judith M. J .S. Bakker , * Jinhua Wang , * Peter CM de Wilde , †Henk
Boonstra , ‡ Wim Quint GV , § y Antonius GJM Hanselaar †

Información sobre el autor ► notas Artículo ► licencia y derechos de información ►

Este artículo ha sido citado por otros artículos en PMC.

Abstracto
A nivel mundial, el cáncer cervical es el segundo cáncer más común que afecta a las
mujeres. Aunque los programas de cribado para identificar lesiones precursoras del cáncer
de cuello uterino se han reducido significativamente la mortalidad y la morbilidad de esta
enfermedad, 500.000 nuevos casos de cáncer invasivo del cuello uterino se diagnostican
cada año. 1epidemiológicos y moleculares estudios durante las últimas dos décadas han
demostrado de forma convincente que ciertos tipos de virus del papiloma humano (VPH)
son etiológicamente relacionado con el desarrollo de la mayoría de los casos de cáncer de
cuello uterino. 2-4 hasta la fecha, se han identificado más de 85 tipos de VPH de los tipos, de
los cuales se han encontrado 30 diferentes virus del papiloma humano para infectar la
mucosa genital. 5 Varios tipos de VPH, tales como VPH 16, 18, 31, 33, y 35 han sido
implicados en la carcinogénesis cervical, 6 mientras que otros tipos, tales como VPH 6 y 11,
se detectan con frecuencia en lesiones benignas tales como condilomas acuminados. Las
mujeres infectadas con VPH de alto riesgo se consideran en mayor riesgo para el desarrollo
de cáncer de cuello uterino que los que no están infectados con VPH o están infectados con
los tipos de VPH de bajo riesgo. 7,8 Varios estudios han demostrado la importancia que
podría tener el VPH las pruebas en el programa y la gestión de los pacientes con células
escamosas atípicas de significado indeterminado de detección de cáncer de cuello
uterino. 7,9-13 la incorporación de las pruebas del VPH en los programas de cribado podría
identificar a las mujeres en riesgo de desarrollar cáncer cervical invasivo. Por otra parte, la
ausencia de VPH de alto riesgo en el frotis cervical permitiría una gestión menos agresiva
de las mujeres con anormalidades citológicas leves o equívocos.

Reacción General cadena de la polimerasa (PCR) con una amplia especificidad de espectro
para HPV son ampliamente utilizados para la detección del virus en muestras clínicas. 9,14-
16
Sin embargo, mecanografía adicional por hibridación o de tipo específico ensayos de
PCR se requiere para identificar el VPH tipo individual. Esto es laborioso y requiere mucho
tiempo. Además, para muchos de los tipos de VPH recién descritos, cebadores específicos
no están disponibles. Por estas razones, es importante para proseguir el desarrollo de los
sistemas de genotipado aplicables para el cribado masivo de cepillados cervicales. En este
informe se describe la aplicación práctica de un ensayo de sonda de la línea de hibridación
inversa (VPH-LiPA), recientemente desarrollado para el genotipado de un amplio espectro
de tipos de VPH en un solo ensayo. 17 En combinación con una novela generales de ensayo
(SPF) de PCR, amplificando un fragmento de tan sólo 65 pb, esto SPF-VPH-LiPA permite
una detección altamente sensible y simultánea de los 16 tipos de VPH individuales en un
esquema de reacción individual. 18 raspados cervicales obtenidas de mujeres que fueron
remitidos al ginecólogo a causa de un resultado anormal de su frotis cervical fueron
analizados por SPF-HPV-LiPA para determinar su utilidad práctica en la detección e
identificación de HPV en un gran número de muestras clínicas.

Ir:

Materiales y métodos

Los pacientes

Raspaduras de cuello uterino se obtuvieron de 152 mujeres que participaron en el Programa

de Detección de Cáncer Cervical y que fueron remitidos por los médicos generales a los
ginecólogos para el examen colposcópico después de dos raspados cervicales sucesivas con
células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS) o un frotis con displasia
leve (L-SIL ), displasia moderada, displasia grave o carcinoma in situ (los últimos tres de
acuerdo con la clasificación de Bethesda como HSIL). La visita al ginecólogo se llevó a
cabo de 2 semanas a 3 meses después del último examen citológico.En referencia al
Departamento de Ginecología, durante el examen colposcópico, antes de la aplicación de la
solución / Lugol ácido acético, se tomaron dos raspados cervicales. Una corredera se
preparó para un diagnóstico citológico de rutina. El material residual del primer roce y todo
el material de la segunda raspadura se recogieron en solución de etanol Carbowax, se
centrifuga, y se incrustó en agar (Kerstens HMJ, Robben JCM, De Wilde PCM, Hanselaar
AGJM, presentado para su publicación). Los portaobjetos se clasifican
citomorfológicamente de acuerdo con el sistema de clasificación citológicas holandés
estándar y vinculados a la clasificación de Bethesda como se indica.

Para estudiar el valor predictivo de las infecciones por VPH para la progresión a corto y
largo plazo de las lesiones intraepiteliales, un protocolo para el seguimiento de los
pacientes se incluye en el diseño general del estudio. Debido a la alta tasa de regresión, la
política de gestión holandesa para mujeres con ASCUS, displasia leve (LSIL), y la displasia
moderada (HSIL) es mantener a estos pacientes bajo una estricta vigilancia de seguimiento
y no tratar a estas mujeres directamente para su trastorno de cuello uterino . En el presente
estudio, hemos sido capaces de examinar raspaduras citológicos sucesivos y realizar
análisis de repetición contra el VPH en un pequeño grupo de mujeres después de un
período de seguimiento de 3 meses. pruebas SPF-HPV-LiPA se realizaron de un modo
ciego sin un conocimiento de los resultados de examen citológico o pruebas anteriores
HPV.

Extracción de ADN a partir de las secciones de agar

Una sección de una sola célula de cada muestra de 3 m de espesor se puso en un tubo de
reacción y se incubó durante la noche a 56 ° C en 200 l de 10 mmol / L Tris-HCl con 1
mmol / L EDTA, 0,2% de Tween 20, y proteinasa K ( 0,3 mg / ml). Proteinasa K se
inactivó por 10 minutos de incubación a 100 ° C. La muestra se centrifugó durante 10
minutos a 11.000 rpm y 10 l se usó directamente para el análisis de PCR. Un ensayo en
blanco, el agua se procesó con cada lote de 10 muestras.

Amplificación por PCR de ADN de VPH

La amplificación de ADN de VPH de amplio espectro se realizó usando un fragmento de

PCR corto recientemente desarrollado (SPF-PCR). 18 Todas las pruebas de VPH se
realizaron cegados a los resultados citológicos y otros datos clínicos. Sistema SPF-PCR
amplifica un fragmento de 65 pb del marco de lectura abierto L1 permitiendo la detección
de al menos 43 tipos de VPH diferentes. 18 SPF-PCR se realizó en un volumen final de
reacción de 50 l que contenía 10 l de la muestra de ADN aislado, 10 mmol / L de Tris-HCl
(pH 9,0), 50 mmol / L KCl, 2,0 mmol / l MgCl 2 , 0,1% de Triton X-100, 0,01% de gelatina,
200 mmol / l de cada uno de trifosfato de desoxinucleósido, 15 pmol cada uno de los hacia
adelante y hacia atrás primers etiquetados con una biotina en el extremo 5 ', y 1,5 unidades
de AmpliTaq Gold (Perkin Elmer).La mezcla se cubrió con dos gotas de aceite mineral y se
incuba durante 9 minutos a 94 ° C seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 45
segundos a 45ºC, 45 segundos a 72 ° C, y una extensión final de 5 minutos a 72 ° C. Cada
experimento se realizó con los controles de PCR positivos y negativos separados. Un total
de 15 l de cada producto de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 3%
y se tiñó con bromuro de etidio. Para evitar la contaminación por productos de PCR, se
realizaron diferentes etapas tales como la preparación de muestras y la reacción de
amplificación en habitaciones separadas estrictamente.

El genotipado del VPH mediante hibridación inversa usando Line Probe Ensayo

Un poli (dT) de cola se añadió enzimáticamente para el extremo 3 'de cada uno de 16
oligonucleótidos específica para 16 tipos diferentes de VPH, a saber, VPH 6, 11, 16, 18, 31,
33, 35, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 56, y 58. las sondas de cola se aplicaron como líneas
horizontales a las tiras de membrana.Se aplicó un control de poli (dT) biotinilado para el
conjugado. El ensayo de genotipos de HPV-LiPA se realizó como se ha descrito
previamente. 17 En resumen, volúmenes iguales (10 l cada uno) de los productos
biotinilados de PCR y la solución de desnaturalización (400 mmol / L de NaOH, 10 mmol /
l de EDTA) se mezclaron en cubetas de prueba y se incubaron a temperatura ambiente
durante 5 minutos, después de lo cual 1 ml de la solución de hibridación precalentada (37 °
C) (3X SSC (1X SSC es 0,15 mol / L NaCl más citrato de sodio / L 0,015 mol), 0,1% de
dodecil sulfato de sodio) se añadió, seguido de la adición de una tira por canal. La
hibridación se realizó durante 1 hora a 50 ± 0,5 ° C en un baño de agua cerrado con la parte
posterior y hacia adelante a temblar. Las tiras se lavaron dos veces con 1 ml de solución de
lavado (3 x SSC, 0,1% de dodecil sulfato de sodio) a temperatura ambiente durante 20
segundos y una vez en 50 ° C durante 30 minutos. Después de este lavado rigurosas, las
tiras se lavaron dos veces con 1 ml de una solución de lavado estándar. 17 Las tiras se
incubaron en una plataforma giratoria con un conjugado de estreptavidina marcada con
fosfatasa alcalina diluida en una solución de conjugado estándar de 20 a 25 ° C durante 30
minutos. A continuación, las tiras se lavaron dos veces con 1 ml de solución de lavado y
una vez con tampón de sustrato estándar, y el desarrollo de color se inició mediante la
adición de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y nitroazul de tetrazolio a 1 ml de tampón de
sustrato. 17Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción de
color se detuvo por la aspiración del tampón de sustrato y la adición de agua
destilada. Después de secar, las tiras fueron interpretados visualmente utilizando una
cuadrícula.

Análisis de la secuencia

En 4 raspaduras sólo la línea de control de conjugado en el VPH-LiPA-tira de reacción

mostró que indica la presencia de ADN de VPH; sin embargo, no se observó reacción con
cualquiera de las sondas específicas 16 tipo de HPV.Para identificar el tipo de VPH
implicados los amplímeros SPF de PCR fueron clonados y secuenciados.

Los productos de PCR se ligaron en el vector pCR2.1 inmediatamente después de la

amplificación usando el TA Cloning Kit original (Invitrogen Corporation) y se purificaron
usando los sistemas de purificación de ADN Wizard Plus minipreparaciones (Promega) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de PCR se secuenciaron
utilizando el kit de secuenciación de ciclo Ampli (Perkin Elmer) y cebador directo M13
para el vector pCR2.1. Se encontró que todos cuatro muestras positivas para HPV 66.

Ir:

resultados

Correlación de Citología con la detección del VPH

Los resultados de examen citológico se correlacionó con los resultados de la detección de

ADN de VPH como muestran en la Tabla 1 ▶ . En 39 de las mujeres el frotis de
seguimiento fue negativo. Sin embargo, en el 38% de estos raspados negativos se detectó
ADN de VPH. ADN del VPH también se detectó en 24 de 47 (51%) raspaduras cervicales
reportados como ASCUS, en 21 de 27 (78%) raspaduras con displasia leve (LSIL), en 19
de 22 (86%) raspaduras con displasia moderada, y en 14 de 16 (88%) raspaduras con
displasia grave y carcinoma in situ . Un roce con carcinoma de células escamosas invasivo
fue positivo para el VPH 16.

Tabla 1.
Ocurrencia VPH cervical en raspaduras de mujeres en conjunto con la clasificación
citológica Resultados

Un solo frente Múltiples tipos de VPH

Los resultados de genotipado del VPH y la distribución de los tipos se resumen en la Tabla
1 ▶ . Un ejemplo de los resultados de ensayo de genotipificación de HPV-LiPA se muestra
en la Figura 1 ▶ . Como se observa en la Figura 1 ▶ , la interpretación es muy fácil y
múltiples infecciones pueden identificarse fácilmente. En 53 de raspaduras positivos de
VPH 94 (56%) se detectó un único tipo de HPV. Los VPH 6, 11, 16, 18, 31, 33 y
representaron el 75% de las infecciones simples, con el VPH 16 es el más común y
representa el 45% de todas las infecciones individuales.

Figura 1.
VPH genotipado de SPF amplımeros por línea de ensayo de sonda de HPV (VPH-
LiPA). La cuadrícula de la derecha indica las posiciones de diferentes sondas de
VPH. Control positivo indica la línea de control conjugado. El a31 sonda reacciona con los
productos después de la amplificación PCR ...

Un hallazgo notable fue la alta prevalencia de múltiples tipos de VPH en raspados

cervicales. Cuarenta y uno de 94 VPH cervical raspaduras positivos contenían dos o más
tipos de VPH, que representa el 44% de las raspaduras de HPV positivas (Tabla 1) ▶ . La
distribución de los tipos de HPV individuales dentro de las múltiples infecciones fue al azar
(análisis estadístico no se muestra) y cualquier combinación de los tipos de VPH se pudo
encontrar.Infección múltiple por VPH fue más frecuente en los frotis con diagnóstico de
LSIL. La relación de un solo frente a la infección por VPH en múltiple tipo, y frotis
normales ASCUS fue similar, 46:54 y 58:42, respectivamente. La relación en frotis con
LSIL fue 38:62, y se observó una relación inversa 69:31 en frotis con HSIL. Se detectaron
hasta seis tipos diferentes de HPV en una sola muestra. Infecciones dobles eran más común,
representando el 61% de las infecciones múltiples. Se detectaron infecciones con tres tipos
de VPH en el 24% de los raspones, cuatro tipos de VPH en un 7%, cinco tipos de VPH en
un 5%, y seis tipos de VPH en un 2% en las raspaduras.

Bajo riesgo frente a los tipos de VPH de alto riesgo

La distribución de los tipos de VPH de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 y 58) y
los tipos de VPH de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, y 44) en el raspaduras se muestra en la
Figura 2 ▶ . La prevalencia de los tipos de VPH de alto riesgo aumentaba con la gravedad
de la anormalidad frotis cervical. La relación de alto riesgo para los tipos de VPH de bajo
riesgo en exudado normales fue de 1,9: 1, en ASCUS 2,9: 1, en LSIL18.5: 1, y HSIL 28: 1.

Figura 2.
La correlación entre el diagnóstico citológico y la detección de los tipos de VPH de bajo y
alto riesgo.

El siete por ciento de todas las infecciones múltiples contenía los tipos de VPH de bajo
riesgo solamente, 37% contenían los tipos de VPH de alto riesgo solamente, y el 56%
contenía una mezcla de ambos tipos de VPH de bajo y alto riesgo. La relación de menor a
mayor a múltiples infecciones de bajo / alto riesgo de VPH en raspados normales fue de 1:
1: 6,3, en ASCUS 1: 1: 3,5, en LSIL 0: 1: 1,2, y en el SIL de alto grado 0: 1: 0,5.

Los resultados del seguimiento Citología y SPF-VPH-LiPA

Los resultados del segundo examen citológico y repetir el análisis del VPH en un grupo de
12 pacientes después de 3 meses de seguimiento se muestra en la Tabla 2 ▶ . Prueba SPF-
HPV-LiPA para detectar la presencia de HPV mostró una correlación completa con los
resultados obtenidos durante la primera toma de muestras. En 4 casos con diagnóstico de
ASCUS y negativos primer resultado la prueba de VPH, el seguimiento con la segunda
prueba del VPH también fue negativa. En uno de los casos de ASCUS, positivo para el
VPH 16, la prueba del VPH de seguimiento también fue positivo para el VPH 16 que indica
una infección persistente. El examen citológico reveló LSIL. En un caso de LSIL, positivo
para HPV 31, el segundo muestreo reveló la presencia de un tipo adicional, HPV 18, lo que
sugiere una exposición adicional.

Tabla 2.
SPF-VPH-LiPA Seguimiento

Ir:

Discusión

Los programas de cribado citológico, junto con la conciencia pública y clínica han
resultado en una notable disminución en la incidencia de cáncer de cuello uterino y la
mortalidad por esta enfermedad. 19-21 Sin embargo, el tratamiento excesivo sustancial de las
lesiones intraepiteliales no invasivos es la consecuencia de una intervención quirúrgica
precoz. 22, 23 está bien establecido que sólo el 1% de LSIL y aproximadamente el 12% de
HSIL progresar a cáncer cervical invasivo. Como no se han establecido los marcadores de
la progresión de las lesiones escamosas intraepiteliales, la identificación de los tipos de
VPH de alto riesgo en cepillados cervicales ayudaría a identificar a los pacientes con mayor
riesgo de desarrollo de cáncer de cuello uterino. En todo el mundo al menos el 99% de los
carcinomas cervicales son el ADN del VPH positivo. 2,18,24-26 Además de VPH 16 y 18, se
detectaron otros 13 tipos de VPH como un solo tipo de VPH en los carcinomas de cuello
uterino. Estos tipos de HPV han sido identificados como los VPH de alto riesgo. La
infección con alta o baja los tipos de VPH de riesgo no puede determinarse sobre la base
del examen citológico. 27-29 La importancia de VPH de alto riesgo en la patogénesis de la
neoplasia cervical sugiere que la detección de una infección con VPH de alto riesgo sería
útil en el manejo del paciente. 30 se ha tomado un gran esfuerzo para desarrollar ensayos de
detección y tipificación de HPV en las últimas dos décadas, lo que llevó al desarrollo de
ensayos de PCR de HPV de amplio espectro que permitan la detección de al menos 34 tipos
de VPH anogenital en una sola reacción. 9,14- 16 En el presente estudio, hemos utilizado una
novela, el ensayo de PCR ultrasensible en general SPF VPH. El ensayo SPF ha demostrado
ser más sensible que otros ensayos que usan conjuntos de cebadores en general, My11 / 09
y GP5 + / 6 +. 18 La otra ventaja del ensayo de PCR en general SPF HPV es la combinación
con el ensayo de sonda de línea de hibridación inversa que permite la simultánea detección
de 16 tipos de VPH diferentes individualmente en un único ensayo, rápido. Cuando este
estudio fue preparado para su publicación el VPH-LiPA se ha ampliado para el genotipado
de 25 tipos diferentes de VPH, incluyendo las 16 sondas descritas en este informe mediante
una ligera modificación del contenido de imprimación. 17 Recientemente, un árbol
filogenético basado en la homología de secuencia se desarrollaron en el que los tipos de
VPH se clasificaron en grupos de alto riesgo (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 y 58) y
bajo riesgo (VPH 6, 11, 40, 42, 43 y 44). 5 la clasificación de los VPH tipo como de alto
riesgo se fundamenta en estudios de seguimiento muestran que la infección persistente por
VPH de alto riesgo correlaciona fuertemente con la progresión de la neoplasia intraepitelial
cervical. 8,15,27,31 En la actual estudiar, 13 casos con infección única o múltiple de VPH de
bajo riesgo y se detectó 77 casos con infección única o múltiple de VPH de alto riesgo o
infección múltiple de alto riesgo combinado y de bajo riesgo del VPH fue detectado. La
detección de VPH de alto riesgo aumentó con la gravedad de la lesión, de 38% en ASCUS
hasta 84% de los frotis con HSIL. Este hallazgo demuestra que la infección por HPV,
especialmente infección por HPV de alto riesgo, es importante para la progresión de la
displasia cervical. Hemos sido capaces de realizar una repetición de la prueba del VPH en
una cohorte de 12 mujeres después de un seguimiento de 3 meses de seguimiento. Los
resultados de la segunda prueba de VPH correlacionan completamente con los resultados de
la primera prueba del VPH que indica que, SPF-HPV-LiPA es un ensayo altamente
sensible, específico y reproducible.

Se encontró una alta incidencia de VPH en mujeres con frotis cervicales normales (38%) o
con células escamosas atípicas de significado indeterminado en sus frotis cervicales (51%)
en comparación con otros datos obtenidos en la población holandesa o las mujeres
europeas. 16 Esto refleja tanto la mayor sensibilidad del sistema en comparación con otros
sistemas de detección de HPV en general como se describió anteriormente, así como (y
probablemente principalmente) paciente sesgo de selección. 9,32 mujeres fueron
incorporados en el estudio que fueron remitidos al ginecólogo después de al menos dos
cervical sucesiva frotis que contienen células compatibles con células escamosas atípicas de
significado indeterminado. De hecho, esta aparente diferencia en la tasa de prevalencia se
igualó en las lesiones de mayor grado en el que la prevalencia de VPH no era diferente de
los descritos en general.

Encontramos múltiples infecciones por VPH en el 27% de las raspaduras totales analizados,
que representaron el 44% de la cantidad total de raspaduras VPH positivas. Esta
prevalencia es mucho más alto que se ha descrito previamente en la población holandesa o
en general. 8,14,16,24 La diferencia puede ser debido a la alta sensibilidad del método utilizado
en el estudio actual. La principal ventaja de la SPF-HPV-LiPA es la posibilidad de
discriminar muy fácilmente si la amplificación se ha traducido en clusters heterogéneos de
PCR, que no pueden ser diferenciadas por métodos de hibridación convencionales
utilizados para el genotipado de los productos de PCR generales. Los resultados indican
que la incidencia de las infecciones múltiples ha sido muy subestimado. Kleter et
al 17 reportó una incidencia de múltiples infecciones por VPH en el 34% de los cepillados
cervicales obtenidas de mujeres con displasia leve o moderada usando el SPF-VPH-
LiPA. Muy recientemente, un método de detección de transferencia de línea inversa similar
ha sido descrito por Gravitt et al 33 en la que 27 tipos de HPV pueden ser identificados en
un solo sistema blot. Aunque este sistema de genotipificación parece tener especificidad
similar a la del SPF-VPH-LiPA, Gravitt et al 33 se encuentra sólo el 8,5% de las infecciones
múltiples, entre todas las muestras positivas de HPV. La principal diferencia entre el VPH-
LiPA y el método de detección line blot inverso, como se describe por Gravitt et al, 33 es el
paso principal de la amplificación por PCR. Gravitt et al 33utilizaron la PCR en general
My11 / 09 como paso inicial que resultó ser menos sensible que la PCR en general SPF
VPH, especialmente para los tipos de VPH 16, 35 y 45, que pueden haber influido en la
tasa de detección de infecciones múltiples, 18 a pesar de una diferencia en la selección de
pacientes también puede haber afectado a la prevalencia de las infecciones múltiples.

En conclusión, el sistema SPF-HPV-LiPA para la detección y determinación del genotipo

de las infecciones por VPH resultó ser un ensayo sensible, específico, y simple. Este ensayo
de detección de genotipado combinado hace que el cribado masivo de raspaduras de cuello
uterino en principio, accesibles para las aplicaciones prácticas y de investigación clínica de
rutina.

Ir:

Notas al pie
Solicitudes de reimpresión al Willem JG Melchers, Ph.D., Universidad de Nijmegen, Departamento de
Microbiología Médica, PO Box 9101, 6500 HB Nijmegen, Países Bajos. E-mail: .ln.nza.bmm @
srehclem.w

Con el apoyo de la Sociedad del Cáncer de subvención holandesa KWF 97-1486. J. Wang es el
destinatario de una Organización Holandesa para la Cooperación Internacional en la Educación Superior
(NUFFIC) beca (CN.3570).

Ir:

referencias
1. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J: Las estimaciones de la incidencia mundial de dieciocho
tipos principales de cáncer en 1985. Int J Cancer 1993, 54 : 594-606 [ PubMed ]

2. Bosch FX, Manos MM, Muñoz N, Sherman M, Jansen AM, Peto J, Schiffman MH,
Moreno V, Kurman R, Shah KV,; y el Grupo de Estudio IBSCC: La prevalencia del virus
del papiloma humano en cáncer cervical: una perspectiva mundial . J Natl Cancer
Inst 1995, 87 : 796-802 [ PubMed ]

3. Koutsky LA, Holmes KK, Critchlow CW, Stevens CE, Paavonen J, Beckmann AM,
DeRouen TA, Galloway DA, Vernon D, Kiviat NB: Un estudio de cohorte del riesgo de
neoplasia intraepitelial cervical grado 2 y 3 en relación con el virus del papiloma .
infección N Engl J Med 1992, 327 : 272-278 [ PubMed ]

4. Schiffman MH, Bauer H, R Hoover, Cristal AG, Cadell DM, fiebre del BB, Scott DR,
Sherman ME, Kurman RJ, wacholder S, Stanton CK, Manos MM: La evidencia
epidemiológica que muestra que la infección por VPH causa de neoplasia intraepitelial
cervical más. J Natl Cancer Inst 1993, 85 : 958-964[ PubMed ]

5. Chan SY, Delius H, Halpern AL, Bernard HU: Análisis de secuencias genómicas de los
tipos de virus del papiloma 95: unir a escribir, filogenia y taxonomía. J Virol 1995, 69 :
3.074-3.083 [ Artículo libre PMC ] [ PubMed ]

6. zur Hausen H:.-Infecciones por papilomavirus una de las principales causas de los
cánceres humanos Biochim Biophys Acta 1996, 1288 : F55-F78[ PubMed ]

7. Cuzick J, Szarewski A, Terry G, L Ho, Hanby A, Moddox P, M Anderson, Kocjan G,

Steele ST, Guillebaud J:. Pruebas de virus del papiloma humano en el cribado cervical
primario Lancet 1995, 345 : 1533-1536 [ PubMed ]

8. Remmink AJ, Walboomers JMM, Helmerhorts TJM, Voorhorts FJ, Roozendaal L, Risse
EKJ, Meijer CJLM, Kenemans P: La presencia de genotipos de VPH de alto riesgo
persistentes en las lesiones cervicales displásicas se asocia con la progresión de la
enfermedad: la historia natural hasta 36 . meses Int J Cancer 1995, 61 : 306-311 [ PubMed ]

9. Bollen LJ, Tjong-A-Hung SP, van der Velden J, K Brouwer, Mol BW, ten Kate FJ, ter
Schegget J: detección de ácido desoxirribonucleico virus del papiloma humano en los frotis
displásicas leve o moderadamente: un posible método para la selección de pacientes para .
colposcopia Am J Obstet Gynecol 1997, 177 : 548-553 [ PubMed ]

10. Cox JT, Lorincz AT, Schiffman MH, Sherman ME, Cullen A, Kurman RJ:. Pruebas de
virus del papiloma humano mediante captura híbrida parece ser útil en el triaje de mujeres
con diagnóstico citológico de células escamosas atípicas de significado indeterminado Am
J Obstet Gynecol 1995 172 : 946-954 [ PubMed ]

11. Cuzick J, Terry G, Ho L, T Hollingsworth, Anderson H: Tipo de virus del papiloma

humano 16 ADN en los frotis cervicales como un predictor de cáncer de cuello uterino de
alto grado. Lancet 1992, 339 : 959-960 [ PubMed ]

12. Sherman ME, Schiffman MH, Lorincz AT, Manos MM, Scott DR, Kurman RJ, Kiviat
NB, Stoler H, Cristal AG, de Rush BB: Hacia la garantía de la calidad objetiva en
citopatología cervical: correlación de diagnóstico cytopathologic con detección de alto
riesgo tipos de papilomavirus humanos.Am J Clin Pathol 1994, 2 : 182-187 [ PubMed ]
13. Walboomers JMM, De Roda Husman AM, Snijders PJF, Stel HV, Risse EKJ,
Helmerhorst ThJM, Voorhorst FJ, Meijer CJLM: virus del papiloma humano en los frotis
cervicales falsos negativos archivo:. Implicaciones para la detección del cáncer de cuello de
útero J Clin Pathol 1995 48 : 728-732[ PMC libres artículo ] [ PubMed ]

14. De Roda Husman AM, Walboomers JMM, van den Brule AJ, Meijer CJLM, Snijders
PJF: El uso de cebadores GP5 general y GP6 alargado en su extremo 3 'con secuencias
altamente conservadas adyacentes mejora la detección de virus del papiloma humano por
PCR. J Gen Virol 1995, 76 : 1057-1062 [ PubMed ]

15. Hildesheim A, Schiffman MH, Gravitt PE, Cristal AG, Greer CE, Zhang T, Scott DR,
fiebre del BB, Lawler P, Sherman ME, Kurman RJ, Manos MM: La persistencia de la
infección por papilomavirus humano de tipo específico entre las mujeres citológicamente
normales . J Infect Dis 1994, 169 : 235-240[ PubMed ]

16. Melchers WJG, Claas TJE, Quint WGV: El uso de la reacción en cadena de la
polimerasa para estudiar la relación entre la infección por papilomavirus humano y el
cáncer de cuello uterino. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1991,10 : 714-727 [ PubMed ]

17. Kleter B, LJ van Doorn, Schrauwen L, Molijn A, S Sastrowijoto, ter Schegget J, J

Lindeman, ter Harmsel B, Burger M, Quint W: Desarrollo y evaluación clínica de un
ensayo de sonda de hibridación línea altamente sensible PCR inversa para la detección e
identificación de virus del papiloma humano anogenital. J Clin Microbiol 1999, 37 : 2508-
2517[ Artículo libre PMC ] [ PubMed ]

18. Kleter B, LJ van Doorn, ter Schegget J, L Schrauwen, van Krimpen C, Burger M, ter
Harmsel B, Quint W:. Novel ensayo de PCR corto fragmento para la detección altamente
sensible de amplio espectro de virus del papiloma humano anogenitales Am J
Pathol 1998 153 : 1731-1739[ Artículo libre PMC ] [ PubMed ]

19. Koss LG: La prueba de Papanicolaou para la detección del cáncer de cuello uterino:. Un
triunfo y una tragedia JAMA 1989, 261 : 737-743[ PubMed ]

20. Oleson F: Un estudio de casos y controles de la citología cervical antes del diagnóstico
de cáncer de cuello uterino en Dinamarca. Int J Epidemiol 1988,17 : 501-508 [ PubMed ]

21. Pontén J, Adami HO, Bergström I, J Dillner, Friberg LG, Gustafsson L, Miller AB,
Parkin DM, sparen P, Trichopoulos D: Estrategias para el control global del cáncer de
cuello uterino. Int J Cancer 1995, 60 : 1-26 [ PubMed ]

22. Nasiell K, M Nasiell, Vaclavinkova V: Comportamiento de la displasia cervical

moderada durante largo plazo de seguimiento. Obstet Gynecol 1983,61 : 609-
614 [ PubMed ]
23. Nasiell K, Roger V, Nasiell M: Comportamiento de la displasia cervical leve durante
largo plazo de seguimiento. Obstet Gynecol 1986, 67 : 665-669[ PubMed ]

24. Walboomers JMM, De Roda Husman AM, van den Brule AJC, Snijders PJF, Meijer
CJLM: La detección de la infección por papilomavirus humano genital: revisión crítica de
los métodos y estudios de prevalencia en relación con el cáncer de cuello uterino. Virus del
papiloma humano y el cáncer cervical: Biología e Inmunología. Editado por Stern PL,
Stanley MA. Oxford, Oxford University Press, 1994, pp 41-71

25. Ngelangel C, Muñoz N, Bosch FX, Limson GM, Festin MR, Deacon J, Jacobs MV,
Santamaría M, Meijer CJLM, Walboomers JMM: Las causas de cáncer de cuello uterino en
las Filipinas: un estudio de casos y controles. J Natl Cancer Inst 1998, 90 : 43-
49 [ PubMed ]

26. Chichareaon S, R Herrero, Muñoz N, Bosch FX, Jacobs MV, Deacon J, M Santamaría,
Chongsuvivatwong V, Meijer CJLM, Walboomers JMM: Los factores de riesgo para el
cáncer de cuello de útero en Tailandia: un estudio de casos y controles. J Natl Cancer
Inst 1998, 90 : 50-57 [ PubMed ]

27. Hirschowitz L, Rifa AE, Mackenzie EFD, Hughes AO: Seguimiento a largo plazo de
las mujeres con el límite resultado frotis cervical:. Efectos de la edad y la infección viral en
la progresión de discariosis alto grado Br Med J1992, 304 : 1209-1212 [ PMC libres
artículo ] [ PubMed ]

28. Jonsson M, R Karlsson, Evander M, Gustavsson A, E Rylander, Wadell G:

acetoblanqueo del cuello uterino y la vulva como un predictor de la infección por el virus
del papiloma humano subclínica:. Sensibilidad y especificidad en un estudio basado en la
población Obstet Gynecol 1997 90 : 744-747[ PubMed ]

29. Walker EM, Dodgson J, Duncan ID: ¿La atipia leve en una investigación más a fondo
de cuello uterino orden de esputo? Lancet 1986, II : 672-673[ PubMed ]

30. Kjaer SK, van den Brule AJC, Bock JE, Poll PA, Engholm G, Sherman ME,
Walboomers JMM, Meijer CJLM: Determinantes para el virus del papiloma humano
genital (VPH) en 1000 elegidas al azar y mujeres danesas jóvenes con frotis de
Papanicolaou normales: son hay diferentes perfiles de riesgo de alto riesgo y los tipos de
VPH de riesgo no altas? cáncer Epidemiol Biomarkers Prev 1997, 6 : 799-805 [ PubMed ]

31. Ranst Van M, Kaplan JB, Burk RD: la clasificación filogenética de los virus del
papiloma humano:. Correlación con la manifestación clínica J Gen Virol 1992, 73 : 2653-
2660 [ PubMed ]

32. Qu W, Jiang G, Cruz Y, Chang CJ, Ho GY, Klein RS, Burk RD: la detección por PCR
del virus del papiloma humano:. Comparación entre sistemas de imprimación MY09 /
MY11 y GP5 + / GP6 + J Clin Microbiol1997, 35 : 1304- 1310 [ PMC libres
artículo ] [ PubMed ]

33. Gravitt PE, Peyton CL, Apple RJ, Wheeler CM: Genotipado de 27 tipos de
papilomavirus humanos mediante el uso de productos de PCR L1 consenso por un solo-
hibridación, la línea inversa método de detección por transferencia. J Clin
Microbiol 1998, 36 : 3.020-3.027 [ PMC Artículo libre ] [ PubMed ]