ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE

TRIGO
Maria Alejandra Otavo Pajarito
Daniela Reyes Lugo

Resumen
Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones, por lo que
aumentan la velocidad, y permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que normalmente no tendrían
lugar. Las fosfatasas catalizan la hidrólisis de ésteres y anhídridos de H3PO4, son responsables de la
mineralización del fósforo orgánico del suelo y de la liberación del fósforo inorgánico que utilizan los
microrganismos y las plantas. Se clasifican en fosfatasas ácidas, y alcalinas, las ácidas son producidas por
microorganismos y plantas superiores como el germen de trigo, mientras que las alcalinas son producidas
principalmente por microorganismos. El tiempo de incubación en que la enzima está actuando sobre el sustrato,
influye directamente en la aparición de producto, por otro lado, las enzimas se ven afectadas por ciertos factores
que puede aumentar o disminuir su actividad enzimática, tales como la temperatura optima la cual es de 37°C
generalmente, el pH optimo en un rango entre 5.0 a 5.6, la concentración de enzima, de sustrato y el efecto de un
inhibidor irreversible o reversibles.

Introducción La relación entre la velocidad de la reacción y la

concentración de sustrato (S, reactante) en una
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones reacción catalizada por una enzima (E) está dada por
químicas en los seres vivos, estas actúan en pequeña la ecuación de Michaelis y Menten.
cantidad y se recuperan rápidamente. En una
reacción catalizada por una enzima, la sustancia que 𝑘+1 𝑘2
𝐸+𝑆 ← → 𝐸𝑆 → 𝐸+𝑃
actúa sobre esta se conoce como sustrato, este 𝑘−1
sustrato se une a una región de la enzima llamada 𝑘+1 , 𝑘−1 𝑦 𝑘2 : 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑
centro activo, de esta forma se generan los productos
y la enzima puede comenzar una nueva reacción. Las 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
𝑣=
enzimas son catalizadores biológicos, lo cual ayuda 𝐾𝑚 + [𝑆]
a aumentar la velocidad de las reacciones químicas,
disminuyendo la energía de activación de los Donde, en condiciones de estado estable
reactantes.
 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐸 𝑆
= 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑠𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑠𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝐸 𝑆
𝑉= velocidad de reacción a una determinada
concentración de sustrato
[𝑆] = concentración de sustrato
𝑉𝑚𝑎𝑥 = velocidad máxima alcanzable a la
concentración de enzima dada
𝐾𝑚 = constante de disociación aparente de E S = (k
–1 + k2) / k+1
Las enzimas, debido a su naturaleza proteica pueden
ser inestables o desnaturalizadas por diferentes
variables que afectan algunas de sus propiedades
bilógicas. Debido a esto, la velocidad de una reacción
enzimática depende de los siguientes factores:
concentración de sustrato, concentración de enzima,
pH, temperatura e inhibidores.
Las fosfatasas ácidas y alcalinas son un grupo de
enzimas de amplia distribución en la naturaleza.
Todas actúan sobre monoésteres de ácido
ortofosfórico, tanto alifáticos (glicerol–1–fosfato y
glicerol–2–fosfato) como aromáticos (4–
fenilofosfato). La fosfatasa alcalina purificada de
diversas fuentes también puede hidrolizar
fosfocreatina, fosfato inorgánico y polifosfatos como
el ATP.
Recibe el nombre sistemático de monoéster
ortofosfórico fosfohidrolasa y la reacción general
que cataliza se presenta así:
𝑚𝑜𝑛𝑜é𝑠𝑡𝑒𝑟 𝑜𝑟𝑡𝑜𝑓𝑜𝑠𝑓ó𝑟𝑖𝑐𝑜 + 𝐻2 𝑂
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑎𝑠𝑎
→ 𝑎𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙 + 𝑜𝑟𝑡𝑜𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑡𝑜
Las fosfatasas son específicas para el fosfato de la
molécula, de manera que la ruptura ocurre cerca del
átomo de fósforo.
𝐶−𝑂 ↭𝑃
Para la fosfatasa ácida, la determinación de la
actividad se fundamenta en la cuantificación del
fosfato liberado, lo cual se hace por el método de
Fiske-Subbarow:
𝑃𝑂4 −3 + á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜
→ á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜
Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑚𝑜𝑙í𝑏𝑑𝑖𝑐𝑜 + á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑎𝑠𝑐ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜
→ ó𝑥𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑖𝑏𝑑𝑒𝑛𝑜
Este es un método colorimétrico, basado en la
reacción del fósforo con ácido molíbdico para
obtener ácido fosfomolíbdico. Posteriormente, éste
reacciona como un reductor en medio alcalino (ácido
ascórbico), formando una mezcla de óxidos de
molibdeno, de color azul (Laboratorio 3: Actividad
enzimática en procesos de transformación, 2016).
Metodología
La práctica de laboratorio se realizó en dos sesiones,
en el cual en cada una se realizaron los diferentes
procedimientos: extracción de la fosfatasa acida,
curva de calibración de fosforo inorgánico,
determinación de cantidad de fósforo producido por
acción de fosfatasa acida, determinación de tiempo
óptimo de incubación, pH optimo, temperatura
optimo, concentración de enzima y sustrato y
presencia de un inhibidor.
La extracción de la fosfatasa ácida se realizó
previamente a iniciar el laboratorio con ayuda de
Marta auxiliar de laboratorio, este procedimiento
consistió inicialmente en pesar 10g de germen de
trigo y agregarle 50mL de agua fría, Después se agito
la mezcla hasta que se obtuvo una suspensión
uniforme, se dejó en reposo por 30 min, se decantó
durante 15 min y finalmente se filtró el sobrenadante
a través de algodón. Los residuos se descartaron y la
solución obtenida era el extracto crudo de la fosfatasa
ácida.
Para la preparación de la curva de calibración de Para la determinación del tiempo óptimo de
fosforo inorgánico, se realizaron las siguientes incubación, se prepararon las siguientes mezclas
soluciones que se muestran en la tabla 1. como se muestra en la tabla 3.
Tabla 1: Volúmenes de reactivos utilizados en la Tabla 3: Volúmenes de reactivos para prueba de
preparación de la curva de calibración tiempo óptimo
Patrón de
fósforo Agua Ácido
Tubo Buffer
0.04 mg/ml (ml) molíbdico (ml) β-glicero Extracto
citráto 0.1 Agua
(ml) Tubo
M de pH
fosfato de
(ml)
enzimátic
sodio (ml) o (ml)
5.3 (ml)
B – 4.0 0.5
Blanco buffer
1 0.1 3.9 0.5 (BB)
5.6 – 2.4 –

Mezcle bien los tubos y agregue

2 0.2 3.8 0.5
Blanco

a continuación
3 0.3 3.7 0.5 sustrato (BS)
5.6 1.6 0.8 –
4 0.4 3.6 0.5

5 0.5 3.5 0.5 Blanco

enzima (BE)
5.6 – 1.6 0.8

Una vez preparada las soluciones, se agitaron los Tiempo

tubos y se dejaron reposar durante 3 minutos, pasado
los 3 minutos se adicionaron 0.5mL de ácido
ascórbico a cada tubo. Se agitaron los tubo y se dejó
en reposo durante 10 minutos para que el color azul
se desarrollara completamente, finalmente se
determinó la absorbancia a 660nm.
El procedimiento A1 para la determinación de
cantidad de fosforo producido por acción de
fosfatasa ácida se realizó para cada práctica en la que
se obtenía un sobrenadante. Para cada una de ellas se
realizó la misma mezcla de acuerdo a la tabla 2,
siguiendo el orden de cada sustancia.
Tabla 2: Volúmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reacción
para determinación de fósforo
Sobrenadante de la reacción enzimática 0.5 ml
Agua destilada 3.5 ml
Ácido molíbdico 0.5 ml
Una vez listas las mezclas, se agitaron bien y se
dejaron en reposo durante tres minutos, pasado ese
tiempo se adicionaron 0.5mL de ácido ascórbico,
luego se agito bien y se dejó en reposo durante 10
minutos, finalmente, se leyó la absorbancia a 660nm.
reacción (TR)
5.6 1.6 – 0.8
Una vez listas las mezclas, se agitaron bien y se
incubaron a temperatura ambiente, el blanco de
buffer (BB) y el blanco de sustrato (BS) se dejaron
reaccionar 30 minutos. Pasado este tiempo se
tomaron alícuotas de 1 ml y se recibieron sobre ácido
tricloroacético al 10% tanto de BB como de BS. Por
otro lado, durante los 30 minutos que se mantuvieron
en incubación BB y BS, se tomaron muestras de 1 ml
de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos. Dichas
alícuotas se recibieron en tubos que contienen 1 ml
de ácido tricloroacético al 10%. En continuación a
esto, se agitaron y se centrifugaron a 5000rpm
durante 4 minutos.
Finalmente, se continuo con el procedimiento A1
para la determinación de cantidad de fósforo
producido por acción de fosfatasa acida.
El procedimiento para la determinación del pH
óptimo se realizaron las siguientes soluciones
teniendo en cuenta los volúmenes de la tabla 4 y las
condiciones del sustrato: Solución de β-
glicerofosfato de sodio 0.1 M, el buffer: Soluciones
de buffer de citrato 0.1 M, diferentes pHs y la
enzima: Extracto enzimático crudo.
Tiempo de reacción: 10 minutos 18 Temperatura ambiente

37 Termostato
Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo 60 Termostato
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6
92 Agua en ebullición
Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(ml)

Buffer Tabla 6: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura

2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
(ml) óptima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
pH del
5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2 Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
buffer
Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(ml)
Una vez bien mezcladas las soluciones, se agregó la Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – –
enzima a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados
Temperatur
30 segundos de agregada la enzima al primer tubo, se 18 18 18 0 18 37 60 92
a °C
le agrego al segundo y así hasta haber agregado la
enzima en los tubos de la siguiente forma:
Enzima Una vez bien mezcladas las soluciones, se agregó la
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 enzima a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados
(ml)
30 segundos de agregada la enzima al primer tubo, se
le agrego al segundo y así hasta haber agregado la
Se mezcló bien cada tubo y se dejaron incubando a enzima en los tubos de la siguiente forma:
temperatura ambiente durante 10 minutos Enzima
exactamente, es decir una vez que se agregó la – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml)
enzima al primer tubo, desde ahí se contabilizo los
10 minutos, luego, al pasar los 10 minutos, se agregó
2mL de ATA 10% a cada tubo, se mezcló y se llevó Se mezcló bien cada tubo y se dejaron incubando a
a centrifugar a 5000rpm durante 4 minutos. El temperatura ambiente durante 10 minutos
precipitado obtenido se descarte y el sobrenadante se exactamente, es decir una vez que se agregó la
utilizó para el procedimiento A1. enzima al primer tubo, desde ahí se contabilizo los
Para la determinación de la temperatura óptima se 10 minutos, luego, al pasar los 10 minutos, se agregó
realizaron las siguientes soluciones de acuerdo a la 2mL de ATA 10% a cada tubo, se mezcló y se llevó
tabla 6, teniendo en cuenta las condiciones de buffer: a centrifugar a 5000rpm durante 4 minutos. El
Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3, de precipitado obtenido se descarte y el sobrenadante se
utilizó para el procedimiento A1.
sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1
M y de enzima: Extracto enzimático crudo. Sin
embargo para este procedimiento la incubación se
realizó a diferentes temperaturas como se muestra en En el procedimiento del efecto de la concentración
la tabla 5. de la enzima en la velocidad de reacción, se
realizaron las siguientes soluciones de acuerdo a la
Tiempo de reacción: 10 minutos tabla 7, teniendo en cuenta las condiciones del buffer:
Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinación de temperatura Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3, del
óptima sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio 0.1
Temperatura, °C Medio M y de la enzima: Extracto enzimático crudo.
0 Agua – Hielo Tiempo de reacción: 10 minutos
 Tabla 7: Volúmenes de reactivos utilizados en la determinación del 0.6 – 0.4 – – – – – – – –

Agua
(ml)
efecto de la concentración de la enzima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5

Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Sustrato Una vez bien mezcladas las soluciones, se agregó la

– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(ml) enzima a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados
Agua (ml) 0.8 0.4 0.4 0.35 0.30 0.25 0.10 – 30 segundos de agregada la enzima al primer tubo, se
le agrego al segundo y así hasta haber agregado la
enzima en los tubos de la siguiente forma:
Una vez bien mezcladas las soluciones, se agregó la
Enzima
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
enzima a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados (ml)

30 segundos de agregada la enzima al primer tubo, se

le agrego al segundo y así hasta haber agregado la
enzima en los tubos de la siguiente forma:
Enzima (µl) – – 400 50 100
Se mezcló bien cada tubo y se dejaron incubando a
temperatura ambiente durante 10 minutos
exactamente, es decir una vez que se agregó la
enzima al primer tubo, desde ahí se contabilizo los
10 minutos, luego, al pasar los 10 minutos, se agregó
2mL de ATA 10% a cada tubo, se mezcló y se llevó
a centrifugar a 5000rpm durante 4 minutos. El
precipitado obtenido se descarte y el sobrenadante se
utilizó para el procedimiento A1.
En la práctica del efecto de la concentración de
sustrato, determinación de la constante de Michaelis
(Km) se realizaron las soluciones de acuerdo a la
tabla 8 y considerando las condiciones de buffer:
solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3, de
sustrato: Solución de -glicerofosfato de sodio de
diversas concentraciones en el rango 5 – 100 mM y
de enzima: Extracto enzimático crudo.
Tiempo de reacción: 10 minutos
Tabla 8: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la
Se mezcló bien cada tubo y se dejaron incubando a
temperatura ambiente durante 10 minutos
150 300 400 exactamente, es decir una vez que se agregó la
enzima al primer tubo, desde ahí se contabilizo los
10 minutos, luego, al pasar los 10 minutos, se agregó
2mL de ATA 10% a cada tubo, se mezcló y se llevó
a centrifugar a 5000rpm durante 4 minutos. El
precipitado obtenido se descarte y el sobrenadante se
utilizó para el procedimiento A1.
Finalmente, en el último procedimiento sobre el
efecto de la presencia de un inhibidor en la velocidad
de reacción se realizaron las soluciones de acuerdo a
la tabla 9 y considerando las condiciones del buffer:
Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3, de
sustrato: Solución de –glicerofosfato de sodio de
diversas concentraciones en el rango 5–100 mM, de
enzima: Extracto enzimático crudo y de Inhibidor:
HgCl2 5 mg/ml.
Tiempo de reacción: 10 minutos
Tabla 9: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la
concentración del sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción
BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
Tubo

concentración del sustrato en la velocidad de reacción

BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8
Tubo

Buffer (ml)

1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 0.8
Buffer (ml)

1.4 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.0
Sustrato

– 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

(ml)
Sustrato

– 0.8 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

(ml)

[ S ] mM

– 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100

{S} mM

– 100 – 5 10 20 40 60 80 100 100

 Agua (ml) 1.0 – 0.4 – – – – – – – – Mues Absorba P Ag Ácid. Concentr Vol.
tra ncia 0,04 ua Molíb ación de Final(
mg/ dico fósforo ml)
ml (mg/ml)
Inhibidor

– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

(ml)

1 0,158 0,1 3,9 0,5 0,00088 4,5

2 0,296 0,2 3,8 0,5 0,00177 4,5

Una vez bien mezcladas las soluciones, se agregó la
enzima a intervalos de 30 segundos, es decir, pasados 3 0,434 0,3 3,7 0,5 0,00266 4,5
30 segundos de agregada la enzima al primer tubo, se 4 0,565 0,4 3,6 0,5 0,0035 4,5
le agrego al segundo y así hasta haber agregado la
enzima en los tubos de la siguiente forma: 5 0,708 0,5 3,5 0,5 0,0044 4,5

Enzima
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml)
Grafica 1. Curva de calibración patrón fosfatasa
ácida

Se mezcló bien cada tubo y se dejaron incubando a

temperatura ambiente durante 10 minutos
exactamente, es decir una vez que se agregó la
enzima al primer tubo, desde ahí se contabilizo los
10 minutos, luego, al pasar los 10 minutos, se agregó
2mL de ATA 10% a cada tubo, se mezcló y se llevó
a centrifugar a 5000rpm durante 4 minutos. El
precipitado obtenido se descarte y el sobrenadante se
utilizó para el procedimiento A1.

Resultados y discusión
Para realizar la curva de calibración de fósforo
inorgánico se utilizó un patrón de fósforo 0,04mg/ml
para cada tubo, sin embargo, la concentración de esta
era diferente para cada uno, por lo cual se calculó la
concentración de fósforo para cada tubo tal como se
muestra en la tabla 10.
Antes de calcular dichas concentraciones, se leyó la
absorbancia de cada uno de los tubos sin tener en
cuenta la concentración de patrón de fósforo
inorgánico. A partir de las absorbancias obtenidas y
de la concentración de fósforo para cada tubo, se
realizó la curva de calibración tal como se representa
en la gráfica 1. De acuerdo a la gráfica se obtuvo una
recta con su respectivo ajuste el cual está dado por la
ecuación y=154,01x +0,0215, en donde y representa
la absorbancia y x la concentración de fósforo para
cada absorción.
Para determinar el tiempo óptimo de la reacción
catalítica enzimática, se tuvo en cuenta la
absorbancia obtenida de cada muestra a cierto
determinado tiempo de reacción tal como se muestra
en la tabla 11, a partir de esta, se calculó la
concentración de producto de fósforo inorgánico
para cada una de las muestras. Una vez obtenidas
estas concentraciones se dividieron en su respectivo
tiempo de reacción, de esta forma se pudo obtener la
actividad enzimática y la cantidad de producto por
min.
Posteriormente, con los datos obtenidos, se
representaron en la gráfica 2 comparando la actividad
enzimática contra el tiempo y a partir de esta, se pudo
obtener que el tiempo óptimo es de 20 min, ya que en
este tiempo, la cantidad de producto obtenido es
mayor frente a las otras muestras, por otro lado, su
actividad enzimática disminuyó respecto a las otras.

Tabla 10. Concentración de fósforo inorgánico

 Tabla 11. Tiempo óptimo Grafica 2. Tiempo óptimo
Muest Absorban Concentraci Conc. Activida Tiem
ra cia ón (µmol) P d po
(µmol enzimáti (min)
) ca
(µmol/mi
n)

1 BS -0,019 -0,00026 -
0,002
36

2 BE1 0,19 0,00109 0,009 0,00492 2

84

3 TR1 0,205 0,00119 0,003 0,00162 2

24

4 BE2 0,463 0,00286 0,025 0,00516 5 Para la determinación del pH óptimo de la fosfatasa
8
ácida se tuvo en cuenta los datos de absorbancia de
5 TR2 0,47 0,0029 0,002 0,00055 5 la tabla 12 los cuales representa a cada una de las
77 muestras en donde se utilizó buffer de citrato 0,1M a
diferentes pH. Utilizando la ecuación obtenida en la
6 BE3 0,66 0,0041 0,037 0,00373 10
31 gráfica 1 se calculó la concentración de fósforo que
se encontraba en cada una de las muestras.
7 TR3 0,432 0,00266 - -0,00109 10
0,010
9 Posteriormente, se calculó la velocidad máxima o la
actividad enzimática que alcanzaba cada una de las
8 BE4 0,21 0,0012 0,011 0,00073 15 muestras, dichos datos se encuentran en la tabla 12.
01
A partir de esto, se realizó la gráfica 3 sobre la
9 TR4 0,274 0,00163 0,006 0,00040 15 actividad enzimática vs pH, en donde se observa un
10 comportamiento parabólico. De acuerdo a la teoría
(Zubay, Parson & Vance, 1995), el pH óptimo se
10 0,041 0,000126 0,001 5,697E- 20
BE5 13 05 determina con el punto de la velocidad máxima, en
este caso comparando con la gráfica 3, dicho punto
11 0,86 0,00544 0,050 0,00251 20 estaria ubicado en un pH de 5 y de acuerdo a la
TR5 22
literatura ("Fosfatasa - Diccionario Médico", 2016)
12 0,777 0,0049 0,044 0,00147 30 el pH óptimo para la fosfatasa ácida está entre 5.0-
BE6 1 5.6 y la actividad enzimática obtenida fue de
13 0,43 0,0026 - -0,00059 30
0.00135.
TR6 0,017
9 En la muestra 3, se presenta la mayor actividad
enzimática respecto a las demás muestras, esto quiere
decir que a los 10 minutos que dura la reacción, en la
muestra 3 se generó mayor producción de fósforo
inorgánico, gracias al buffer citrato 0,1M.

El pH per se no afecta la actividad enzimática, sino

la concentración de protones. Los protones además
de alterar la estructura de la enzima y el substrato,
pueden participar también en la reacción como
substrato o producto. En esos casos, la concentración
de protones afecta directamente la velocidad de la
reacción ("ENZIMAS - LibroBOTANICAOnLine -
ENZIMAS", 2007).
 Tabla 12. pH óptimo Una vez obtenidas las concentraciones de fósforo
Muestr Absorbanc Concentraci Con. Act. p inorgánico, se continuó a calcular la actividad
a ia ón (µmol) De Enzimátic H enzimática para cada una de las muestras y a partir
Patron a
(µmol) (µmol/mi
de estos resultados, se obtuvo la gráfica 4 en el cual
n) se tienen como variables, la temperatura y la
actividad enzimática.
BS 0,1 0,00050 0,0045 5,
8 3
De acuerdo a la gráfica 4, la temperatura óptima de
BE 0,448 0,00276 0,0249 5, la fosfatasa ácida se encuentra a 60°C, el cual,
2 3 respecto a la literatura está muy lejano, puesto que el
1 0,437 0,00269 - -0,00052 3
tiempo óptimo teórico de las enzimas es de 37°C (Pin
0,0052 & Guzmán, 2010) aproximadamente ya que estas se
3 encuentran en el organismo, en el hígado en el cual
2 0,529 0,00329524 0,0001 1,4609E- 4
el cuerpo del ser vivo conserva una temperatura
1 4 5 aproximada de 37°C. Sin embargo, esta temperatura
óptima de 60°C se pudo haber generado debido a
3 0,759 0,00478 0,0135 0,00135 5 errores experimentales ya sea en el momento de parar
8
la reacción con el ATA 10% o que alguna
4 0,708 0,00445 0,0106 0,00106 5, concentración del buffer o del sustrato haya sido
0 3 causante de tal resultado.
5 0,633 0,00397 0,0062 0,00062 5,
2 6 Por otro lado, al obtener esta temperatura la enzima
probablemente ya se haya desnaturalizado ya que
6 0,582 0,00363 0,0324 0,00032 6, habrá sobrepasado la temperatura óptima de la
2
fosfatasa ácida, sin embargo, de acuerdo a la
literatura, el aumento de temperatura incrementa la
actividad enzimática hasta un valor máximo que
Grafica 3. pH óptimo
corresponde a la temperatura óptima, por encima de
ésta la actividad cae rápidamente (Pin & Guzmán,
2010), de esta forma revisando los datos
experimentales la temperatura óptima a 60°C está
bien ya que después de esta la actividad enzimática
cae drásticamente, esta pasa de ser 0,00184 a
0,00054.

Tabla 13. Temperatura óptima

Mues Absorba Concentra Con. Act. Temperat
tra ncia ción De P Enzimát ura (°C)
(µmol) (µmol) ica
(µmol/
min)
En la determinación de la temperatura óptima se
utilizaron los datos de absorbancia que se presentan BS 0,023 9,7396E-6 8,7656 18
en la tabla 13, con estos datos y junto a la ecuación E-5
obtenida de la gráfica 1 de la curva de calibración del
BE 0,317 0,00191 0,0172 18
fósforo, se pudo determinar la concentración de 6
fósforo inorgánico presente en cada una de las
muestras. En este caso, la incubación de las muestras 1 0,398 0,00244 0,0046 0,00046 0
4
no fue a temperatura ambiente si no que para cada
una, la incubación se realizaba a diferentes 2 0,507 0,00315 0,0110 0,00110 18
temperaturas entre 0°C a 90,1°C. 1
 3 0,605 0,00378 0,0167 0,00167 37 demuestra un comportamiento descendente respecto
4 a los demás, por lo cual esto indica que la
absorbancia leída para este dato volvió a
4 0,634 0,00397 0,0184 0,00184 60
3 incrementar, esto se debe a errores experimentales,
en el que pudo haber sido error en la cantidad de
5 0,411 0,00252 0,0054 0,00054 90,1 sustancias que se agregaban a cada tubo. Sin
0
embargo los demás datos, muestran el
comportamiento ascendente tal como aparece en la
literatura ("LECCIÓN 8 Factores que afectan la
Grafica 4. Temperatura óptima cinética enzimática", 2002).

Tabla 14. Concentración de enzima

Mues Absorba Concentr Con. Act. mL Conc
tra ncia ación De P Enzimá Enzi .
(µmol) (µmo tica ma Enzi
l) (µmol/ ma
min) (µm
ol)

BS 0,017 -2,9E-05 -
3,2E-
06

BE 0,304 0,002 0,000

2

1 0,037 0,0001 1,1E- 1,1E-06 0,4 0,2

05
El efecto de la concentración de enzima en la
velocidad de reacción de la fosfatasa ácida es 2 0,063 0,0003 2,9E- 2,9E-06 0,05 0,02
05 5
directamente proporcional a la velocidad de
reacción, es decir a la actividad enzimática. Por lo 3 0,452 0,0027 0,000 3,1E-05 0,15 0,07
tanto, entre mayor cantidad de enzima, mayor será su 3 5
velocidad, siempre y cuando la cantidad de sustrato
4 0,324 0,002 0,000 2,1E-05 0,3 0,15
no sea menor a la de la enzima y la cantidad de 22
enzima no sea constante, de otra forma no se
generara algún efecto en la velocidad de reacción. 5 0,453 0,0028 0,000 3,1E-05 0,4 0,2
3

De acuerdo a los datos de absorbancia obtenido de la

tabla 14, se pudo determinar la concentración de
producto y la actividad enzimática de cada una de las
muestras. Utilizando estos datos se realizó la gráfica Grafica 5. Concentración de enzima
5 de actividad enzimática vs concentración de
enzima, todo esto teniendo la concentración de
sustrato constante para cada muestra a excepción del
Blanco Absoluto (BB), y el Blanco Enzima (BE).

A mayor actividad enzimática mayo es la

concentración de enzimas dentro de la muestra, es
por este motivo que si observamos la gráfica 5, se
puede observar curva de incrementación, en el que se
puede ver claramente que entre más enzima haya,
mayor es su velocidad de reacción y meno su energía
de activación, sin embargo el último dato obtenido,
 Grafica 6. Concentración de sustrato con y sin Tabla 18. Velocidad por muestra sin inhibidor
inhibidor Muestra C/ inhibidor Velocidad (mM/min)

1 7352,9

2 8474,5

3 9174,3

4 9569,3

5 9708,7

6 9779,9

7 9923,1

8 9810,8

[I](mg/ml)i [I](mg/ml)f KI

5 0,5 2

Tabla 15. Velocidad máxima sin inhibidor

Vmáx Km/Vmáx km
Grafica 7. Inhibidor no competitivo
5000 0,00005 0,25

Tabla 16. Velocidad por muestra sin inhibidor

Muestra S/ inhibidor Velocidad
(mM/min)

1 2932,04

2 3214,28

3 2368,42

4 1551,72

5 1153,84

6 918,36

7 762,71

8 412,84

Conclusiones
Tabla 17. Velocidad por muestra sin inhibidor
 La curva de calibración de fósforo
inorgánico, nos permitió calcular la
Vmáx´ Km´/Vmax Km´
concentración de fósforo que había en cada
10000 0,00004 0,4 procedimiento y así mismos nos permitió
calcular la actividad enzimática en cada una
de ellas.
  El pH óptimo de la fosfatasa ácida obtenido Datateca.unad.edu.co. Revisado el 12
fue de 5.0, lo cual de acuerdo a la literatura es
Marzo 2016, desde
el pH esperado en la práctica.
 La temperatura óptima permite que la http://datateca.unad.edu.co/contenidos/2000
actividad enzimática sea máxima hasta cierta 02/MODULO%20SISTEMAS%20METAB
temperatura en la cual después desnaturaliza
a la enzima, por lo cual la temperatura OLICOS%20NUTRICIONALES/leccin_8_f
obtenida de 60°C no fue la esperada ya que actores_que_afectan_la_cintica_enzimtica.ht
sobrepasa a la temperatura óptima de 37°C.
 La concentración de enzima es directamente ml
proporcional a la velocidad de la reacción,  Pin, G., & Guzmán, C. (2010).
por lo cual entre más enzimas se utilicé, la
reacción ocurrirá más rápido. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE
 El tiempo óptimo para la reacción enzimática FOSFATASA ALCALINA SÉRICA EN
fue de 20 min, en donde la producción de
fósforo inorgánico fue máxima, pero la CANES (1st ed., pp. 7-13). Facultad de
velocidad de reacción no. Medicina Veterinaria y Zootecnia, U. A. G.
R. M. Revisado desde
http://www.fcv.uagrm.edu.bo/sistemabibliot
Bibliografía ecario/doc_tesis/PIN,%20LEDA-20101118-
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 Zubay, G., Parson, W., & Vance, D. (1995).
ENZIMAS. (2007). Forest.ula.ve. Revisado
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el 12 Marzo 2016, desde
Wm. C. Brown.
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 Fosfatasa - Diccionario Médico. (2016).
Portalesmedicos.com. Revisado el 12 Marzo
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http://www.portalesmedicos.com/diccionari
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Department of Medicine, University of
Kansas Medical Center. Revisado desde
http://w3.ualg.pt/~jvarela/pl/p8/joycegrisolia
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 LECCIÓN 8 Factores que afectan la
cinética enzimática. (2002).