Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia

Facultad de Ciencias Básicas

Escuela de Química
Química Analítica III

Taller II

1. Describa la fase estacionaria en una columna cromatográfica de HPLC teniendo en cuenta:

- Estructura química

- Morfologia

- Porosidad: es la relación entre el volumen interno de los poros y el volumen de la partícula,

los poros son de tamaño y morfología variada y de mayor profundidad que diámetro, pueden
ser abiertos (están en contacto con la superficie de la partícula) o cerrados (no hay contacto).
Se clasifican en microporos(diámetro menor a 20 Å), mesoporos (diámetro entre 20 y 500 Å) y
macro poros (diámetro mayor a 500 Å). La porosidad del relleno de la columna se encarga de
los fenómenos de exclusión y de la velocidad de la transferencia de masa de soluto entre la
fase móvil y la fase estacionaria. El diámetro del poro determina el área superficial (as(ext)=
6/ρxdp), que es el parámetro que determina la capacidad de retención de la fase estacionaria,
y los fenómenos estéricos de exclusión, ya que solo las moléculas que penetran los poros
participaran de los procesos separativos. En general, a menor diámetro de poro, mayor área
superficial y retención y el analito tendrá competo acceso a la superficie interna del poro si la
molécula tiene un tamaño menor o igual a 1/10 del diámetro del poro.

- Grietas: La partícula del relleno debe ser perfectamente esférica y con una superficie
totalmente uniforme, sin rugosidades ni grietas, gracias a ello el relleno es extremadamente
resistente. Es muy importante no permitir que el lecho (matriz empaquetada del relleno de la
columna) funcione en seco. De lo contrario, se desarrollan grietas y fisuras, cualquier grieta,
fisura, o canal en la columna de absorbente afecta adversamente el poder global de
separación de la misma. Estas grietas también pueden producirse gracias a que si se produce
un exceso de calor cuando la alumina o gel de sílice(relleno) entran en contacto con el
disolvente, se forman burbujas que generan grietas en el material absorbente.

2. Establezca las características de la silicagel molecularmente

3. Determine como se prepara la fase ligada de una columna cromatográfica

- La partícula de esta fase está compuesta por un material de base (silicagel, alumina o
agarosa, entre otras), que se une a un compuesto con un grupo funcional determinado. Dado
esto, hay diferentes tratamientos gracias a las diferentes características (estructura química,
reactividad y pureza), sin embargo, la mayor parte del material comercial está hecho de
silicagel que se ha unido covalentemente a un grupo funcional siloxano (partícula-Si-O-R). En
general, se tienen cuatro uniones del grupo funcional al silicagel:
1: Tipo éster (Si-O-R): fue previamente usada en cromatografía de gases y se da entre silanoles
y un alcohol, a partir la siguiente reacción:
Partícula-Si-OH + R-OH  Partícula-Si-OR + H2O
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2: Tipo amino (Si-NR2): Se prepara por la reacción de silicagel con cloruro de tionilo, y el
producto de dicha reacción con una amina, es más estable que la de tipo éster pero solo a un pH
ente 5 y 7, limitando a que no se utilice para motivos comerciales. Se da a partir de las siguientes
reacciones: Partícula-SiOH + SOCl2  Partícula-Si-Cl
Partícula-Si-Cl + HNR2  Partícula-Si- NR2 + H2O
3: Tipo carbono (Si-CR3): Se prepara en dos etapas: primero, halogenación del sillicagel con
cloruro de tionilo y luego se hace una reacción con el reactivo de Grignard (bromuro de naftil,
bencil o alquil magnesio)
4: Tipo siloxano (Si-O-SiR3): difusión casi total en rellenos de silicagel, se sintetiza por reacción
de silanoles de la silica con órgano-n-halo-silanos (clorosilanos, en especial), que pueden ser
mono, bi o trifuncionales(mayor reactividad), la reacción se puede efectuar en medio anhidro
formando una monocapa, o en presencia de agua que forma capas poliméricas con ni y tri-
clorosilanos, y monocapas con los monoclorosilanos.
Durante la silanizacion, proceso en el cual se maximiza la concentración superficial de los grupos
silanoles superficiales para aumentar la resistencia, la polimerización puede ser difícil de controlar,
así algunas partículas pueden contener capas poliméricas de mayor espesor que otras, lo que
resulta en diferencias en parámetros como velocidad de transferencia de masa del soluto y
capacidad de carga de la columna, por eso, son más utilizadas las capas monomericas, que se
forman por un ataque nucleofílico del oxígeno de hidroxilo de la silica al átomo de silicio del silano,
y se favorece el ataque agregando una base como piridina para retener el HCl liberado y catalizar
la formación de un intermediario previo al siloxano.
Los silanoles superficiales que no llegan a silanizarse producen mecanismos mixtos de retención,
fuerte retención de solutos polares, y picos asimétricos con solutos básicos, adsorciones
indeseadas y puede llegar a disminuir la vida útil de la columna, por lo tanto se debe completar la
salinización con moléculas grandes que dan lugar a rellenos de C8-C18, con una molécula más
pequeña como TMCS (trimeticlorosilano), este proceso puede completar la cobertura de la matriz,
pero aun así pueden quedar algunos grupos sin reaccionar.
La silanizacion se efectúa sobre los grupos silanoles accesibles con ácido clorhídrico, nítrico o
sulfúrico, o calcinación a 850 °C, luego se hace un tratamiento con ácido fluorhídrico para generar
nuevamente silanoles superficiales. La silicagel se suspende en un solvente como tolueno y se
calienta a reflujo con el clorosilano, y una amina (piridina) para retener el HCl y catalizar la
silanizacion como se mencionó anteriormente, luego de la silanizacion primaria se hace una
secundaria con TMCS, para completar el proceso, como ya se dijo, y se lava el producto final con
tolueno, metanol o acetona, y se seca.
4. Características y diferencias de la cromatografía de fase reversa y normal.

- Cromatografía de fase normal: Esta emplea fase estacionaria polar y una fase móvil no
polar, los materiales altamente polares e higroscópicos como la silicagel y la alumina
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favorecen el uso de la cromatografía de fase reversa, sin embargo, la selectividad de esta

última permite que la fase normal se utilice para problemas insolubles e hidrófobos, en donde
se utilizan materiales de fase ligada polares como diol, ciano, nitro amino, en orden de
polaridad, y fases móviles no polares. La mejor ventaja que aporta este método es que su
selectividad es única y estos rellenos tienen menor frecuencia de retenciones irreversibles,
menor influencia de agua y respuesta más rápida al cambio de solventes. Al igual que en fase
reversa, los rellenos deben contener grupos silanoles libres que dan lugar a retenciones
inespecíficas, que presentan tailing y picos mal definidos para solutos muy polares. Es un
método apropiado para la separación de solutos de polaridad mediana a alta, en especial,
para separar isómeros posicionales con sustituyentes polares, su mayor inconveniente es la
alta actividad del material del relleno que absorbe agua y solventes polares en su superficie.
- Materiales de relleno: se puede hacer sobre partículas totalmente porosas como la silicagel,
alumina u otros materiales de fase ligada, dependiendo de la naturaleza de la fase móvil, la
polaridad de los rellenos debe ser menor al silicagel o la alumina, por ejemplo, se puede
utilizar una columna de grupos cianos y una fase móvil de polaridad menor al grupo CN, y
dichos rellenos pueden responder a grupos ciano, diol, nitro y amino, aun así, como se ha
mencionado ya varias veces, los rellenos preferidos son el silicagel microporosa por su alto
poder de adsorción con tamaños de poro de 60 a 300 Å, en donde, en esta modalidad e
cromatografía, el proceso de retencion del analito está gobernado por los grupos hidroxilos
(silanol Si-OH) que están en la superficie del salice, además los grupos silanoles le dan
características de ácido débil, permitiendo que los analitos de carácter básico sean retenidos
más fuertemente que los neutros o los ácidos. La alumina posee un carácter anfótero que
permite la determinación de solutos de carácter ácido y básico, pero se deben evitar pHs
extremos que conduzcan a la disolución de la fase estacionaria y la retención obedece a
mecanismos basados en enlaces de hidrogeno, y a diferencia de la sílice, a mayor
temperatura (≃700° C) de tratamiento, mayor poder de retención.
- Fase móvil: Primero, debe ser no polar, y normalmente se utilizan mezclas de dos solventes,
uno de baja fuerza de elución y otro de mayor fuerza, así, variando las proporciones de los
solventes entre 0 y 100, se obtiene una alta gama de valores de elución, pueden tener valores
de fuerza cercanos o lejanos, aunque se debe tener en cuenta que un incremento en la fuerza
del solvente de unas 0,05 unidades disminuye k’ (factor de capacidad).
- Modificadores: sustancias de alta fuerza de elución que se agregan a la fase móvil, en
pequeña proporción, para disminuir los problemas de la cromatografía de fase normal, En
general, los modificadores cambian el comportamiento de la superficie, porque se adsorben
por su alta polaridad, sobre los sitios de fuerte retención que causan las irregularidades en el
comportamiento del sílice. El más utilizado es el agua y su concentración depende de su
solubilidad en el solvente elegido para la separación y aporta ventajas como: mejor variación
en la retención de los analitos de la muestra, aumento en la capacidad de carga de la
columna, mayor eficiencia y menor tailing y reducción de la tendencia del adsorbente a
catalizar las reacciones de los analitos durante la separación.