Microscopía óptica

El microscopio
 Microscopio óptico

Ocular Objetivo
Capta y amplía la Sistema de lentes
imagen formada en delgadas: proyecta una
el objetivo imagen real, aumentada
e invertida de la muestra

Condensador
Concentra los rayos
Diafragma luminosos sobre la
Regula cuanta luz preparación
llega al condensador

Fuente de luz
Ilumina la muestra

Aumento total = aumento objetivo  x  aumento ocular
Microscopio invertido
 Objetivos

Apertura numérica
Medida de la capacidad del
objetivo para recoger la luz
Aumento y resolver detalles finos de
Cuanto se va a la muestra
ampliar la imagen
luego de pasar por
el objetivo (10x,60x, Objetivo de Inmersión
100x) Los objetivos pueden ser
clasificados en secos o de
inmersión

Espesor del
cubreobjetos
 Apertura numérica

AN = n . sen (α)
n = índice de refracción α = ½ ángulo de
Es una medida de cuanto disminuye la apertura
velocidad de una onda al atravesar dicho
medio

n=1 Aire
n = 1.33 Agua
n = 1.515 Aceite/vidrio
Índice de refracción < Índice de refracción del
del aire aceite

AN (objetivo seco) < AN (objetivo de

inmersión)
 ¿Qué ocurre cuando utilizamos aceite de
inmersión?

Aire: debido a la refracción, gran Con aceite: índice de refracción

parte de la luz no llega al objetivo uniforme, la luz no cambia de ángulo.
Mucha mas luz llega al objetivo
 Resolución
La resolución (R) de un objetivo es la menor distancia entre dos puntos
del espécimen que pueden distinguirse como dos entidades separadas

d
d < R d > R Muestra

Imagen

Longitud de Onda
Apertura numérica A menor longitud de onda
A mayor apertura mejor resolución
numérica mejor
resolución

Cuanto menor es R, mejor la resolución

 Intensidad o brillo
(Apertura numérica)4
Intensidad =
(Magnificación)2

Por ejemplo:
10x 40x
AN = 0,25 AN = 0,6

(0,25)4 (0,6)4
= 3,9 x 10-5 = 8,1 x 10-5
(10)2 (40)2
 Tipos de microscopía

Campo claro
El campo claro es la forma más simple de microscopía donde la luz pasa a través de la
muestra o es reflejada del espécimen.
Las muestras deben ser delgadas.
Muchas veces se usan tinciones diferenciales.

Células MDCK
(línea células epiteliales)
 Tipos de microscopía
Contraste de Fases
Se basa en el retraso de las ondas de luz al atravesar objetos de distintos índices de
refracción (densidades), aprovechando y amplificando dichos retrasos.
Las regiones mas densas se ven mas oscuras que el fondo

Células MDCK
 Tipos de microscopía

Campo Claro Contraste de Fases

• No hay buen contraste con el fondo • Buen contraste de células con el fondo
• No se observan límites claros • Límites celulares evidentes (oscuros)
• No se distinguen estructuras internas • Se distinguen estructuras internas
 Tipos de microscopía
DIC (Microscopía de Contraste de Interferencia Diferencial)
Utiliza luz polarizada y prismas para exagerar los gradientes de índices de refracción
dentro de una muestra.

Las bicapas lipídicas producen un

buen contraste en DIC por la diferencia
de índice de refracción entre el medio
lipídico y el medio acuoso de la célula

Glóbulos rojos Células HeLa

 ¿Qué objetivo usar?
• ¿Queremos ver muchas células en un mismo
campo o detalles en una célula?
→ Magnificación: 10x, 40x, 100x

• Para una misma magnificación ¿Qué apertura

numérica elegir?
→ Cuanto mayor es AN, mejor es la resolución

• ¿Campo claro, contraste de fase, DIC?

Depende las posibilidades de cada objetivo/microscopio
 Tipos de microscopía

Microscopía de Fluorescencia
Se basa en la detección de proteínas o estructuras marcadas o que
son intrínsecamente fluorescentes.

¿Qué ventajas introduce la microscopía de fluorescencia?

- Especificidad
- Contraste
- In vivo
- Desde microorganismos a mamíferos

En el TP…
-Expresión de proteínas de fusión fluorescente (GFP o mCherry)
-Anticuerpos o toxinas conjugados a fluorocromos
-DAPI (tiñe ADN)
 Fuente de Iluminación
Para excitar la fluorescencia de un
fluorocromo se necesita una fuente de luz
intensa que suministre las longitudes de
excitación del fluorocromo en uso.

-Lámpara de Mercurio

-Diodo emisor de luz (LED)

-Láseres (para microscopia de confocal)

CUBO DE FILTROS DE  Filtro de emisión:
FLUORESCENCIA Determina que rangos de longitudes de 
onda llegan al detector

Detector Deja pasar luz entre 
520‐560 nm

Espejo dicroico: Fuente de
Refleja luz de λ baja iluminación
Transmite luz de λ alta

λ=510 nm
Objetivo Filtro de excitación:
Determina que rango de longitud de 
onda va a incidir en la muestra

Deja pasar luz entre 
450‐490 nm
http://www.microscopyu.com/tutorials/spectralprofiles
 Tipos de microscopía de fluorescencia
“Campo amplio” vs
confocal:
La configuración del
microscopio confocal permite
iluminar un volumen menor.
Solo llega al detector la luz
emitida en el plano que está
en foco.
 Microscopía de fluorescencia confocal

Al eliminar la fluorescencia proveniente de planos fuera de foco se

pueden ver más detalles en la muestra
 Microscopía de fluorescencia confocal
Se puede realizar una serie de
secciones ópticas en el eje z

Se pueden realizar
representaciones en 3D

Podemos determinar si la localización de dos proteínas

coincide dentro de una sección óptica → COLOCALIZACIÓN
Cámaras: CCD (Charged Coupled Device)
Las cámaras CCD capturan la luz y la convierten en data digital.

La resolución de una cámara depende

del tamaño y número de pixeles del chip
¿Cómo pasamos de intensidad de luz
a data digital?
 Profundidad de bits
• Un bit es la unidad mínima de
capacidad de información que utiliza
una computadora
• El número de niveles en la escala de
gris (profundidad de bits) está
determinado por la cantidad de bits

Niveles = 2 n bits
• Ejemplo: si un pixel de una imagen
bitmap tiene 8 bits de profundidad de
color, entonces podrá tomar hasta 256
colores
28 = 256

MÁS BITS NOS PERMITEN DETECTAR 
MAS DETALLES
 Para consultar:

• http://www.microscopyu.com/
• http://www.olympusmicro.com/
• http://zeiss‐campus.magnet.fsu.edu/