INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA EN SISTEMAS AMBIENTALES

PRÁCTICA 8

“REACCIONES DE CARBOHIDRATOS”
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

EQUIPO NO. 1 SECCION: 1 Grupo: 4AV1

 Alcántara Campos Daniel

 Aparicio Almazán Brenda Guadalupe

PROFESOR(ES):

 QFI Roció del Carmen Guzmán Ibarra

 M. en C. Pedro Antonio Loyola Abitia
 Dra. Doris Neri Cortés
 Dr. Carlos Wong Baeza

FECHA DE REALIZACIÓN: 08 de mayo del 2018

FECHA DE ENTREGA: 17 de mayo del 2018

INTRODUCCIÓN.

Las oxidaciones biológicas son de gran importancia en el manejo de la energía de las células. Se entiende por
reacciones de óxido - reducción como la transferencia de uno o más electrones de una molécula a otra. Las
grandes cantidades de energía que liberan las oxidaciones biológicas constituyen la principal fuente de energía
disponible para el trabajo de las células que llevan a cabo funciones respiratorias. ATP es el portador
intermediario de energía entre las oxidaciones biológicas que la liberan y los diversos sistemas que la utilizan.
Las reacciones de óxido-reducción, llevadas a cabo por la célula son catalizadas por enzimas que actúan como
intermediarios hasta llegar al aceptor final de electrones. Ciertas sustancias tienen color en su variedad oxidasa
y son incoloras en su variedad reducida, algunos de estos colorantes reaccionan con facilidad con los sistemas
biológicos de óxido reducción, un ejemplo de esto es el azul de metileno que funciona como indicador.

La deshidrogenasa láctica (LDH) es una enzima capaz de "acelerar" una reacción química que se encuentra en
casi todos los tejidos del cuerpo. La LDH está principalmente involucrada en la producción de energía en las
células, lo que explica su amplia distribución. Por otro lado la deshidrogenasa láctica (DHL), es una proteína
enzimática que actúa sobre piruvatos y lactatos con una interconversión del dinucleótido de adenina-
nicotinamida (DAN), así como de su forma reducida: DANH. Normalmente, hay cinco isoenzimas de la
deshidrogenasa láctica presentes en células vivas y conformadas por la combinación entre polipéptidos-M y
polipéptidos H.

El incremento de la DHL refleja varios fenómenos tales como: actividad osteoblástica, hemolisis, daño y
necrosis celular, proliferación neoplástica, etc.

La deshidrogenasa succínica es una enzima especial de la mitocondria, porque participa en dos procesos
metabólicos a la vez, el ciclo de Krebs y la cadena de transporte electrónico. En el ciclo de Krebs, la enzima
convierte en fumarato en presencia de FAD como coenzima. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido
del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de
coloreado a incoloro o viceversa Con este cambio del indicador redox se comprueba que la enzima está
transformando el sustrato.

El citocromo oxidasa es última enzima de la cadena de transporte de electrones respiratoria de las

mitocondrias situado en la membrana mitocondrial. Se recibe un electrón de cada uno de cuatro moléculas de
citocromo c, y los transfiere a una molécula de oxígeno, la conversión de oxígeno molecular a dos moléculas de
agua, constituye lo que se conoce como complejo 4 de la cadena de transporte electrónico y está presente en
todos los organismos aerobios (es decir que utilizan el oxígeno como aceptor de electrones). En el proceso, se
une cuatro protones desde la fase acuosa interna para hacer que el agua, y además translocaliza cuatro
protones a través de la membrana, ayudando a establecer una diferencia de protones transmembrana
potencial electroquímico que la ATP sintasa usa entonces para sintetizar ATP.

Fig.1. Estructura de carbohidratos. Sacarosa y lactosa.

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 1

OBJETIVO GENERAL.

Realizar una serie de experimentos en los que se pondrá de manifiesto la actividad de algunas enzimas que
participan en reacciones de óxido reducción, la importancia de los cofactores y el efecto de algunos
inhibidores.

OBJETIVOS PARTICULARES.

 Observar la actividad de la enzima LDH y poner de manifiesto las reacciones oxido-reducción en donde
participa.
 Observar la actividad de la enzima SDH y poner de manifiesto las reacciones oxido-reducción en donde
participa.
 Observar y poner de manifiesto las reacciones oxido-reducción en donde participan los citocromos.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN.

En el desarrollo de esta práctica se realizaron diferentes ensayos cualitativos(determinación de la actividad de

la deshidrogenasa láctica (LDH), determinación de la actividad de la deshidrogenada succínica (SDH) y
determinación de la actividad del citocromo C y citocromo oxidasa con objetivo de identificar las reacciones
oxido-reducción presentes en muestras de coenzima NAD+, LDH, SDH Y citocromo oxidasa.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA DESHIDROGENASA

LACTICA (LDH).

Para esta prueba se usaron 4 tubos de ensayo cada uno con ausencia o presencia de lactato, agua, NAD+, LDH y
se adicionaron 3 gotas de azul de metileno, se mezcló y agrego una ligera capa de aceite vegetal;
posteriormente se incubo a baño maría a 37°C. Se observó el cambio de color a los tiempos indicados.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos.

Tabla 1. Determinación de la actividad de la LDH.

TUBO 1 2 3 4

2min. + + + -

5min. ++ + +
-

7min. +++ ++ ++ -

10min. ++++ ++ +++ -

15min. ++++ ++ +++ -

Fig.2. el signo + se refiere a la intensidad de decoloración del tubo de ensaye.

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 2

En la tabla 1 podemos observar que en el tubo d
ensayo 1 la reacción se lleva a cabo en
condiciones normales por que no se alteró
ningún parámetro, en el 2 la reacción no se lleva
a cabo por que no hay coenzima (NAD+),
impidiendo el intercambio de electro y sin
formación de piruvato sin embargo se observa
decoloración, esta se atribuye a que el extracto
crudo elaborado para obtener LDH no se hirvió y
contenía residuos de NAD+. En el 3 se observa
reacción aunque no se adiciono lactato 1%
probablemente porque el extracto crudo LDH- Fig.3. Reacción catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa.
NAD+ contenía residuos del sustrato, se observa
mayor decoloración que en el tubo 2; en el tubo 4, la reacción no se lleva a cabo por que no hay
residuos de LDH en el extracto crudo ya que se hirvió para obtener la coenzima NAD+ utilizada y no
se activó la reacción por ausencia de LDH.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA DESHIDROGENASA

SUCCINICA (SDH).

Para esta prueba se usó una serie de 7 tubos de ensayo cada uno con ausencia o presencia de succinato de
sodio 0.1M, malonato de sodio, agua, SDH-CIT y se adicionaron 3 gotas de azul de metileno, se mezcló y
agrego una ligera capa de aceite vegetal; posteriormente se incubo a baño maría a 37°C. Se observó el cambio
de color a los tiempos indicados.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos.

Tabla 2. Determinación de la actividad de la deshidrogenasa succínica.

TUBO 1 2 3 4 5 6 7

2min. + - - - - - -

5min. ++ - -
-
- - -

7min. ++ - - + + + +

10min. ++++ - + + ++ ++ ++

+++
15min. ++++++ - + + ++ +++

30min +++++++ - + ++ +++ ++++ ++++

Ya no estaban en baño maría

1:20 min. solo los tubos 4, 5, 6 y 7.
++ +++ ++++ ++++++

Fig.4. el signo + se refiere a la intensidad de decoloración del tubo de ensaye.

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 3

 En la tabla 2 podemos observar que nuestro tubo 1 al no
tener malonato de sodio que actuaba como inhibidor de
la enzima (SDH-CIT) la reacción se llevo a cabo de manera
natural, es decir se observó completa decoloración a las
30 min de la incubación, este tubo fue el que presento
mayor descoloración en menor tiempo, debido a que no
contenía inhibidor, al no contener inhibidor el tiempo de
reacción es menor y la coloración por lo tanto aparecerá
Fig.5.Reaccion de succinato deshidrogenasa. más rápidamente. En nuestro tubo 2 se mantuvo el color
azul fuerte, debido a que no se adiciono la enzima (SDH-
CIT), no hubo reacción porque solo había sustrato así que el azul de metileno se mantuvo en su coloración
original, se tomó como tubo testigo. Se observa un ligero cambio en la coloración indicando que se llevó a cabo
la reacción aunque no se añadiera sustrato (Succinato de sodio) esto se atribuye porque aunque solo contenía
enzima, el extracto de donde se tomó contenía residuos de sustrato. En los tubos 4, 5, 6, y 7 se analizó el efecto
del inhibidor competitivo malonato de sodio, en el tubo 4 se añadió 1ml de malonato, por lo tanto la reacción
fue casi nula.se observó una decoloración leve. En el tubo 5 la cantidad de inhibidor fue menor (0.5 ml)
respecto al tubo 4, por lo tanto la reacción se llevó a cabo en menor tiempo, se presentó una mayor
decoloración. En el tubo 6 al tener menor cantidad que los tubos pasados (0.25ml), se observó la reacción es
decir se presentó mayor descoloración. La cantidad de inhibidor fue la misma que el tubo 6 (0.25ml), pero la
cantidad de sustrato aumento (1ml), la velocidad de reacción fue menor, y se obtuvo una decoloración
completa como el tubo 1 pero a la hora con 20 min.

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DEL CITOCROMO C Y CITOCROMO

OXIDASA.

Para esta prueba se usó una serie de 8 tubos de ensayo cada uno con ausencia o presencia de KCN, α naftol,
agua, SDH-CIT y posteriormente se adicionó p-fenilen diamina a excepción del tubo 3l; se incubo a baño maría
a 37°C. Se observó el cambio de color a los tiempos indicados.

A continuación, se muestran los resultados obtenidos.

Tabla 3. Determinación de la actividad del citocromo C y citocromo oxidasa.

TUBO 1 2 3 4 5 6 7

0 min. incoloro durazno carne durazno incoloro carne blanquecino

1 min. + - - ++ + - +

2 min. + -- - +++ ++ - ++

4 min. ++ -- + ++++ +++ -- ++

uva- Carne Rosa palo

5 min. durazno carne violeta
morado pálido
Fig.6. el signo + o - se refiere a la intensidad en el cambio de coloración del tubo de ensaye.

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 4

 Fig.7 .Reacción de p-fenilendiamina con el citocromo C.

En la tabla 3 se muestra que en nuestro tubo 1 en su forma inicial se observó incoloro ya que solo contenía
agua, posteriormente cambio a durazno por la presencia de p-fenilendiamina pero no hubo reacción. En el
tubo 2 se presentó una coloración durazno, no había presencia de α-naftol, por lo tanto la p-fenilen diamina
no se logró oxidar, debito a esto se presenta dicha coloración. En el tubo 3 no se presentó cambio de
coloración se mantuvo un color salmón constante durante toda la reacción, esto es porque no se oxido nuestra
enzima., ya que contenía solo a la enzima. En nuestro 4 tubo se añadió el alfa naftol y todos los demás
reactivos necesarios para la reacción, esto ocasionó que inicialmente se tuviera una pigmentación durazno y al
paso de 5 minutos se observó que nuestra muestra viró a color uva-morado, debido a la oxidación de p-fenilen
diamina en presencia de α-naftol, el desarrollo de color fue rápido debido a que no contenía inhibidor. Este
tuvo se utilizó como testigo positivo. En el tubo 5 no se contó con la enzima, pero se tenía el α-naftol y p-
fenilen diamina, por lo que nuestra reacción tuvo un color violeta. En el tubo 6 El cambio de color fue lento,
debido a la presencia de inhibidor KCN por lo que no hubo actividad enzimática, y en toda la reacción se
mantuvo un color carne de forma constante. En el tubo 7 se añadió el inhibidor pero no se añadió la enzima
por lo que reaccionó con el p-fenilendiamina y al final de la reacción se observó un color rosa pálido.

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 5

CONCLUSIONES.

 El malonato de sodio es un inhibidor de tipo competitivo, por lo que inhibe a la enzima SDH.
 El FAD y el NAD aportan de electrones a la cadena respiratoria.
 La p-fenilén diamina se usó como sustituto de FAD y NAD
 El KCN es inhibidor de la cadena respiratoria, por tanto cuando se aplicó esta sustancia, no se observó
reacción.
 Las enzimas oxidor-reductasas Deshidrogenasa Succínica y Citocromo Oxidasa son de gran importancia
para que se lleven a cabo el Ciclo de Krebs y la Cadena de Transporte de Electrones (o Fosforilación
Oxidativa). Ambos procesos nos proveen de ATP para energía y ambas forman parte de la respiración
celular en las células aerobias. En el hombre, estos procesos se llevan a cabo en la mitocondria,
específicamente en membrana interna mitocondrial.
 El indicador azul de metileno sufre una reacción oxido reducción, presenta coloración azul en fase
oxidativa, y es incoloro al estar reducido.
 La p-fenil diamina se oxida en presencia de - naftol.
 A mayor concentración de sustrato, la reacción se lleva en menor tiempo.
 A mayor concentración de inhibidor la reacción se presentara a mayor tiempo.

BIBLIOGRAFÍA.

Donal Voet “Fundamentos de bioquímica” 2a edición. Editorial Panamericana. China (2007) pp. 394

Lehninger “bioquímica” 2a edición. Editoriales Omega. Barcelona (1986) pp. 235, 238

George Rendina “Tecnicas de bioquímica aplicada” 1a edición. Nueva Editorial Interamericana

México (1974) pp 110-114

Equipo 1. Reacciones enzimática de óxido-reducción. Página 6