Traducción del articulo

Producción de pigmento de Monascus purpureus en residuos de

uva mediante diseño factorial.
Resumen.
Producción del pigmento de Monascus purpureus en fermentación sumergida con
residuos de uva como sustrato de crecimiento se ha optimizado empleando técnicas de
superficie de respuesta y diseño factorial.Las variables evaluadas fueron las
concentraciones de residuos de uva como fuente de carbono, peptona y glutamato
monosódico, teniendo como producción de pigmentos de respuesta.La concentración de
peptona fue la variable más importante para la producción de pigmento.La adición de
glutamato dio lugar a un importante aumento de la producción de pigmento de
Monascus, pero sólo combinado con las concentraciones de peptona alta.La región
óptima para la producción de pigmento es alrededor 20-22.5 g/l de peptona en cualquier
concentración de residuos uva.La utilización de residuos agroindustriales para la
producción de pigmento puede representar un valor añadido a la industria y de una
manera respetuosa del medio ambiente para la gestión de los residuos.

Introducción.
Pigmentos de Monascus son un grupo de metabolitos fúngicos llamado azaphilones, que
son sintetizados del polyketide cromóforos y b-ceto ácidos por esterificación (Juzlova´,
Martı´nkova´ y Kren, 1996).Se conocen al menos seis estructuras moleculares:
rubropunctatin, monascorubrin, rubropunctamine, monascorubramine, monascine y
ankaflavine (Pastrana, Blane, Santerre, Loret y Goma, 1995).Algunos de los compuestos
son aplicables como aditivos alimentarios o fármacos (Kraiak et al., 2000).Este hongo
filamentoso se aprovecha también para producir moléculas tales como antibióticos,
enzimas, ácidos orgánicos (Hajjaj et al., 2000).Hay un creciente interés en los pigmentos
naturales para reemplazar algunos colorantes sintéticos utilizados actualmente, ya que
estos últimos han sido asociados con efectos tóxicos en los alimentos (Mapari et al.,
2005).El pigmento rojo del hongo Monascus es ampliamente utilizado en Asia durante
siglos como un colorante de alimentos (Lee, Chen, Chauvatcharin, Seki y Yoshida, 1995;
Kim, Kim, Oh y Shin, 2002).
Nuevas aplicaciones de alimentos, como la coloración de salchicha, jamón, surimi y
tomate ketchup, fueron descritos (Dufosse´ et al., 2005).A pesar de este pigmento ha sido
un ingrediente alimentario de larga data para los consumidores asiáticos, está aún
prohibido en Europa y América.Sin embargo, hay un número de patentes registradas en
los últimos años en Japón, Estados Unidos, Francia y Alemania informes la obtención y uso
de Monascus como pigmento del alimento.Pigmento de Monascus fermentaciones se han
realizado principalmente en cultivos sólidos (Johns y Stuart, 1991), sin embargo los
rendimientos han sido demasiado bajos para permitir la producción a escala industrial
(Kim et al., 2002).Varios factores pueden influir en la producción de pigmento de
Monascus: ambientes gaseosos (Hamdi, Blanc y Goma, 1996), agitación y aireación (Hajjaj
et al., 2000), fuente de carbono y nitrógeno (Pastrana et al., 1995) se han divulgado como
parámetros que fuertemente influencia el crecimiento y producción de metabolito
secundario.
Se han realizado trabajos previos sobre la fermentación de pigmento con '' one-factor-at-
a-time-technique''.Este acercamiento convencional con frecuencia no logra localizar las
condiciones óptimas debido a su incapacidad para mostrar claramente los posibles efectos
de las interacciones entre los parámetros (Kalil, Maugeri y Rodrigues, 2000).Técnicas
superficiales respuesta y diseño factoriales son herramientas importantes para determinar
las condiciones de proceso óptimas.Esta metodología se ha utilizado con éxito en muchas
áreas de la biotecnología, particularmente para optimizar la producción de moléculas
bioactivas (CladeraOlivera, Caron y Brandelli, 2004; Thys, Guzzon, CladeraOlivera y
Brandelli, 2006).Aunque la producción de pigmento por Monascus spp.in químicamente
definida media está bien documentada, muy poca información está disponible sobre el
uso de residuos agroindustriales.Durante nuestros primeros experimentos en el Monascus
purpureus crecimiento utilizando subproductos de la agroindustria, residuos de uva de
vino fue demostrado para ser un buen substrato para la producción de pigmento
rojo.Residuos de la industria del vino podrían ser un sustrato alternativo para la
fermentación de Monascus, asequible y barato.Este trabajo reporta la producción de
pigmento por M.purpureus en cultivos sumergidos utilizando trituradores de residuos de
las industrias del vino como fuente de carbono.Las concentraciones de factores de
residuos de uva, peptona y glutamato monosódico (MSG) se evaluaron mediante análisis
superficial respuesta y diseño factorial, para establecer las condiciones óptimas para la
producción de pigmento.

Material y métodos.

2.1 Microorganismos, medios de cultivo y las condiciones

El microorganismo utilizado en este estudio fue M.purpureus NRRL1992.Culturas stock se

mantuvo en placas de agar Sabouraud dextrosa y subcultivo periódicamente.Culturas
reactivado mediante la transferencia en frescas placas de Sabouraud y se cultivan en 30 1
para 8 – 12 días fueron utilizadas para la preparación del inóculo.Los medios de cultivo
sumergidos figuran las fuentes de carbono y nitrógeno (como se especifica a continuación)
y en g/l: K2HPO4 (5.0), KH2PO4 (5.0), MgSO4 7H2O (0.01), CaCl2 (0.01) y ZnSO4 7H2O
(0.01).El pH inicial del medio se ajustó a 6.0.Erlenmeyer se inocularon frascos (125 ml) que
contiene 25 ml de medio con 250 ml de una suspensión de micelio, presencia de esporas
(en una solución estéril de NaCl 0,85%) con un O.D.620 de aproximadamente 0,4.Los
matraces se incubaron a 2573 1 por 9 días en un agitador rotatorio a 100 rpm.La
concentración de pigmento rojo extracelular se estimó midiendo la absorbencia de
líquidos filtrados a 500 nm, considerar el factor de dilución.

2.2 Selección de sustratos de crecimiento

Para la selección del mejor sustrato para la producción de pigmento, varios sustratos de
crecimiento complejos (uva residuos de la industria del vino, residuo fibroso industriales
de soja, salvado de soja, cáscaras de arroz, harina de plumas de queso y suero en polvo)
fueron probados individualmente en 30 g/l.

En el medio mínimo mineral que contiene peptona 10 g/l.Cultivo se desarrolló como se

describió anteriormente. El uva residuo se compone de semillas de uva y cáscara secada y
homogeneizada en un polvo fino.

2.3 Optimización del medio de cultivo

La influencia de las concentraciones de sustrato de carbón, peptona y MSG en la

producción de pigmento se evaluó mediante un diseño factorial (23) con tres repeticiones
en los puntos centrales, que significa que un total de 11 funciona (Box, Hunter & Hunter,
1978).En el modelo estadístico, las variables codificadas se definieron como sigue:
carbono sustrato (X1), peptona (X2) y MSG (X3), la variable dependiente es la producción
de pigmento (Y).La tabla 1 muestra las tres variables independientes y sus
concentraciones en los distintos niveles codificados de los experimentos del diseño
factorial, así como la respuesta evaluada.

La influencia de las concentraciones de residuos de uva y peptona en la producción de

pigmento se evaluó mediante un diseño factorial (22) además de configuración de la
estrella con tres repeticiones en los puntos centrales, que significa un total de 11 funciona
(Myers & Montgomery, 2002).En el modelo estadístico, las variables codificadas se
definieron como sigue: uva residuos (X1) y peptona (X2), la variable dependiente es la
producción de pigmento (Y).La tabla 2 muestra las dos variables independientes y sus
concentraciones en los distintos niveles codificados de los experimentos del diseño
factorial, así como la respuesta evaluada.

El software Statistica versión 5.0 (Statsoft Inc., USA) fue utilizado para el análisis de
regresión de los datos experimentales obtenidos.La calidad de ajuste de la ecuación del
modelo de primer orden fue expresada por el coeficiente de determinación R2, y su
significación estadística se determinó mediante la prueba F.Tres repeticiones en los
puntos centrales fueron utilizados para estimar el error experimental y para permitir la
comprobación de la adecuación del modelo de primer orden.
Resultados y discusión.

3.1 Selección de sustratos de crecimiento

M.purpureus fue crecido en varios subproductos. Entre los medios de prueba, la cantidad
de pigmento de mayor producción de hongo residuos de uva, seguido de salvado de
soja.Se observó baja pigmentación en residuo industrial soja fibrosa, cáscaras de arroz y
queso de suero (datos no mostrados).La utilización de residuos agroindustriales como
sustrato de crecimiento puede representar un valor añadido a la industria y cumple con la
creciente conciencia para la conservación de la energía.Sin embargo, algunos intentos de
producir pigmentos de Monascus de distintos granos de arroz o medios sintéticos han sido
descritos (Pastrana et al., 1995; Materia y Luchese, 1998).El arroz quebrado '' canjica''
(materia y Luchese, 1998) y el efluente libre de gluten de trigo molienda
(Domı´nguezEspinosa y Webb, 2003) han sido utilizados para la producción de pigmento
por M.purpureus, así La cepa 94-25 produce pigmentos y productos biológicamente
activos cuando se cultiva en un medio de cultivo basado en trituradores de residuos de la
industria de la leche (Kujumdzieva, Hallet & sabor, 1997).En este trabajo, también se
observó la producción de pigmento durante el cultivo en suero de queso, pero en
cantidades menores de residuos de uva.

3.2 Efecto de los componentes del medio en la producción de pigmento

En el presente estudio, utilizando uva residuos de industria del vino como fuente de
carbono, peptona y MSG como fuente de nitrógeno, el pigmento más alto rendimiento de
M.purpureus fue observada en medio que contiene 50 g/l de residuos de uva, 20 g/l de
peptona y 5.0 g/l de MSG.Las condiciones experimentales y los resultados de la
producción de pigmento (Y) para el diseño factorial se muestran en la tabla 1.El
rendimiento del proceso fue medido por esta respuesta.La producción de pigmento varió
de 0.29 UA500 (carrera 1) a 9.34 UA500 (carrera 8). En el presente estudio, utilizando uva
residuos de industria del vino como fuente de carbono, peptona y MSG como fuente de
nitrógeno, el pigmento más alto rendimiento de M.purpureus fue observada en medio
que contiene 50 g/l de residuos de uva, 20 g/l de peptona y 5.0 g/l de MSG.Las
condiciones experimentales y los resultados de la producción de pigmento (Y) para el
diseño factorial se muestran en la tabla 1.El rendimiento del proceso fue medido por esta
respuesta.La producción de pigmento varió de 0.29 UA500 (corrida 1) a 9.34 UA500
(corrida 8).
Tanto el t-test y valor de P parámetros estadísticos fueron utilizados para confirmar la
importancia de los factores estudiados.Los resultados obtenidos en este trabajo
demostraron que la producción de pigmento fue afectada más significativamente por la
concentración de peptona (Po0.01).Concentración de peptona alta promueve un aumento
en la producción de pigmento extracelular, probablemente debido a la reacción con los
compuestos que contienen el grupo aminos en el medio para formar complejos solubles
en agua (Pastrana et al., 1995).El cambio de la concentración de peptona del 1.0 a 20 g/l
exhibió una influencia positiva resultando en un incremento de la producción de pigmento
de Monascus, en promedio, 7,56 UA500.Los efectos de MSG también presentaron una
influencia positiva (Po0.05), el cambio de esta variable de la baja (1) a nivel alto ( 1)
promovió un incremento en la producción de pigmento, en promedio, 1.07 UA500

Sin embargo, el efecto de la concentración de residuos de uva no fue estadísticamente

significativo a un nivel de confianza del 95%, indicando que las concentraciones más bajas
fueron suficientes para que el metabolismo del microorganismo.En concentraciones más
altas de residuos uva, disminuyó la producción de pigmentos, probablemente debido a la
tensión de esquileo creado por la disminución de oxígeno en el medio.Presión parcial de
oxígeno baja fue encontrada para inhibir la producción de pigmento de Monascus en
estado sólido (Han y Mudgett, 1992) y las culturas sumergidas (Lee Lim, Ng y Chen,
1994).Las interacciones entre los factores no fueron estadísticamente significativas a un
nivel de confianza del 95%

Para construir un modelo de primer orden que puede predecir la producción de pigmento
(variable dependiente) en función de la fuente de carbono, peptona y las concentraciones
de glutamato monosódico (variables independientes), el análisis de varianza (ANOVA) fue
utilizada para evaluar la suficiencia de ajuste.Los coeficientes de regresión para la
producción de pigmento por M.purpureus en cultivos sumergidos se muestran en la tabla
3.Cuanto mayor sea la magnitud del valor de t y menor el P-valor, más significativo es el
coeficiente correspondiente (Myers & Montgomery, 2002).Sobre la base del ANOVA, se
estableció Eq.(1), que describe la producción del pigmento en función de variables
independientes:
y como la producción de pigmento (respuesta), X2 como concentración de peptona y X3
como la concentración de glutamato (valores codificados).
El error puro fue muy bajo, lo que indica buena precisión de los datos
experimentales.Basado en la prueba de F, el modelo es predictivo, puesto que su valor
calculado de F (F ¼ 126,9) es mucho mayor que el valor F crítico (F0.95, 2.8 ¼ 4.46).El
ajuste del modelo fue comprobado por el coeficiente de determinación R2, que se calculó
en 0,87, lo que indica que el 87% de la variabilidad en la respuesta podía ser explicado por
el modelo.El modelo de código se utilizó para generar la superficie de respuesta para la
producción del pigmento en función de peptona y MSG (Fig.1). Cuando MSG fue agregado
en los niveles superiores combinados con concentraciones de peptona baja, logró la
producción de pigmento más pobre De estos resultados se hizo evidente que la
concentración de peptona es el principal factor que influyen en la producción de pigmento
máximo.Luego se desarrolló un diseño factorial completo 22 para investigar el efecto de
cantidades peptona aumento en la producción de pigmento.Usando uvas residuos de
industria del vino como fuente de carbono y peptona como fuente de nitrógeno, la
producción más alta de pigmento de M.purpureus se observó en medio conteniendo 5 g/l
de residuos de uva y 22,5 g/l de peptona.Las condiciones experimentales y los resultados
de la producción de pigmento (Y) para el diseño factorial se muestran en la tabla 2.El
rendimiento del proceso fue medido por esta respuesta.

Análisis estadístico de los resultados mostró que, en el rango estudiado, la producción de

pigmento fue afectada significativamente por la concentración de peptona.Los efectos
lineales y cuadráticos de la concentración de peptona tienen valores de P de 0,077 y
0,036, respectivamente.El cambio de concentración de peptona del 10
 a 35 g/l exhibió una influencia positiva resultando en un incremento de la producción de
pigmento de Monascus, en promedio, 1,09 UA500.Sin embargo, la concentración de
peptona por encima de este rango conduce a una disminución en la producción de
pigmento.Este resultado es interesante porque hace posible trabajar con cantidades más
pequeñas de peptona para llegar a la producción de pigmento similar.El efecto de la
concentración de residuos de uva y la interacción entre los dos factores no fueron
estadísticamente significativas a un nivel de confianza del 95%.

Prueba F ANOVA y de Fischer demostró el valor de F ¼, 9.05, que es aproximadamente

tres veces mayor que el F tabulado (F0.90, 2.8 ¼ 3.11), y que demuestra el signifi-cado
para el modelo de regresión.Se obtuvo la siguiente ecuación de regresión, con un valor de
R2 de 0.83:

y como pigmento producción y X2 como concentración de peptona (valores codificados).El

significado de cada coeficiente se determinó mediante t-test y los valores de P, que se
enumeran en la tabla 4 del estudiante.El modelo de código se utilizó para generar la
superficie de respuesta para la producción de pigmento en función de la concentración de
residuos y peptona uva (Fig.2). Para cualquier concentración de residuos uva evaluada, la
concentración de peptona presenta una influencia positiva en el intervalo varía de 20 a
22,5 g/l.Sin embargo, por encima de esta concentración, se observó una disminución en la
producción de pigmento

Adición de 0.1g/l MSG a medios de comunicación que contiene residuos de 5 g/l uva y
peptona 22,5 g/l resultó en un juego UA500 de 9.06, sugiriendo que el MSG era
importante para la producción de pigmento creciente.Sin embargo, los niveles superiores
(5 g/l) combinados con las concentraciones de peptona baja no dio lugar a la producción
de pigmento máximo (Fig.1). Biosíntesis del pigmento de Monascus spp.appears estar bajo
regulación compleja (Hajjaj et al., 2000) y fuente de nitrógeno puede tener un papel
importante en la producción de pigmento máximo.MSG fue utilizado como la fuente única
de nitrógeno para la producción de pigmento de Monascus ruber; sin embargo, el máximo
de UA480 no se observó aumento de la relación nitrógeno/carbono, sugiriendo que el
requisito bajo de MSG necesita la investigación adicional (Pastrana et al.,
1995).Producción de pigmento rojo de M.purpureus C322 en medio con NH4Cl como
fuente de nitrógeno fue superior doblez 6
en comparación con MSG (Fenice, Federici, Selbmann & Petruccioli, 2000). En este
trabajo, la producción de pigmento en la concentración de peptona 20-22.5 g/l y uva de
residuos de 5 resultados de 30 g/l en el juego UA500 de 5.0 y podrían alcanzar 9.0 UA500
con adición de 0.1g/l MSG.

4. conclusión.
El presente trabajo describe las condiciones para la producción de pigmentos por
M.purpureus en cultivos sumergidos utilizando un residuo agroindustrial. Las condiciones
establecidas para la producción de pigmento por M.purpureus utilizaban 20-22.5 g/l de
residuos de uva y peptona como fuente de carbono de 5 a 30 g/l, lo que resulta en juego
UA500 de 5.0.La adición de MSG dio lugar a un importante aumento de la producción de
pigmento.Residuos de la industria del vino, que está altamente disponible en el sur de
Brasil, es una posible fuente alternativa para la producción de pigmento por M.purpureus.