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El objetivo de esta presentación es definir lo que para nosotros hoy, se entiende como
BIOTECNOLOGÍA y lo que significa la BIOTECNOLOGÍA INDUSTRIAL.
No nos parece que sea imprescindible transcribir aquí, todas las propuestas de “definición”
de lo que se debe entender por Biotecnología. Algunas de ellas serán suficientes para que
sea posible alcanzar nuestro objetivo.
Iniciaremos con la propuesta que el Prof. Antonio Paes de Carvalho, en su trabajo titulado
“Patentes para la Biotecnología”, presentó en diciembre de 1993, en una reunión realizada
en la Academia Brasilera de Ciencias:
El objetivo del siguiente apunte, una recopilación y resumen de varios autores, es aportar
las herramientas teóricas necesarias que permitan al ingeniero integrarse y desarrollar
sus funciones en cualquier proceso biotecnológico ya sea en la industria como en la
investigación aplicada.
1. BIOMOLÉCULAS
1.1 AGUA
Componente mayoritario en los seres vivos (80%)
En la naturaleza puede estar asociada de dos maneras:
• Agua Libre: solvente de solutos y dispersante de sistemas coloidales (95%)
• Agua Ligada; unida a otras moléculas (5%). No disponible para funciones vitales.
Todos los organismos necesitan de agua para vivir. La cantidad de ella en diferentes
ambientes varía; pero su disponibilidad no depende solo de su presencia o contenido, sino
que es una función compleja de factores de adsorción y solución. El agua adsorbida a la
superficie puede estar o no disponible, dependiendo de cuán íntimamente esté adsorbida y
cuán efectivo sea el microorganismo para tomarla. Además, cuando los solutos se disuelven
en el agua quedan más o menos hidratados, y el grado en que un soluto se hidrata afecta la
disponibilidad de agua para los organismos. Existen diferentes formas en que la
disponibilidad de agua puede expresarse lo cual refleja las influencias de los factores de
adsorción y solución, pero la forma más simple de comprender es la Actividad de agua (aw):
se relaciona con la presión de vapor de agua en el aire sobre una solución o sustancia y se
estima determinando la humedad relativa de la fase gaseosa.
Responden a la fórmula general (CH2O)n, formados por una cadena simple no hidrolizable
de entre 3 y 6 carbonos.
Químicamente podrían definirse como polialcoholes con un grupo aldehído o cetona.
La isomería posicional que presentan es extremadamente importante en estos compuestos.
Sustancias con la misma fórmula empírica pueden tener propiedades muy diferentes con sólo
una diferencia en un carbono asimétrico.
ALDOSAS
CETOSAS
Los nombres de los azúcares terminan con el sufijo –osa, que significa azúcar.
Los tres disacáridos más abundantes e importantes son la sacarosa, la lactosa y la maltosa.
La sacarosa es el azúcar de mesa, lo que basta para dar idea de su importancia industrial. La
sacarosa se extrae a gran escala de la caña de azúcar y de la remolacha.
La maltosa y la lactosa sólo tienen aproximadamente 1/3 del poder endulzante de la sacarosa.
Almidón, es un polisacárido que funciona como sustancia de depósito en las células de plantas.
Es un polímero de α-glucosa en el que los monómeros se encuentran enlazados por enlaces 1- 4
y ocasionalmente se ramifican formando un enlace adicional en posición 1-6.
Formado por 1000 o más unidades de alfa-glucosa unidas por enlaces glicosídicos.
Estructura espacial
de la amilosa
El almidón se encuentra en las células de la planta como estructuras llamadas granos de
almidón. Otros ejemplos de estructuras en plantas que contienen gran cantidad de almidón son
los cereales como trigo, arroz y maíz. El almidón se almacena en estas semillas para
proporcionar
orcionar energía para el crecimiento del embrión durante la germinación de semillas.
Glucógeno:
Tanto el almidón como el glucógeno pueden romperse para producir glucosa, que entonces es
utilizada en la respiración celular para producir energía.
− Bases nitrogenadas purínicas: son la adenina (A) y la guanina (G). Ambas forman
parte del ADN y del ARN:
− Bases nitrogenadas pirimidínicas: son la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U).
La timina y la citosina intervienen en la formación del ADN. En el ARN aparecen
la citosina y el uracilo.
−
• Pentosa: el azúcar de cinco átomos de carbono; puede ser ribosa (ARN) o desoxirribosa
(ADN).
• Ácido fosfórico: de fórmula H3PO4. Cada nucleótido puede contener uno (nucleótidos-
monofosfato, como el AMP), dos (nucleótidos-difosfato, como el ADP) o tres
(nucleótidos-trifosfato, como el ATP) grupos fosfato.
ENLACES:
Los grupos fosfato se encuentran unidos a los azúcares mediante enlaces tipo fosfodiéster.
Las bases nitrogenadas se encuentran unidas a los azúcares mediante un enlace covalente C-N.
1.4 LÍPIDOS
Los lípidos o triglicéridos son sustancias orgánicas que contienen oxígeno, hidrógeno y
carbono. Cada molécula de lípido está formada por tres ácidos grasos y un glicerol por reacción
de condensación. Son hidrofóbicos debido a sus largas cadenas neutrales de hidrocarbono en
su estructura.
Existen dos tipos de lípidos: grasas y aceites. Las grasas contienen ácidos grasos saturados en
su estructura, por eso son sólidos a temperatura ambiental, ej.: la manteca y grasa animal que
se encuentra en la carne roja. La grasa insaturada se encuentra principalmente en plantas, ej. :
Aceite de oliva, de girasol, de maíz y otros. Las grasas insaturadas son más saludables en
nuestra dieta, ya que las grasas saturadas incrementan el nivel de colesterol en sangre
causando problemas cardiovasculares.
Los grupos amino y carboxilo dan a los aminoácidos y a las proteínas sus caracteres y
propiedades. Por eso se llaman grupos funcionales.
Cuando los aminoácidos se unen para formar proteínas, el grupo amino de un aminoácido se
une con el grupo carboxilo de otro aminoácido y forma un enlace llamado enlace peptídico.
Una molécula de agua se elimina de la formación de cada enlace peptídico.
Función Diagrama
2. ELEMENTOS DE MICROBIOLOGÍA
Por no presentar una estructura celular, los Virus no son considerados seres vivos y por lo tanto
no están incluidos en estas clasificaciones.
Los Virus están formados básicamente por una porción de material genético, ADN o ARN,
nunca los dos simultáneamente, envueltos por proteína. Algunos virus, con estructura más
compleja, tienen además una envoltura lipoprotéica. Los virus, cuando están fuera de las
células, no poseen actividad metabólica propia y por lo tanto no sintetizan protoplasma ni
crecen. Son sintetizados por las células que los hospedan, en las cuales penetran y asumen el
mando del metabolismo. El aumento del número de virus no ocurre por el proceso de división
como en los organismos celulares, ocurre por la replicación viral.
CARACTERÍSTICAS DE LOS CINCO REINOS
Las características aquí recogidas las cumplen la mayor parte de los organismos englobados en cada Reino
Tipo de
Procariotas Eucariotas Eucariotas Eucariotas Eucariotas
células
Unicelulares/ Unicelulares/
Nº de células Unicelulares Pluricelulares Pluricelulares
Pluricelulares Pluricelulares
Autótrofos/ Autótrofos/
Nutrición Heterótrofos Autótrofos Heterótrofos
Heterótrofos Heterótrofos
Tejidos
No existen No existen No existen Existen Existen
diferenciados
Existencia de Existe / No
Existe Existe Existe No existe
pared celular existe
Movilidad Sí / No Sí / No No No Sí
La nomenclatura es el proceso de dar nombre a las especies. Los nombres científicos son
binominales, siendo una combinación del nombre genérico (genero) seguido de la espécie. El
nombre del genero se inicia con letra mayúscula pero el de la especie NO.
Ej.
Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli
genero espécie genero espécie
Diferencias en la organización y estructura de células procariotas y eucariotas
Nucleolo NO SI
Retículo endoplasmático NO SI
Aparato de Golgi NO SI
Mitocondria NO SI
Lisosomas NO SI
Pared celular SI NO
Fagocitosis NO SI (a veces)
Pinocitosis NO SI (a veces)
2.2 MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA
2.2.1 BACTERIAS
La composición elemental de una célula bacteriana típica es:
• 50% C
• 20% O
• 14% N
• 8%H
• 3% P
• 1% S
• Pequeñas cantidades de K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl- y vitaminas
Componentes Orgánicos:
• Lípidos
• Hidratos de Carbono
• Proteínas
• Ácidos nucleicos
Observadas al microscopio, la mayor parte de las bacterias se pueden presentar en tres formas
posibles:
• Esféricas (cocos)
• Cilíndricas (bacilos)
• Espiraladas: - Espirilos: cuerpo rígido y presenta varias espirales.
- Vibriones: forma de media espiral o coma.
Los cocos, cuando se dividen, pueden dar origen a agrupamientos característicos: Agrupados en
pares (diplococos), cadenas (estreptococos) o en racimos (estafilococcos). Los cocos que
permanecen aislados son llamados micrococos.
Los bacilos que al dividirse permanecen en cadenas son llamados estreptobacilos.
La morfología individual y los agrupamientos pueden ser mejor observados al microscopio,
cuando las bacterias se presentan coloreadas. El método más usual de coloración es el de
GRAM, que permite la división en dos grandes grupos: gram-positivas y gram-negativas, según
cómo la bacteria reaccione a éste método de tinción.
2.2.2 HONGOS
Los hongos son seres eucariotas, heterótrofos, no realizan fotosíntesis, no almacenan almidón
como material de reserva y si glucógeno. No tienen celulosa en la pared celular. Se los puede
encontrar en el aire, suelo, agua, vegetales y animales.
Desde el punto de vista morfológico es conveniente dividirlos en Hongos y Levaduras (según su
forma general de crecimiento).
Las levaduras son generalmente unicelulares, de forma esférica, elíptica o filamentosa.
Los hongos son células multinucleadas que forman tubos llamados Hifas; y un conjunto de hifas
se lo llama luego Micelio. Las hifas pueden ser continuas o septadas.
El crecimiento del tipo de las levaduras se presenta por un proceso de gemación en el que las
células hijas se separan de las madres tan pronto como han madurado; mientras que el
crecimiento filamentoso de los hongos, se presenta como una extensión continua de las puntas
de las hifas.
2.3 NUTRICIÓN MICROBIANA
2.3.1 CONSIDERACIONES GENERALES:
Básicamente las necesidades nutritivas de los microorganismos son las mismas que la de todos
los seres vivos, que para renovar su protoplasma y realizar sus actividades, necesitan fuentes de
energía y fuentes de material orgánico e inorgánico.
Existen dos tipos nutritivos: los organismos autótrofos, que se nutren exclusivamente de
sustancias inorgánicas; y los organismos heterótrofos, necesitan fuentes orgánicas de carbono.
Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos.
Entre los factores físicos tenemos la temperatura, el pH y la presión osmótica.
Los factores químicos necesarios para el crecimiento microbiano son diversos elementos
constitutivos de las células.
REQUISITOS FÍSICOS
TEMPERATURA
El crecimiento microbiano se ve profundamente influenciado por la temperatura.
La temperatura de crecimiento óptimo permite el crecimiento más rápido de las bacterias
durante un período de tiempo. La temperatura mínima de crecimiento es aquella temperatura
menor a la cual la especie puede crecer. La Temperatura de crecimiento máximo es la
temperatura mayor en la cual el crecimiento es posible.
pH
Regularmente las bacterias prefieren pHs de 6 a 8.
Las levaduras crecen bien a pHs de 4,5 a 6.
Los hongos filamentosos soportan PHs más ácidos que las levaduras, pudiendo desarrollar en
rangos que van de los 3,5 a 4.
ACTIVIDAD DE AGUA. PRESIÓN OSMÓTICA
Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión de vapor de agua del sustrato de
cultivo (P) y la presión de vapor de agua del agua pura (P0):
REQUISITOS QUÍMICOS
- FUENTES DE ENERGÍA: puede ser energía lumínica para los organismos fotosintéticos o en el
caso de los organismos quimiotróficos (los hongos y la gran mayoría de las bacterias) que
obtienen su energía mediante reacciones químicas; estos microorganismos pueden ser
organotróficos (utilizan compuestos orgánicos) o Litotróficos (utilizan compuestos inorgánicos).
-OXÍGENO: como el agua, el oxígeno tampoco es un nutriente y funciona apenas como receptor
final de hidrógeno en los procesos de respiración aeróbica. Los microorganismos presentan
diferentes comportamientos en presencia de oxígeno libre:
- Aerobios: necesitan presencia de O2
o Microaerófilos: necesitan pequeñas cantidades de O2 no
tolerando la presión del oxígeno atmosférico.
- Anaerobios: no toleran la presencia de oxígeno libre.
- Facultativos: pueden desarrollar tanto en presencia como en ausencia
de oxígeno.
Entre las bacterias, encontramos los tres tipos de comportamiento. Los hongos son aerobios o
facultativos; raramente anaerobios.
C. SEGÚN SU COMPOSICIÓN
Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo
pueden ser clasificados en:
1. Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se
preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su
composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es
rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta.
En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más
empleados.
2. Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición
exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada
en proporciones determinadas, resultando un medio de composición
perfectamente definida.
3. Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos
para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para
estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los
factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo
(extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).
log − log
=
log 2
Aire estéril
u otro gas Espacio con aire (gas)
Recipiente de cultivo
Cultivo
Agitador
Rebosadero
Efluente
3. METABOLISMO CELULAR
Como los sistemas vivos son ordenados, mantienen ese orden e inclusive lo aumentan,
parecería que constituyen excepciones al segundo principio de la termodinámica (el universo
tiende a un estado de entropía (desorden) máximo.
Sin embargo, los seres vivos no escapan a la descripción del segundo principio, dado que:
a) De la energía que recibe un sistema vivo, una parte se la utiliza para ordenar al mismo
(energía libre), pero otra parte vuelve al ambiente como calor y contribuye a su
desorden. La magnitud en que el entorno se ha desordenado es mayor que la
correspondiente al ordenamiento del sistema.
b) Toda la energía libre utilizada en el ordenamiento y conservación del ser vivo vuelve al
ambiente a través de las actividades del sistema mientras vive y, finalmente, el
remanente, a su muerte.
+ + ( ) ⇄ "
La cantidad de energía que puede liberarse en la reacción que lleva de ATP a ADP, varía según
las condiciones en que se efectúa la reacción.
Valores obtenidos en el laboratorio en sistemas in vitro oscilan alrededor de 7 Kcal /mol de ATP.
En cambio, los datos estimados en procesos celulares, pueden llegar hasta 13 Kcal /mol de ATP.
Por una convención arbitraria, se utilizará la cifra de 10 Kcal /mol de ATP para hacer
referencia a la energía transferida durante su hidrólisis.
Las variaciones del valor de la energía comprometida en esa reacción se deben a que la
molécula de ATP posee varios grupos ácido ionizables, los cuales, dependiendo del medio en
que se encuentren, determinarán diferentes configuraciones electrónicas de la misma. Factores
tales como la temperatura, el pH, la fuerza iónica, le presencia de distintos cationes (como el
Mg2+) son fundamentales para que se traduzca de manera precisa el valor de esa energía.
Compuestos análogos al ATP, tales como el guanosin trifotrifosfato
sfato (GTP), uridin trifosfato (UTP), y
citidin trifosfato (CTP), también almacenan y transportan enlaces fosfato de alta energía, pero
en menor medida que el ATP.
Los compuestos de alta energía producidos durante el metabolismo, tales como el fosfoenol
piruvato y 1,3-difosfoglicerato,
difosfoglicerato, transfieren sus grupos ~P a los ATP. La energía almacenada en
ATP es más tarde transferida a compuestos de fosfato de menor energía tales como la glucosa-
glucosa
6-fosfato y el glicerol-3-fosfato:
Figura: Transferencia de energía biológica desde compuestos de alta energía a los de baja energía vía ATP.
Fosfoenolpiruvato y 1,3 difosfoglicerato son compuestos de fosfato de alta energía y actúan como dadores de
fosfato. Compuestos de baja energía tales como la glucosa 66-fosfato y glicerol 3-fosfato
fosfato son aceptores de fosfato.
Los átomos de hidrógenos liberados en las reacciones biológicas de oxido
oxido-reducción
reducción son
transportados por derivados de nucleótidos, especialmente por nicotinamida adenina
dinucleótido (NAD+) y nicotinamida adenina dinucleótido
dinucleótido fosfato (NADP+). Estas reacciones de
oxido-reducción
reducción son reversibles. El NADH puede donar electrones a ciertos compuestos y
aceptarlos de otros, dependiendo del potencial de óxido reducción de los compuestos.
2. Formación
ormación de ATP en el metabolismo de respiración: los electrones o (átomos de H)
transportados por el NADH son transferidos al oxigeno vía una serie de compuestos
intermediarios (la cadena respiratoria). La energía liberada por el transporte de estos
electrones resulta de la formación de hasta tres moléculas de ATP. El ATP se puede
formar del poder reductor del NADH en ausencia de oxigeno si hay disponible una
alternativa como aceptor de electrones (ej. NO3
NO3-)
3.2 ENZIMAS
3.2.1 CONSIDERACIONES GENERALES
Todas las reacciones químicas, tanto las exergónicas como las endergónicas, requieren para
iniciarse, que los reactantes superen una cierta barrera de energía. Esta barrera se denomina
Energía de activación y se define como la energía cinética mínima requerida por un sistema de
partículas para que se produzca una reacción química
El nivel energético de los reactantes determina la velocidad con que éstos se mueven y chocan
entre sí para reaccionar. Este movimiento está directamente relacionado con la temperatura,
de modo que, a temperaturas bajas, es ínfimo el número de moléculas re reactantes
actantes que tienen
suficiente energía como para pasar al estado activado.. Al aumentar la temperatura, los
movimientos se incrementan y la velocidad de la reacción se hace apreciable.
Por otro lado, la mayor parte de las reacciones celulares, si bien requi
requieren
eren una energía de
activación considerable, deben realizarse a las temperaturas moderadas y estables propias del
medio celular. Por lo tanto, la célula debe utilizar una solución diferente para el problema de la
barrera energética. Esta solución consiste en el uso de catalizadores que reducirán la energía
de activación.
La célula presenta catalizadores especiales, sintetizados por ella, llamados ENZIMAS.
Las enzimas presentan las mismas propiedades que los catalizadores no biológicos utilizados en
los laboratorios e industrias:
− Son eficientes en cantidades muy pequeñas.
− No son alterados químicamente por la reacción (se recuperan por completo)
− No afectan las concentraciones de equilibrio de la reacción.
Además, a diferencia de los catalizadores no biológicos:
biológicos
− Presentan una especificidad muy alta para una reacción en particular.
− Pueden estar sujetas a regulación de su actividad.
− Tienen una composición química específica (son proteínas)
3.2.2 CINÉTICA ENZIMÁTICA
La cinética de una reacción (en este caso, catalizada por una enzima) se refiere a la velocidad de
dicha reacción a medida que transcurre.
Por ejemplo, en la reacción reversible:
E
S P , puede medirse la cantidad
de P formado en cada minuto, y con estos datos obtener un gráfico como el siguiente:
En la primera parte de la curva (ascenso lineal = velocidad inicial), se supone que el numero de
moléculas de sustrato sobrepasa mucho al número de moléculas de enzima, con lo cual ésta
trabaja a su máxima capacidad.
Después de un tiempo, la cantidad de sustrato disminuye y, por lo tanto, disminuye la
probabilidad de choques con la enzima; debido a esto, la cantidad de producto que se forma en
la unidad de tiempo ya no es tan alta (y la curva tiende a nivelarse)
Finalmente la curva permanece constante, lo cual indica que se alcanzó el equilibrio.
Para hacer comparaciones entre diferentes reacciones, o entre distintas condiciones en una
misma reacción, se utiliza como referencia la velocidad inicial; siendo así esta velocidad, una
medida de la actividad enzimática bajo condiciones determinadas.
En definitiva, la velocidad inicial en la velocidad máxima a la que puede trabajar la enzima en
esas condiciones.
Inhibición
Este mecanismo regula los niveles del producto Z, evitando que se forme más cantidad que la
necesaria.
También puede ocurrir que la sustancia se comporte como activadora, favoreciendo la acción
de la enzima y, por lo tanto, impulsando la serie de reacciones.
La teoría de la regulación alostérica propone que una sustancia, inhibidora o activadora, puede
unirse a un lugar particular de la enzima, llamado sitio alostérico, distinto del sitio activo, y
cambiar la conformación de la proteína. Como consecuencia de esto, ocurre una modificación
de su actividad catalítica.
REACCIONES CATABÓLICAS:
o Fermentación: se realiza en condiciones anaeróbicas. Es el tipo más sencillo y primitivo
de obtención de energía para uso celular. En este proceso no participa nada parecido a
una cadena transportadora de electrones y el aceptor final de electrones es siempre una
molécula orgánica como el piruvato.
o Respiración aeróbica: mecanismo más complejo y evolucionado que el anterior, y en
cuyo curso las moléculas orgánicas son degradadas en forma completa hasta CO2 y H2O.
Los átomos de hidrógeno obtenidos por las oxidaciones que se llevan a cabo (cadena
transportadora de electrones) son aceptados, en última instancia, por oxígeno
molecular (O2)
o Respiración anaeróbica: proceso particular de algunas bacterias por el cual las moléculas
orgánicas son degradadas por completo, pero los hidrógenos obtenidos en estas
oxidaciones, son aceptados por iones nitrato o sulfato en ausencia de oxígeno
molecular.
El aceptor terminal de electrones es una molécula inorgánica, distinta del oxígeno)
GLUCÓLISIS
Es el primer paso en la respiración celular (aerobia, anaerobia o fermentativa)
Es una etapa parcial del catabolismo de la glucosa. Se realiza en la matriz citoplasmática y
puede llevarse a cabo en ausencia de O2
Ecuación Global:
Reordenamiento molecular
Reordenamiento molecular
En la etapa productora de energía de la glucólisis se han formado 2 ATP por molécula de PGAL
procesada, es decir, 4 ATP por glucosa inicial.
Si se parte de glucógeno, durante su ruptura (glucogenólisis) la glucosa es fosforilada sin gasto
de ATP; sólo se necesita una reacción de reordenamiento para que cambie la ubicación de su
grupo fosfato.
Como se puede ver, el oxigeno molecular no participa directamente del ciclo; los electrones
pasan a través de una serie de portadores, conocidos como cadena transportadora de
electrones, que producen ATP y requieren oxígeno.
La RESPIRACIÓN AERÓBICA consta de cuatro etapas:
a) Glucólisis.
b) Ciclo de Krebs, o del ácido cítrico, o de los ácidos tricarboxílicos.
c) Cadena respiratoria o de transporte de electrones.
d) Fosforilación oxidativa.
Dado que, por cada molécula de glucosa inicial se habían obtenido 2 de piruvato y, por lo tanto,
2 de acetil-Co
Co A, deben cumplirse dos recorridos del ciclo de Krebs por molécula de glucosa.
En consecuencia, los productos obtenidos de este proceso son el doble de lo indicado en la Fig.
Reacciones del ciclo de Krebs.
Balance parcial de la glucólisis y del Ciclo de Krebs
GLUCOSA 2 PIRUVATO
+ 2 ATP
+ 2 NADH
2 ACETIL-Co A 4 CO2
+ 2 GTP
+ 6 NADH
+ 2 FADH
GLUCOSA 6 CO2
+ 2 ATP
+ 2 GTP
+ 10 NADH
+ 2 FADH
Observando el balance parcial que corresponde al ciclo de Krebs, se comprueba que en este
proceso no se obtiene energía directamente bajo la forma de ATP (excepto en el paso en que se
obtiene GTP, que es equivalente al ATP). En cambio, se obtienen coenzimas reducidas (NADH y
FADH), y es a través de éstas que se obtendrá la energía para sintetizar ATP en los dos
siguientes pasos.
TOTAL + 38 ATP
3.3.3 FERMENTACIÓN
Los procesos anaeróbicos son típicos de ciertas bacterias (células procariotas) y de
las levaduras (hongos unicelulares eucariotas).
Las células eucariotas son aeróbicas, salvo algunas excepciones (por ej. células musculares, que
son anaeróbicas facultativas, esto es: llevan a cabo una oxidación anaeróbica cuando el abasto
de oxígeno no es suficiente).
La oxidación anaeróbica transcurre enteramente en la matriz citoplasmática y consta de dos
etapas: glucólisis y fermentación. De ellas, sólo la glucólisis aporta ATP.
La fermentación consiste en la reducción del piruvato, que acepta los protones y electrones
transportados por el NADH generado en la glucólisis.
El producto final que se obtiene de la reducción del piruvato depende del tipo celular.
Según los productos finales que se formen pueden distinguirse varios tipos de fermentación:
a) Fermentación alcohólica (en levaduras): el piruvato es descarboxilado, produciendo
dióxido de carbono y acetaldehído, y luego éste es reducido a etanol.
Los ácidos grasos y los aminoácidos también son utilizados como combustibles.
Los ácidos grasos se obtienen de la dieta, o bien de la hidrólisis de los depósitos de grasa del
tejido adiposo. Antes de ingresar a la respiración celular, los ácidos grasos son transformados
en acetil-CoA, dentro de la mitocondria, en un proceso denominado beta oxidación. Cada
molécula de acetil-CoA obtenida se incorpora al ciclo de Krebs.
Los aminoácidos se utilizan como combustibles en dos situaciones: cuando su disponibilidad en
el organismo supera la capacidad de utilización de los mismos en la síntesis de proteínas, o bien
cuando no existe otra fuente de energía. En el último caso, las proteínas corporales son
hidrolizadas para proporcionar los aminoácidos que las constituyen.
Los aminoácidos pueden oxidarse previa desaminación. La desaminación tiene lugar en el
hígado y consiste en la liberación del grupo amino, posteriormente convertido en urea y
eliminado por la orina. El resto del aminoácido, un cetoácido, ingresa a la respiración celular en
la glucólisis, como piruvato, como acetil-CoA, o algún otro intermediario del ciclo de Krebs,
dependiendo del aminoácido del cual derive.
El ciclo de Krebs constituye, por lo tanto, la vía final común en el catabolismo de los
compuestos orgánicos.
3.4 FOTOSINTESIS
Hasta ahora nuestra discusión sobre la biosíntesis se ha referido al metabolismo y a la
reorganización de los compuestos orgánicos; hemos supuesto que los organismos a los que nos
estamos refiriendo obtienen para su crecimiento los compuestos orgánicos del medio
ambiente.
Los organismos que requieren un aporte contínuo de compuestos orgánicos para la mayoría de
sus reacciones biosintéticas, se llaman heterótrofos. Este grupo incluye a todos los animales,
hongos, protozoarios y la mayoría de las bacterias. Por otra parte, los autótrofos son
organismos capaces de obtener el carbono que necesitan para la biosíntesis celular a partir del
CO2; es decir que este tipo de organismos son capaces de sintetizar material orgánico a partir
de CO2.
Las autotrofía no sustituye a las reacciones biosintéticas estándar; más bien las aumenta,
permitiendo que la biosíntesis se inicie con un compuesto mucho más simple, el CO2.
Ecuación Global:
Luz
6 CO2 + 6 H2O Glucosa + 6 O2
2. Fotooxidación del agua; es una ruptura oxidativa de la molécula de agua para dar O2,
electrones y protones.
3. Fotoreducción del NADP; quien acepta los electrones desprendidos de la clorofila y los
protones del agua y se reduce a NADPH (que se va a utilizar en la etapa oscura)
4. GENÉTICA MOLECULAR
4.1 Introducción
La genética es la disciplina que estudia los mecanismos por los cuales los caracteres pasan de
un organismo a otro. Es una importante herramienta de investigación en los intentos por
comprender los mecanismos moleculares que permiten el funcionamiento de las células. Más
aún, nos proporciona una forma para introducir nuevas propiedades en los organismos y, en
consecuencia, tiene muchas aplicaciones industriales y médicas.
Las propiedades de cada proteína o enzima de la célula están determinadas por su secuencia de
aminoácidos. Existen 20 aminoácidos diferentes, que se encuentran en las proteínas; siendo las
cadenas de 100 o más aminoácidos por molécula proteínica.
¿Cómo es que la célula logra conectar en el orden correcto los aminoácidos adecuados para
cada enzima diferente?
GEN o GEN estructural, es el sector de ADN a partir del cual se transcribe el ARNm para una
proteína en particular.
La secuencia de aminoácidos de cada proteína está especificada por un GEN, que es una
porción de la molécula del ADN, y es esta secuencia de bases púricas y primídicas dentro del
gen la que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína.
Se requieren tres bases para codificar un solo aminoácido, y cada triplete de estas bases recibe
el nombre de codón. Un cambio en una sola base modifica el codón y da lugar a un cambio en
el aminoácido de la proteína; tales cambios, que frecuentemente redundan en detrimento de
las células, reciben el nombre de mutaciones.
Transcripción: El ADN no funciona directamente en la síntesis de proteínas, sino
mediante el intermediario ARN. La transferencia de información del código genético al ARN
recibe el nombre de transcripción, y la molécula de ARN que lleva esta información se
denomina ARN mensajero (ARNm). Las moléculas de ARNm frecuentemente contienen la
información para fabricar más de una proteína. En la mayoría de los casos, en cualquier
localización particular de un cromosoma solamente se transcribe una de las cadenas del ADN, y
el código de ésta es el que queda contenido en el ARNm.
Posiblemente una de las propiedades más interesantes del código genético es que un
aminoácido frecuentemente es codificado por varios tripletes de bases de ARN diferentes,
d pero
emparentados. Existen 64 combinaciones posibles de 4 bases tomando 3 de cada vez.
Otro fenómeno del código genético (Tabla 4.3) es que unos cuantos tripletes no corresponden
a ningún aminoácido. Estos tripletes se han denominado codones sin sentido y funcionan como
señales de “puntuación” para la terminación de la traducción del código genético para una
proteína específica. Si no hay moléculas de ARNt que correspondan con estos codones sin
sentido, no pueden insertarse aminoácidos y el polipéptido es terminado y liberado del
ribosoma.
Además de los puntos para detenerse, también se requieren puntos de iniciación (tabla 4.3). La
importancia de tener un punto de iniciación bien definido se comprende fácilmente si
consideramos que con un código en triplete es absolutamente esencial que la traducción se
inicie en la localización correcta, puesto que de no ser así, el marco de lectura completo se
modificaría, formándose una proteína completamente diferente o ninguna.
Aunque es un proceso continuo, podemos pensar en la síntesis proteínica como una secuencia
de pequeños pasos: iniciación, elongación, terminación y plegamiento del polipéptido. Estos
pasos están detallados en la fig. 4.3.
4.4 Regulación
No todos los genes se expresan simultáneamente y al mismo nivel.
La célula cuenta con un mecanismo de regulación que actúa antes de que una enzima sea
sintetizada, es decir, a nivel de la transcripción del gen que la codifica.
Las células producen dos tipos de enzimas:
• Enzimas constitutivas (a partir de Genes constitutivos): Los genes se expresan al mismo
nivel independientemente de las condiciones ambientales. Se expresan en forma
continua. Por ejemplo, los genes que codifican para las enzimas necesarias para el
metabolismo básico celular
• Enzimas inducibles (Genes regulados): Se expresan a distintos niveles (o no se
expresan) dependiendo de las condiciones ambientales. Se expresan en determinadas
situaciones. Codifican para enzimas que solamente se necesitan para momentos
concretos.
La inhibición de la síntesis de una enzima inducible, en condiciones bajo las cuales ésta no es
utilizable, resulta un mecanismo muy adecuado para evitar el gasto innecesario de materiales y
energía celular.
.
Fig. 4.4.1 Operón Lactosa - control negativo: La presencia de lactosa permite la expresión de enzimas
para que pueda ser utilizada como nutriente
Fig. 4.4.2 Operón Lactosa - control negativo: En ausencia de lactosa:
Una variante de este tipo de control se observa en los operones para la síntesis de alguna
sustancia, por ejemplo, el operón del triptofano. En este caso, si el aminoácido está
disponible en el ambiente celular, no es necesario sintetizarlo a partir de sus precursores. Por
tal motivo, el triptofano actúa reprimiendo (y no induciendo) la transcripción de los genes
estructurales relacionados con su síntesis. (Fig. 4.4.4; 4.4.5 y 4.4.6)
5. GENÉTICA BACTERIANA
5.1 Introducción
Se podría definir de un modo muy general a la genética como el estudio de las características
hereditarias que son transmitidas de modo ordenado en todos los seres vivos. La genética
busca también explicar como ocurre la enorme variabilidad que puede ser observada entre y
dentro de las especies.
Siendo el material genético, en la gran mayoría de los seres vivos, constituido por el ácido
desoxirribonucleico o DNA, la genética posee sus reglas, aplicables tanto a plantas y animales
superiores como a los microorganismos.
Las leyes de la genética fueron descriptas por primera vez, en la segunda mitad del siglo XIX en
guisantes (Leyes de Mendel). Mientras estas leyes fueron redescubiertas en el 1900, y se
utilizaban plantas y animales en investigaciones genéticas; la introducción de los
microorganismos dio un nuevo impulso a la ciencia de la herencia.
Fue apenas en 1941 cuando se utilizaron hongos en estudios genéticos. Esta introducción fue
un marco decisivo para el desarrollo de la Genética, siendo que los microorganismos poseen
cualidades casi ideales para este tipo de estudios:
• Ciclo vital rápido, permitiendo realizar estudios en cortos períodos de tiempo.
• Pueden ser cultivados en gran número, requiriendo poco espacio y nutrientes.
• Por lo anterior, características buscadas pueden ser detectadas en grandes poblaciones.
• La mayoría de los microorganismos presenta apenas solo un cromosoma o una serie
única de cromosomas (Los microorganismos son Haploides)
Debido a éstas y otras ventajas los microorganismos, especialmente a partir de la segunda
mitad del siglo XX, fueron empleados cada vez más frecuentemente en los estudios de genética.
El interés sobre la genética y el mejoramiento genético de microorganismos se incrementó
gracias a la utilización e importancia cada vez mayor de los microorganismos en procesos
industriales y de valor económico en áreas como la salud, agropecuaria, energética, de
alimentos y protección ambiental.
5.2 Mutación
Una mutación se observa como un cambio, heredable, en el fenotipo de un organismo.
Cualquier alteración en el material genético que sea capaz de ser transmitida a los
descendientes, constituye una mutación.
La mutación es un evento raro, que ocurre en distintas frecuencias en diferentes genes; pero
puede considerarse que para cada gen hay una ocurrencia media de una vez por millón de
divisiones celulares.
Hay dos tipos de mutaciones: selectivas y no selectivas. Un ejemplo de una mutación no
selectiva es la pérdida de color de una bacteria pigmentada. Las colonias blancas no tienen
ventajas o desventajas sobre las pigmentadas originales cuando son cultivadas en placas de Petri
en el laboratorio. Esto significa que sólo podemos detectar tales mutaciones examinando
grandes cantidades de colonias y buscando las “diferentes”.
Una mutación selectiva, confiere al mutante una ventaja bajo cierto tipo de condiciones
ambientales, de manera que la progenie de dicha célula mutante es capaz de superar el
crecimiento de la cepa natural y sustituirla. Un ejemplo de la mutación selectiva es la resistencia
a los fármacos: un mutante resistente a los antibióticos pude crecer en presencia de
concentraciones de antibióticos que inhiben a la cepa parental.
Existen tres mecanismos mediante los cuales el fragmento de ADN es introducido en la célula
receptora: (Fig. 5.3)
6. INGENIERIA GENÉTICA
6.1 Introducción
El advenimiento de la ingeniería genética tuvo un impacto muy importante sobre la
biotecnología. Hoy en día, el hombre puede intervenir directamente sobre los “comandos” de la
vida: es posible programar genéticamente los organismos vivos no solamente para la producción
de algún metabolito, sino también para obtener sustancias que no son comúnmente producidas
por otros organismos.
En principio, cualquier proteína puede ser producida en fermentaciones industriales; mientras
que el gen que la codifica sea introducido en un microorganismo y pase a ser expresado. De
suma importancia fue la posibilidad que esta nueva tecnología trajo de replicar secuencias
individuales de ADN (clonado); esto permite que, partiendo de una molécula de ADN, sean
producidas cantidades ilimitadas de la misma molécula.
Por otro lado, la importancia biotecnológica de la Ingeniería genética está dada por el hecho que
la síntesis de proteínas extranjeras por los microorganismos se obtiene con una importante
reducción de costos de producción. Por ejemplo: para producir, por las vías tradicionales, 5 mg
de somatostatina, una hormona de vertebrados, son necesarios 500 000 cerebros de carneros.
Cuando por medio de la ingeniería genética se consiguió insertar el gen que codifica la
somatostatina en la bacteria E.coli; el mismo rendimiento fue alcanzado con apenas 7,5 Kg de
bacterias, lo que se obtiene de manera rápida y de bajo costo.
Se nombra como ingeniería genética, al conjunto de técnicas que hacen posible la creación de
nuevas combinaciones génicas, inexistentes en la naturaleza.
En investigación básica, las técnicas de ingeniería genética se utilizan para estudiar los
mecanismos de replicación del gen y su expresión en procariontes, eucariontes y sus virus.
En investigación aplicada, la ingeniería genética ha permitido el desarrollo de cultivos
microbianos capaces de producir productos valiosos como insulina humana, hormona de
crecimiento humano, interferón, vacunas y enzimas industriales. El potencial de la ingeniería
genética para aplicaciones comerciales parece ilimitado.
La ingeniería genética, también conocida como Tecnologia del ADN recombinante, hizo posible
que construyamos nuevas especies de material genético, a través de la recombinación realizada
artificialmente en el laboratorio entre moléculas de ADN aisladas de organismos no
relacionados.
Para una experiencia de este tipo, es necesario contar con cuatro “herramientas”:
1. Un método para cortar y volver a unir in vitro diferentes moléculas de ADN, originando la
molécula de ADN recombinante.
2. Un elemento transportador de genes, el vector genético, que, al ser multiplicado por
la célula huésped, posibilitará que el gen extranjero que transporta también se
multiplique.
3. Un medio de introducir el vector en una célula viva, capaz de multiplicarlo.
4. Una manera de seleccionar, dentro de una gran población de células, solo aquellas que
tuvieran efectivamente incorporado el ADN recombinante.
Estas cuatro “herramientas” son las que iremos desarrollando en los siguientes capítulos.
6.2 Enzimas de restricción: las tijeras moleculares que cortan la molécula de ADN en puntos
específicos
La construcción de ADN recombinante requiere que sea posible cortar las moléculas de ADN
de modo preciso y reproducible.
Además de ser necesario cortar el vector en un punto específico, donde será insertado el
ADN extranjero, es imprescindible que todas las moléculas del vector sean cortadas
exactamente en la misma posición. Consecuentemente, no se puede realizar este tipo de
construcción a través de una fragmentación aleatoria del ADN del vector.
En verdad, la ingeniería genética solo se hizo posible luego del descubrimiento de una clase
especial de enzimas, las endonucleasas de restricción, que le representó el premio Nobel a
W. Arber, H Smith y D. Nathans en 1978.
Las enzimas de restricción son endodesoxiribonucleasas, o endonucleasas, que reconocen
secuencias específicas de nucleótidos en la molécula de ADN y cortan las dos cadenas de
ADN en un punto dentro de esta secuencia. Una determinada enzima de restricción
catalizará el corte de la doble cadena solo cuando encuentre aquella secuencia particular
que reconoce. Es esta especificidad la que hace de las enzimas de restricción instrumentos
tan importantes en ingeniería genética. Así, por ejemplo, la enzima de restricción llamada
PvuI (producida por la bacteria Proteus vulgaris) corta el ADN solamente cuando encuentra
la secuencia de 6 nucleótidos CGATCG. A su vez, la enzima de restricción PvuII, producida por
la misma bacteria, solo corta el ADN cuando encuentra la secuencia CAGCTG. La mayoría de
las enzimas de restricción reconocen secuencias hexanucleotídicas, pero hay también
algunas, que reconocen secuencias de 4 a 12 nucleótidos.
La primera enzima de restricción fue aislada en 1970. Hoy día ya se conocen más de 2500,
aisladas a partir de una vasta gama de especies bacterianas, comprendiendo 230 diferentes
secuencias de reconocimiento. En muchos casos, si dos enzimas de restricción, provenientes
de diferentes bacterias, reconocen la misma secuencia de ADN; a esas enzimas se las
denomina isoesquizómeros. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente
aproximadamente unas 170 enzimas de restricción diferentes.
Dependiendo de la enzima de restricción, el resultado del corte va a ser diferente.
Hay enzimas que cortan exactamente en el medio de la secuencia de reconocimiento, como
es el caso de la PvuII (ver tabla 6.2), originando lo que se llama extremidad ciega o abrupta
en los fragmentos de ADN resultantes de su acción. Por otro lado, un número considerable
de enzimas de restricción corta la doble cadena de ADN generando extremidades cohesivas
en los fragmentos resultantes. Esto ocurre porque dichas enzimas cortan de un modo
“desencontrado” dentro de la secuencia de reconocimiento (Figura 6.2.1)
Así, por menor que sea la semejanza entre las secuencias de nucleótidos de dos moléculas
de ADN, la enzima de restricción sabrá encontrarla y cortará ambas moléculas en este punto.
Fragmentos originados a partir de moléculas de ADN diferentes que fueron digeridos por la
misma enzima de restricción, y fueron dotados de extremidades cohesivas, podrán asociarse
fácilmente a través de la complementariedad de la secuencia.
Todas las enzimas de restricción cortan el enlace fosfodiéster, dejando grupos 5´fosfatos
(5´P) y 3´hidroxilo (3´OH) en los fragmentos resultantes; que constituyen exactamente el
sustrato de la enzima ADN ligasa que cataliza la formación de nuevas uniones fosfodiéster.
Así, parece muy fácil el recombinar dos fragmentos de ADN que fueron cortados por la
misma enzima de restricción; sin embargo surgen algunos inconvenientes:
Por ejemplo, cuando se quiere adicionar un fragmento de ADN extranjero en otra molécula
de ADN (plásmido) (siendo ambos previamente tratados con la misma enzima de
restricción); en el momento en que la enzima ADN ligasa fuera adicionada al sistema,
algunas moléculas del plásmido reaccionarán entre sí mismas sin que ocurra ninguna
inserción recircularizando la cadena. Como se ve en la Fig. 6.2.2 la recircularización del
plásmido puede ser evitada si antes de agregar la ligasa, el plásmido linearizado fuera
sometido a la acción de la enzima fosfatasa alcalina, que remueve los fosfatos de las
extremidades 5´de la molécula, impidiendo en consecuencia la acción de la ADN ligasa. Así,
cuando las dos especies de ADN a ser recombinadas fuesen puestas en presencia una de otra
junto con la ADN ligasa, las extremidades 5´P de los fragmentos del ADN extranjero se unirán
a las extremidades 3´OH del plásmido en una de las cadenas. En el otro extremo de la
cadena habrá una interrupción porque tampoco podrá unirse la extremidad 3´OH del ADN
extranjero con el plásmido; pero la célula bacteriana es capaz de reparar tales interrupciones
de las cadenas simples, de modo que una vez dentro de la célula, el plásmido recuperará su
integridad conformacional.
Fig.6.2.2 Desfosforilación del plásmido para evitar que se recircularice sin ninguna inserción de ADN
extranjero.
Los vectores de clonación más útiles son los Plásmidos y los Virus, pues éstos presentan un
sistema de replicación autónoma, independiente del cromosoma de la célula.
Siendo replicado normalmente por la célula huésped, habrá copias del plásmido en todas las
células que se originen a partir de la célula huésped luego de sucesivas divisiones.
Por otro lado, para identificar aquellas células que tienen efectivamente incorporado el
nuevo ADN; el plásmido debe contener algún gen que le otorgue a la célula una nueva
característica, fácilmente detectable (marcador genético). Los marcadores genéticos más
frecuentemente utilizados para la manipulación de bacterias son los genes de resistencia a
antibióticos.
Así, de las miles de bacterias sometidas al agente infeccioso, podrán ser fácilmente
seleccionadas aquellas pocas que hubieran sido realmente infectadas, a través de una simple
siembra en un medio conteniendo el antibiótico en cuestión, al cual las células eran
originariamente sensibles.
Resumiendo, las características que debe tener un plásmido para ser utilizado como vector
de clonación son:
a) Tener bajo peso molecular, permite que el vector sea aislado intacto fácilmente.
b) Presentar por lo menos un sitio activo único para determinada enzima de restricción
(sitio de clonación). Esto permite que el vector sea cortado en un solo punto, donde
será insertado el ADN extranjero. Obviamente, la existencia de varios sitios únicos
para diferentes enzimas de restricción es altamente deseable.
c) Serr portador de un origen de replicación compatible con el sistema del huésped.
Permite que el vector se propague entre la descendencia de la célula inicialmente
transformada, originando un clon molecular.
d) Contener por lo menos un gen marcador. Permite la selección de clones dentro de un
gran número de células sometidas al proceso de transformación.
e) Tener un control sencillo de la replicación. Permite que el ADN del plásmido sea
amplificado, posibilitando la obtención de cantidades todavía mas significativas de
gen extranjero.
6.6