la espectrofotometría.

Esta técnica, combina conceptos de física, química,

matemáticas y un poco de biología (sobre todo en lo referente al tipo de muestras
objeto de su medida), resultando de gran utilidad para el trabajo del día a día en los
laboratorios. Así que, si quieres saber un poco más sobre ella, no dudes en seguir
zleyendo.

El primer científico que sentó las bases de lo que sería la futura espectrofotometría,
fue Isaac Newton quién, a través de experimentos con prismas, estableció los
principios de la dispersión y refracción de la luz y definió “espectro” como todas

aquellas partes constitutivas de la luz

blanca (colores del arcoiris), obtenidas a partir del paso de dicha luz, por medio de un
prisma. A partir de estos conocimientos, ya en el siglo XIX, empezaron a surgir los
primeros experimentos que trataban de determinar cuantitativamente la cantidad de
luz dispersada; uno de estos científicos, considerarado como uno de los “padres” de
la espectrofotometría, fue Joseph von Fraunhofer. Este físico y óptico alemán,
diseñó una rendija de difracción (conocida más tarde como monocromador), que
utilizando las interferencias de las diferentes frentes de ondas, conseguía difractar la
luz y, con ello, mejorar la resolución expectral y medir de manera casi exacta, las
longitudes de onda de la luz visible. Usando su propia técnica, estudió el espectro
solar y obtuvo los valores de las longitudes de onda correspondientes a las líneas
de absorción del espectro solar, conocidas como líneas de Fraunhofer. En 1859, dos
científicos alemanes, el físico Gustav Kirchhoff y el químico Robert
Bunsen, utilizarían estas líneas de Fraunhofer, para sentar las bases de
la espectroscopía como técnica analítica.

Líneas de Fraunhofer

La espectroscopia, se define como la ciencia que se encarga de estudiar la

interacción producida entre la materia y la energía radiada (transmitida y
absorbida en unas longitudes de onda determinadas) ubicada dentro de ciertos
rangos del espectro electromagnético. A partir de este fundamento, Kirchhoff y
Bunsen, llegaron a la conclusión de que cada elemento y/o compuesto tiene
un espectro específico, entendiendo por espectro a conjunto de longitudes de onda de
las líneas de absorción y emisión de energía radiante, obtenidas al someter a ese elemento
y/o compuesto a la acción de una radiación. Esto se explica, a través de la ley de la
radiación térmica de Kirchhoff, que dice que: “la potencia o intensidad de la energía
transmitida y la potencia o intensidad de la energía radiante absorbida por parte de la
materia, ante una longitud de onda y un valor de temperatura determinado, serán siempre
los mismos para esa misma materia“. Con todo ello, se puede, mediante el estudio del
espectro de una fuente desconocida, determinar su composición química, siendo
así la espectroscopía, una buena herramienta analíticano sólo para sondear el
análisis espectro-químico o la estructura atómica o molecular de sus materiales, sino
también para el análisis de la composición de los materiales.

La parte de la espectroscopía encargada de medir o cuantificar esa energía radiada

absorbida por parte de la materia, es la espectrofotometría. Más que una ciencia,
se trata de una técnica analítica que mide la intensidad de radiación que absorbe una
muestra (conjunto de elementos y/o elemento puro), en función de la longitud de onda
de la radiación incidente, permitiendo identificar las sustancias o elementos
orgánicos e inorgánicos de la muestra y sobre todo, cuantificar la concentración de

dichas sustancias o elementos. Dicha intensidad de radiación,

se mide por medio del cálculo de la absorbancia (A) y la transmitancia (T).
La transmitancia (T) se calcula a través del cociente entre la intensidad o potencia de
la radiación trasmitida (I) y la intensidad o potencia de la radiación incidente (Io). Por
su parte, la absorbancia (A) se calcula a partir del logaritmo en base 10 del cociente
entre la intensidad o potencia de la radiación incidente y la intensidad o potencia de la
radiación transmitida.
Para poder medir dichos parámetros, es necesario considerar antes que, por un
lado, la radiación a la que se somete a las sustancias y/o elementos de la muestra, actúa
como fotón o cuanto (paquetes de energía) y por otro lado, que ciertas moléculas
presentes en las sustancias y/o elementos a cuantificar, contienen grupos
cromóforos(grupos funcionales: dobles y triples enlaces de carbono, grupos carbonilo o
sistemas aromáticos), que en presencia de esos fotones, permiten la absorción de
parte de la energía del fotón (éste, al incidir sobre las moléculas, provoca una
excitación de los niveles electrónicos de la misma, aumentando su energía) que se
corresponde a una longitud de onda determinada de la radiación incidente y por

consiguiente, son responsables de la

coloración de la sustancia y/o elemento (color complementario al correspondiente
a la longitud de onda de la radiación que se absorbe). La energía restante del fotón,
no se absorberá y será la que finalmente constituya la radiación transmitida. La acción
de estos grupos cromóforos, además, puede verse intensificada por la presencia
de auxocromos (grupo amino, metilo, hidroxi), que añadiéndose como reactivos a la
muestra/solución, modifican la intensidad de la radiación transmitida (efecto
hipercrómico/hipsocrómico) y la intensidad de la radiación absorbida a diferentes
longitudes de onda (efecto batocrómico/hipsocrómico).
Para aquellas sustancias/elementos que absorben radiación dentro del espectro de
la radiación visible y ultravioleta, existe una ley llamada ley de Beer- Lambert-
Bouguer, descubierta por primera vez por Pierre Bouguer cuando definía la
cantidad de luz que se pierde al atravesar una extensión de materia, y
posteriormente por los matemáticos August Beer y Johann Heinrich Lambert, de
manera independiente. Esta ley permite conocer cuál es la relación entre la
transmitancia y la absorbancia, en una solución de concentración delimitada (a mayor
concentración, se modifican las propiedades de absorción de la muestra),

sometida a la acción de una radiación monocromática(de una

longitud de onda determinada, seleccionada para generar un pico de absorción
máximo). Según esta ley, en esas condiciones: “la intensidad de la luz transmitida,
disminuye exponencialmente a medida que la concentración molar de las
sustancias absorbentes, aumentan”. Respecto a la absorbancia, observaron que
ésta depende en un grado de proporción directa de la concentración molar y el
valor de absortividad (coeficiente de extinción, (ε)o grado de absorción de la
radiación por parte de una sustancia, en función de una longitud de onda dada) y de
la distancia recorrida por la radiación en la muestra. Para la identificación de las
sustancias/elementos esta ley Beer-Lambert, presenta algunas desviaciones.

Ley de Beer-Lambert

Tomando alícuotas de concentración progresiva de una muestra patrón de

concentración conocida y midiendo su absorbancia a diferentes longitudes de onda,
se obtiene la recta de calibración que permite, posteriormente, extrapolar la
concentración de las sustancias/elementos de la muestra o solución, a partir de su valor

de absorbancia.
Todo lo hasta ahora descrito, se refiere principalmente a la espectrofotometría de
absorción molecular en la región del espectro visible – ultravioleta. Otros tipos de
espectrofotometría de aplicación analítica son, la espectrofotometría de absorción y
emisión atómica (utiliza una llama como fuente de radiación, generando la
atomización de las muestras para medir la absorbancia y emisión de energía por
parte de los atómos ante la acción de la energía radiante) o la espectrofotometría
de infrarrojo cercano, medio y lejano (se miden las variaciones vibracionales de los
enlaces químicos de las moléculas).
Hasta aquí la parte teórica, pero para poder llevar a cabo la medición de una manera
práctica, fue necesaria la fabricación de un instrumento que realizara dichas
medidas. Este no fue otro que el espectrofotómetro, que consta de: una fuente de
radiación (lámpara de tungsteno para el espectro visible, lámpara de deuterio para
el espectro ultravioleta), un sistema monocromador (prisma + rendija de difracción de
entrada y de salida), una cubeta que contiene la muestra (de forma rectangular de
cuarzo, vidrio o plástico, transparentes y sin huellas o rayaduras), un fotodetector y
finalmente, un mecanismo para el registro de los datos. En este caso, se trata de
un espectrofotómetro de haz simple, puesto que contienen una única cubeta para la
muestra y es necesario realizar una calibración a absorbancia cero (sustancia que
transmite toda la radiación incidente) para luego medir la absorbancia de la
muestra. En el caso de los espectrofotómetros de doble haz, contienen dos cubetas
que permiten realizar el calibrado del blanco directamente en una de ellas, mientras
que en la otra se miden las muestras a estudiar.
A raíz de las investigaciones realizadas sobre la vitamina A y la necesidad por parte del
gobierno norteamericano, de cuantificar el contenido de dicha vitamina en las
raciones destinadas a los soldados combatientes de la II Guerra Mundial, se diseñó
y comercializó el primer espectrofotómetro de detección fotoeléctrica, pretendiendo
mejorar las características técnicas de los espectrofotómetros de detección
fotográfica (poco eficientes), hasta ese momento, los más habituales en las prácticas
analíticas. El encargado de tal hazaña, fue Arnold J. Beckman en 1941 y
rápidamente se convirtió en uno de los instrumentos analíticos, más empleados en
los laboratorios de la época de post-guerra, por su gran rapidez y exactitud en la
obtención de resultados (hasta el 99,99% de precisión).

Espectrofotómetro de Beckam.

A partir de este primer modelo, se crearon otros modificando aspectos tales como,
el tipo de monocromador empleado (se pasó de un prisma de cuarzo a un prisma de
cristal que ampliaba la resolución espectral al rango de ultravioleta) del tipo de fuente
de radiación o de un nuevo sistema de fotodetección, que permitía reducir el tiempo
de escaneado del espectro de longitudes de onda. A medida que transcurre el
tiempo, el coste de producción del espectrofotómetro se reduce y en 1954, se
fabrica el primer espectrofotómetro de doble haz, precursor del Spectronic de
1980,dónde se incluía además de la doble haz, un microprocesador de datos. Un
año antes, en el 1979 se fabricó el primer espectrofotómetro de diodos,
permitiendo reducir aún más el tiempo de escaneado
 del espectro de longitudes de onda de las
regiones de radiación visible, ultravioleta e infrarrojo. El avance del
espectrofotómetro continuó con nuevas mejoras en el sistema de registro
(incorporación de un sistema de almacenamiento informático, reprocesamientos y o
visualización de los datos en pantalla) o en la fuente de radiación (utilización de
lámparas de xenón, más eficaces y con una mayor vida útil). Cómo reconocimiento a
toda estas innovaciones introducidas en el campo del análisis químico, en 1989 se
le reconoció la Medalla Nacional de Ciencia del gobierno norteamericano, al señor
Arnold J. Beckman, por su liderazgo en el desarrollo de esta nueva técnica analítica.
Hasta aquí el repaso histórico – teórico sobre la espectroscopia y la
espectrofotometría,una de las técnicas analíticas que más influencia, a mi modo de
ver, tuvieron y tienen sobre el avance de las ciencias y técnicas analíticas. Espero
que os haya gustado, pues como dijo en su momento Bruce Merrifield, ganador del
premio Nobel de Química en 1984, el espectrofotómetro (y la espectrofotometría
como técnica) era “probablemente el instrumento más importante que se ha
desarrollado hacia el avance de la biociencia“.

https://unabiologaenlacocina.wordpress.com/2015/10/07/la-tecnica-analitica-number-one-la-
espectrofotometria/

http://web.mit.edu/spectroscopy/history/history-classical.html
http://www.researchgate.net/post/What_is_the_difference_between_spectrophotometry_sp
ectroscopy_and_spectrometry http://cellbiologyolm.stevegallik.org/node/8
http://cellbiologyolm.stevegallik.org/node/6
http://www.chemheritage.org/discover/collections/collection-items/scientific-
instruments/beckman-du-uv-vis-spectrophotometer-and-power-supply.aspx
http://www.labmanager.com/lab-product/2011/07/evolution-of-uv-vis-spectrophotometers
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/401539/exe-2%20de%20agosto/index.html
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50011a710
http://www.ehow.com/about_6595173_history-spectrophotometry.html
http://labsynergy.wordpress.com/2011/03/08/history-of-spectrophotometer/
http://www.slideshare.net/arturo.caballero/espectrofotometra-29439943?qid=82448fec-
b46b-4dc9-a3cf-468208fda0c6&v=default&b=&from_search=5
http://en.wikipedia.org/wiki/Spectrophotometry
http://es.wikipedia.org/wiki/Joseph_von_Fraunhofer
http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_spectroscopy