You are on page 1of 22

ACARA V

ISOLASI DNA TUMBUHAN

A. PELAKSANAAN PRAKTIKUM
1. Tujuan Praktikum
a. Mengetahui cara isolasi DNA dari beberapa jenis tumbuhan.
b. Mengetahui keefektifan beberapa deterjen untuk isolasi DNA dari beberapa
jenis tumbuhan.
c. Mengamati DNA dari sel tumbuhan.
2. Waktu Praktikum
Sabtu, 7 April 2018
3. Tempat Praktikum
Lantai III, Laboratorium Kimia Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Universitas Mataram.

B. LANDASAN TEORI
DNA merupakan molekul yang amat panjang, terdiri dari
ribuandeoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam satu urutan yang
bersifat khas bagi tiap organisme.Molekul ini biasanya berbentuk untaian
ganda.Kromosom sel prokarotik merupak satu molekul DNA yang berkaitan erat-erat
menjadi satu daerah inti atau nukleoid.DNA berfungsi untuk menyimpan informasi
genetic secara lengkap yang diperlukan untuk mencirikan struktur protein dan RNA
tiap-tiap spesies organisme. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai
perbedaan bentuk. Organisme prokariot memilki DNA berbentuk sirkular, sedangkan
organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam
inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf, 2001: 7).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.DNA
terdapat pada nucleus, mitokondria, dan kloroplas.Perbedaan ketiganya adalah DNA
nuklues berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan
DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon.Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.Sedangkan DNA nucleus memiliki
pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon ( Campbell, 2004: 12).
Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis
Crick.Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh
Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins.Watson dan Crick menyimpulkan bahwa
struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix).Untai ganda tersusun dari dua
rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu
satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke
5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’
berakhir dengan gugus OH.Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang
memghubungkan kedua basa nitrogenKomponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat,
dan basa nitrogen.Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula
ribose yang kehilangan satu atom oksigen.Basa yang ada pada DNA ada dua macam,
yaitu purin dan pirimidin.Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan
guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava,2004:218).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan persipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung. Deoxyribo nucleic acid (DNA) merupakan
senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa
yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi
selanjutnya, molekul DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, plastida dan sentriol.
Molekul DNA pada nukleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang,
sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran
(Suryo, 2012: 59).
DNA genom umumnya digunakan sebagai template untuk ISSR-PCR, dan oleh
karena itumerupakan bagian integral untuk eksperimen ISSR yang sukses.Seringkali
diabaikan dalamkebanyakan eksperimen utama, bagaimanapun ini adalah kebutuhan
untuk mendapatkan DNAberkualitas tinggi sebagai bahan awal, dan untuk
menstandardisasi kuantitas (jumlah) DNAtemplate yang digunakan dalam setiap reaksi
PCR.Ekstrak DNA, tergantung pada metodeekstraksi dan jenis sampel, dapat
mengandung lembaran-lembaran sisa sel dan komponen yangberpotensi menghambat
reaksi PCR. Akibatnya, lebih sedikit, jika ada, fragmen DNA akandiperkuat
dibandingkan dengan yang kita harapkan saat menggunakan DNA yang
dimurnikan.Selanjutnya, dengan menggunakan jumlah DNA yang tidak konsisten
selama reaksi PCR akanmenghasilkan konsentrasi produk PCR yang tidak konsisten,
yang mempengaruhi intensitas pitadi seluruh sampel. Dalam kebanyakan kasus, metode
ekstraksi DNA konvensional akan cukupuntuk mendapatkan DNA yang berkualitas
baik. Jika tidak, pemurnian lebih lanjut dari ekstrakDNA menggunakan alat ekstraksi /
pemurnian DNA berbasis kolom yang tersedia secarakomersial lebih
membantu.Kemudian, konsentrasi DNA disesuaikan, sesuai dengan standarperkiraan,
sebelum digunakan dalam reaksi PCR.Biasanya, 10-50 ng DNA berkualitas
cukupbagusuntuk setiap reaksi (W.L. Ng, 2015).
Perkembangan teknologi DNA rekombinan memungkinkan para ilmuan untuk
mewujudkan organisme rekombinasi genetik untuk meningkatkan proses bioremidiasi.
Upaya untuk mewujudkan tujuan tersebut diantaranya dengan mempelajari berbagai
mekanisme yangterjadi pada organisme bioremidiator secara luas hingga tingkat
molekuler.Oleh karena itu, tahapan isolasi DNA merupakan langkah penting yang harus
dilakukan dengan baik. Variasi proses pelisisan dan kemurnian DNA menjadi dasar
yang berpengaruh pada keberhasilan analisis DNA dengan berbagai metode seperti
PCR. Secara umum, isolasi DNA genom bakteri melibatkan tiga tahapan yaitu
perusakan sel, ekstraksi DNA, danpurifikasi DNA.Prokariot memiliki DNA inti yang
terkonsentrasi di wilayah yang tidakdiselubungi oleh membran ganda (nukleus) seperti
pada sel eukariot.Padakebanyakan bakteria, molekul DNA berukuran besar terorganisasi
dalam bentuk kromosom sirkular. Proses pengeluaran DNA dengan cara diekstraksi
atau dilisiskan biasanya dilakukan denganhomogenasi dengan penambahan bufer
ekstrasi atau bufer lisis untuk mencegah rusaknya DNA. Isolasi DNA bakteri dimulai
dengan melisiskan atau merusak sel bakteri. Proses ini sangat penting
untukpenghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat.
Bakteri gram positif memilikistruktur dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang
tebal dan kuat serta asam teichoic, sedangkan bakterigram negatif memiliki lapisan luar
lipopolisakarida dan hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (Pambudiono,
2016).
Ekstraksi DNA dan pemilihan primer merupakan suatu hal mendasar yang harus
dilakukan dalam studi molekular, terutama dalam identifikasi dan penentuan keragaman
genetik.Penelitian ini bertujuan untuk menentukan primer RAPD yang menghasilkan
produk PCR yang jelas dan dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut pada
kamboja.Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah metode CTAB yang telah
dimodifikasi.Ekstraksi DNA kamboja menggunakan buffer ekstraksi CTAB dengan
modifikasi yang dilanjutkan dengan purifikasi menggunakan NucleoSpin® Gel dan
PCR Clean Up Kit menghasilkan pita DNA yang disertai dengan smear. Hal ini berarti
telah terjadi degradasi DNA.Kerusakan DNA genom dapat terjadi akibat degradasi
senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau kerusakan akibat
penanganan fisik.Keberadaan polisakarida dan metabolit sekunder dalam sel tanaman
sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat.Degradasi DNA dapat diminimalkan
dengan penggunaan liquid nitrogen dan penambahan senyawa pereduksi β-
merkaptoetanol. Senyawa β- merkaptoetanol berfungsi untuk mencegah proses oksidasi
senyawa fenolik sehingga dapat menghambat aktivitas radikal bebas oleh oksidasi fenol
terhadap asam nukleat (Martida, 2016).
Ekstraksi DNA genom merupakan aspek penting dalam penelitian biologi
molekuler tanaman.Tujuan penelitian ini adalah untuk merekomendasikan metode
ekstraksi DNA genomik yang murah dan efisien untuk beberapa spesies buah penting
yang terdapat di Sri Lanka. Metode ekstraksi DNA genom tanaman yang dimodifikasi
yang dijelaskan oleh Doyle dkk., dan Cheng et al., dan metode ekstraksi tanaman
gantung (Qiagen) diterapkan pada delapan spesies buah yang berbeda seperti Mangifera
indica (Mangga), Anacardium excelsum (jambu mete), Syzygium jambos (apel mawar),
Punica granatum (Pomagranate), Averrhoa carambola (buah belimbing), Spondias
dulsis(Ambarella), Carica papaya(Pepaya) dan Annona muricata (Annona).
Berdasarkan jumlah DNA genom yang diekstraksi yang diuji dengan mengukur
absorbansi pada 260 nm menggunakan spektrofotometer Nanodrop® ND-1000, kualitas
yang ditentukan oleh perbandingan A260 / A280 dan kualitas DNA yang dapat
diekstraksi yang ditentukan oleh elektroforesis gel agarosa horisontal menggunakan 1%
Agarosa dalam buffer TBE dengan voltase konstan 60V, metode yang dijelaskan oleh
Cheng et al dan kit ekstraksi DNA Genom menghasilkan DNA berkualitas baik dengan
konsentrasi yang memuaskan untuk semua spesies buah yang diuji. Oleh karena itu,
metode Cheng et al yang dimodifikasi dapat direkomendasikan untuk ekstraksi DNA
yang efisien dan hemat biaya dari spesies buah dan bukan metode nabati DNeasy yang
mahal dan tersedia secara kimiawi (Lakmini, 2015).
C. ALAT DAN BAHAN

1. Alat-alat Praktikum
a. Aluminium foil
b. Batang pengaduk
c. Blender
d. Corong kaca 50 mm
e. Corong kaca 60 mm
f. Gelas kimia 100 mL
g. Gelas kimia 250 mL
h. Gelas kimia 600 mL
i. Gelas ukur 10 mL
j. Gelas ukur 100 mL
k. Kertas saring
l. Kertas label
m. Pipet tetes
n. Pipet volume 5 mL
o. Pisau
p. Rak tabung reaksi
q. Rubber bulb
r. Plastik cetik
s. Stop watch
t. Tabung reaksi
u. Timbangan analitik

2. Bahan-bahan Praktikum
a. Aquades
b. Bawang Bombay
c. Brokoli
d. Buah papaya
e. Buah pisang
f. Buah tomat
g. Deterjen bubuk
h. Deterjen krim
i. Es batu (H2O(s))
j. Garam dapur (NaCl(s))
k. Larutan etanol (C2H5OH(aq)) 96%

D. SKEMA KERJA
1. Pembuatan etanol dingin

Es batu

 Dimasukkan ke dalam gelas kimia 600 mL


 +100 mL etanol 96% dimasukkan dalam
gelas kimia
 Ditutup
 Gelas kimia berisi etanol diinkubasi

Hasil

2. Pembuatan larutan tumbuhan


50 g daging buah (Bawang Bombay, Brokoli, Buah papaya, Buah
pisang), Buah tomat

 Dimasukkan ke dalam blender


 + 50 mL aquades
 Dihaluskan 40 detik

Hasil

3. Isolasi DNA dengan deterjen bubuk

5 g deterjen bubuk

 Dimasukkan ke dalam gelas kimia 100 mL


 + 100 mL aquades
 Diaduk selama 15 menit

Hasil
4 ml larutan deterjen bubuk

 Dimasukkan ke dalam tabung reaksi


 + 4 mL larutan tumbuhan
 + 1 spatula garam dapur dan diaduk 10
menit
 Disaring sebanyak 2 kali
Hasil

6 mL larutan hasil
saringan
 Dimasukkan dalam tabung reaksi
 + 5 mL etanol 96% dingin melalui dinding
tabung
 Dibiarkan selama 5 menit
 Dicatat perubahan DNA yang terjadi
 Dicatat waktu yang diperlukan untuk
munculnya DNA
 DNA diambil
Hasil

4. Isolasi DNA dengan deterjen krim

5 g deterjen krim

 Dimasukkan ke dalam gelas kimia 100 mL


 + 100 mL aquades
 Diaduk selama 15 menit
Hasil
4 ml larutan deterjen krim

 Dimasukkan ke dalam tabung reaksi


 + 4 mL larutan tumbuhan
 + 1 spatula garam dapur dan diaduk 10
menit
 Disaring sebanyak 2 kali
Hasil

6 mL larutan hasil
saringan
 Dimasukkan dalam tabung reaksi
 + 5 mL etanol 96% dingin melalui dinding
tabung
 Dibiarkan selama 5 menit
 Dicatat perubahan DNA yang terjadi
 Dicatat waktu yang diperlukan untuk
munculnya DNA
 DNA diambil

Hasil

E. HASIL PENGAMATAN
1. Pembuatan Larutan Buah
No Langkah Kerja Hasil Pengamatan
1 50 gram daging buah (bawang bombay, Dagingbuah dibuat menjadipotongan-
brokoli, pepaya, pisang, tomat) dipotong potongan kecil.
kecil-kecil
2 Dimasukkan ke dalam blender, Didapatkan daging buah seperti bubur
ditambahkan 50 mL aquades, dihaluskan (slurry).
dengan blender selama 40 detik Bawang bombay = putih kehijauan.
Brokoli = hijau tua.
Pepaya = orange.
Pisang = putih kecoklatan
Tomat = orange kemerahan.

2. Isolasi DNA dengan Detergen Bubuk


No Langkah Kerja Hasil Pengamatan
1 5 gram detergen bubuk dilarutkan dalam Warna awal detergen putih. Setelah
100 mL aquades, diaduk perlahan selama ditambah aquades, detergen larut dan
15 menit terbentuk larutan berwarna putih keruh.
2 4 mL larutan detergen bubuk Didapatkan campuran dari
dicampurkan dengan 4 mL larutan buah bawang bombay = Hijau muda keruh.
Brokoli = hijau lumut keruh
Pepaya = orange
Pisang = putih tulang.
Tomat = putih keruh.
3 Ditambahkan 1 spatula garam dapur Garam larut dalam campuran. Larutan
kemudian dikocok campuran tidak mengalami perubahan
warna.
4 Campuran disaring dengan kertas saring Didapatkan larutan campuran menjadi
lebih jernih dan warna larutan tetap.
5 Larutan hasil penyaringan dimasukkan Kedua larutan tidak bercampur, dimana :
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan  Papaya = warna orange dibagian
5 mL larutan etanol 96% dingin melalui bawah, bagian tengah terdapat
dinding tabung reaksi dan didiamkan benang/serabut putih dan bagian atas
hingga terbentuk DNA bening.
 Pisang = warna keruh dibagian bawah,
dibagian atas berwarna bening , dan
benang/serabut putih yang melayang
dipermukaan.
 Tomat = pada bagian bawah, larutan
berwarna kuning bening, bagian
tengah terdapat benang/serabut putih,
dan bagian atas bening.
 Bawang Bombay = pada bagian bawah
berwarna hijau muda, bagian tengah
terdapat benang/serabut putih, dan
bagian atas bening.
 Brokoli = pada bagian bawah berwarna
hijau muda, bagian tengah terdapat
benang/serabut putih, dan bagian atas
bening.
6 DNA diambil dengan pipet tetes Tidak terjadi perubahan warna pada DNA
masing-masing tumbuhan.

3. Isolasi DNA dengan Detergen Krim


No Langkah Kerja Hasil Pengamatan
1 5 gram detergen krim dilarutkan dalam Warna awal detergen putih. Setelah
100 mL aquades, diaduk perlahan selama ditambah aquades, detergen larut dan
15 menit terbentuk larutan berwarna putih keruh.
2 4 mL larutan detergen krim dicampurkan Didapatkan campuran dari
dengan 4 mL larutan buah bawang bombay = Hijau muda keruh.
Brokoli = hijau lumut keruh
Pepaya = orange
Pisang = putih tulang.
Tomat = putih keruh.
3 Ditambahkan 1 spatula garam dapur Garam larut dalam campuran. Larutan
kemudian dikocok campuran tidak mengalami perubahan
warna.
4 Campuran disaring dengan kertas saring Didapatkan larutan campuran menjadi
lebih jernih dan warna larutan tetap.
5 Larutan hasil penyaringan dimasukkan Kedua larutan tidak bercampur, dimana :
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan  Papaya = warna orange bening, bagian
5 mL larutan etanol 96% dingin melalui tengah terdapat benang/serabut putih
dinding tabung reaksi dan didiamkan dan bagian atas bening.
hingga terbentuk DNA  Pisang = warna putih keruh dibagian
bawah, dibagian atas berwarna bening ,
dan bagian tengah terdapat
benang/serabut putih.
 Tomat = pada bagian bawah larutan
berwarna kuning bening dan terdapat
benang/serabut putih, dan bagian atas
bening.
 Bawang Bombay = pada bagian bawah
berwarna hijau keruh, bagian tengah
terdapat benang/serabut putih, dan
bagian atas bening.
 Brokoli = pada bagian bawah berwarna
hijau lumut, bagian tengah terdapat
benang/serabut putih, dan bagian atas
bening.
6 DNA diambil dengan pipet tetes Tidak terjadi perubahan warna pada DNA
masing-masing tumbuhan.

4. Tabel Kerja
Pengamatan
No. Buah Deterjen
Warna Bentuk Waktu Jumlah
1. Pepaya Bubuk Orange Benang terpilin 2,35 menit ++
Krim Orange Benang terpilin 3,43 menit +
2. Pisang Bubuk Putih tulang Benang terpilin 2,58 menit +++
Krim Putih tulang Benang terpilin 1,11 menit +++
3. Tomat Bubuk Putih Keruh Benang terpilin 2,13 menit +
Krim Putih Keruh Benang terpilin 3,18 menit +
4. Bawang Bubuk Hijau muda Benang terpilin 2 menit ++
Bombay keruh
Krim Hujau muda Benang terpilin 4,42 menit ++
keruh
5. Brokoli Bubuk Hijau lumut Benang terpilin 4,30 menit +++
keruh
Krim Hijau lumut Benang terpilin 4,33 menit +++
keruh

Keterangan :
+ = sedikit
++ = banyak
+++ = sangat banyak
F. ANALISIS DATA

1. Pepaya dengan deterjen bubuk


Keterangan:
Warna larutan buah pepaya yang sudah
ditambah dengan detergen bubuk dan etanol
dingin adalah orange bening. DNA mulai
telihat setelah 2,35 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang banyak.

2. Pepaya dengan deterjen krim


Keterangan:
Warna larutan buah pepaya yang sudah
ditambah dengan detergen krim dan etanol
dingin adalah oranye bening. DNA mulai
telihat setelah 3,43 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang sedikit.

3. Pisang dengan deterjen bubuk


Keterangan:
Warna larutan buah pisang yang sudah
ditambah dengan detergen bubuk dan
etanol dingin adalah agak kecoklatan.
DNA mulai telihat setelah 2,58 menit
dengan bentuk benang tepilin dan jumlah
yang cukup banyak.
4. Pisang dengan deterjen krim
Keterangan:
Warna larutan buah pisang yang sudah
ditambah dengan detergen krim dan etanol
dingin adalah putih tulang. DNA mulai
telihat setelah 1,11 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang cukup
banyak.

5. Tomat dengan deterjen bubuk


Keterangan:
Warna larutan buah tomat yang sudah
ditambah dengan detergen bubuk dan
etanol dingin adalah putih keruh. DNA
mulai telihat setelah 2,13 menit dengan
bentuk benang terpilin dan jumlah yang
sedikit.

6. Tomat dengan deterjen krim


Keterangan:
Warna larutan buah tomat yang sudah
ditambah dengan detergen krim dan etanol
dingin adalah putih keruh. DNA mulai
telihat setelah 3,18 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang sedikit.
7. Bawang Bombay dengan deterjen bubuk
Keterangan:
Warna larutan bawang bombay yang sudah
ditambah dengan detergen krim dan etanol
dingin adalah hijau muda keruh. DNA
mulai telihat setelah 2 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang banyak.

8. Bawang Bombay dengan deterjen krim


Keterangan:
Warna larutan bawang bombay yang sudah
ditambah dengan detergen krim dan etanol
dingin adalah hijau muda keruh. DNA
mulai telihat setelah 4,42 menit dengan
bentuk benang tepilin dan jumlah yang
banyak.

9. Brokoli dengan deterjen bubuk


Keterangan:
Warna larutan bokoli yang sudah ditambah
dengan detergen bubuk dan etanol dingin
adalah hijau lumut keruh. DNA mulai
telihat setelah 4,30 menit dengan bentuk
benang tepilin dan jumlah yang cukup
banyak.
10. Brokoli dengan deterjen krim
Keterangan:
Warna bokoli yang sudah ditambah dengan
detergen krim dan etanol dingin adalah
hijau lumut keruh. DNA mulai telihat
setelah 4,33 menit dengan bentuk benang
tepilin dan jumlah yang cukup banyak.

G. PEMBAHASAN
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting
dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik
makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. DNA juga dapat diartikan
sebagai asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA terdapat di nukleus,
mitokondria, dan kloroplas. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi DNA ini, yaitu: DNA
nukleus berbentuk linear dan berhubungan sangat erat dengan protein histon, sedangkan
DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berhubungan dengan
protein histon. DNA memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen-
komponen gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya.
Isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol
dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.
Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-
masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air
tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar
air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan
semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Adapun praktikum kali ini yaitu isolasi DNA tumbuhan bertujuan untuk
mengetahui cara isolasi DNA dari beberapa jenis tumbuhan, mengetahui keefektifan
beberapa deterjen untuk isolasi DNA dari beberapa jenis tumbuhan dan mengamati
DNA dari sel tumbuhan
Isolasi DNA merupakanlangkah tepat untuk mempelajari DNA. Setiap tanaman
pasti memiliki DNA dan DNA merupakan molekul utama yang mengkode semua
informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. Dalam DNA
ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat
yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk
hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang
menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.
Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu
biokimia. Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhihasil
yang akan diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasiDNA
mencakup tiga hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnianyang
tinggi, DNAnya harus utuh, dan jumlahnya mencukupi (konsentrasi tinggi). IsolasiDNA
juga merupakan langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari populasi DNAkompleks
dan dalam analisis struktur genom dan ekspresi gen. Kuantitas, kualitas danintegritas
DNA akan mempengaruhi hasil yang diperoleh secara langsung..
Langkah pertama yang dilakukan dalam isolasi DNA adalah membuka jaringan
dari bahan yang akan diisolasi. Bahan yang akan digunakan pada praktikum ini adalah
tumbuhan, oleh karena itu teknik yang digunakan harus cukup kuat dalam membuka sel,
karena adanya dinding sel, tetapi tidak sampai merusak isi sel, apalagi sampai
memotong DNA. Bahan yang digunakan sebaiknya dari bahan yang segar, karena bahan
yang sudah terlalu lama dan tidak segera diisolasi akan mengandung DNA yang sudah
terdegradasi dan dapat juga terkontaminasi dengan DNA eksogen, misalnya oleh DNA
bakteri.
Preparasi DNA yang panjang dan murni merupakan sesuatu yang sangat
diharapkan.Tekanan yang dibutuhkan untuk membuka dinding sel juga dapat memotong
DNA, sehingga diperlukan tindakan yang harus sungguh-sungguh menjaga DNA yang
dihasilkan dan panjangnya.Nukleus yang utuh merupakan sumber yang baik untuk DNA
tumbuhan yang panjang, nucleus tersebut bisa sulit untuk diisolasi dalam jumlah yang
banyak, dan teknik yang dibutuhkan sangat sulit.Polisakarida dan tannin merupakan
masalah utama dalam tumbuhan karena mereka sulit dipisahkan dari DNA.
Secara umum prosedur ekstraksi untuk isolasi DNA harus memenuhi tiga
kriteria utama: 1. Harus bisa menghasilkan DNA yang murni, untuk penggunaan
selanjutnya.Misalnya untuk analisa RFLP, harus digunakan DNA yang cukup murni
untuk bisa dipotong oleh restriction endonuclease dan ditransfer ke membrane untuk
analisis Southern.Untuk analisis polymerase chain reaction (PCR) ekstrak DNA harus
tidak mengandung kontaminan DNA yang dapat mengganggu PCR.2. DNA harus utuh
untuk memberikan pola migrasi yang akurat pada gelelectriphoresis.3. DNA yang
dihasilkan harus mencukupi.4. Prosedur yang digunakan harus cepat, sederhana dan
murah, dan jika memungkinkan bisa dihindari penggunaan bahan kimia yang berbahaya.
Penelitian yang telah dilakukan oleh Bahl and Pfenninger, 1996, menunjukkan
bahwa DNA dengan berat molekul yang tinggi dapat dihasilkan dari beberapa jaringan
menggunakan detergen dari berbagai merk. Tidak ada perbedaan yang signifikan pada
kualitasnya dan hasil isolasi DNA yang diperoleh dapat dideteksi dengan metode lain
dan DNA yang diperoleh dapat digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR.
Konsentrasi detergen yang direkomendasikan adalah 100 l detergen cair ditambah
dengan 1,5 akuades. Bubuk sabun cuci yang dijual di pasaran biasaya mengandung
campuran detergen, (untuk menghilangkan bahan-bahan organik), enzim (misalnya
protease dan lipase), dan kompleks penkhelat (misalnya EDTA), seperti kandungan
pada buffer yang biasa digunakan pada isolasi DNA.
Pada praktikum ini sebelum melakukan isolasi DNA tumbuhan dengan deterjen
bubuk maupun krim dilakukan pembuatan etanol dingin dan pembuatan larutan
tumbuhan.Pembuatan etanol dingin dilakukan dengan menginkubasinya menggunakan
es batu, tujuan pembuatan etanol dingin adalah untuk mengendapkan DNA pada proses
isolasi DNA itu sendiri, semakin dingin etanol semakin cepat etanol mengendapkan
DNA. Kemudian pembuatan larutan tumbuhan dengan cara memperkecil luas
permukaan buah dengan cara diblender yang sebelumnya telah dilarutkan ke dalam
aquades. Daging tumbuhan yaitu pepaya, pisang, tomat, bawang bombay dan brokoli
diblender selama 40 detik. Tujuannya yaitu untuk menghancurkan membran dan
dinding sel dari tumbuhan sehingga DNA bisa keluar dari sel dan masuk ke larutan.
Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan
pada DNA. Waktu pemblenderan sampel daging buah tidak boleh kurang dan lebih dari
40 detik, hal ini disebabkan apabila kurang dari 40 detik kemungkinan untuk DNA
masih banyak didalam sel tumbuhan dan tidak keluar semua di karenakan membran dan
dinding sel tidak hancur. Dan jika waktunya lebih dari 40 detik maka DNA yang ada
didalam sel tersebut akan hancur dan rusak. Setelah diblender bentuknya menjadi
seperti bubur. Warna sampel bawang bombay, brokoli, pepaya, pisang dan tomat setelah
diblender berturut-turut yaitu hijau muda, hijau tua, orange, coklat dan orange
kemerahan.Dengan perlakuan tersebut isolasi DNA pun bisa dilakukan karena dinding
sel telah lisis.
Isolasi DNA dilakukan dengan deterjen bubuk dan krim.Penambahan detergen
dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan rusaknya
membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan
protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-detergen
kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung
hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk
suatu ikatan kimia.Detergen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat
menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membrane
akan rusak dan melisiskan isi sel.Selain itu detergen juga berfungsi untuk melisiskan
barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu
merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa
polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang
berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan
keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat
merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa
"memakan" DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan
mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan
membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang
memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat.
Isolasi DNA dengan deterjen bubuk dan krim memiliki langkah yang sama,
diawali dengan dilarutkannya 5 gram deterjen ke dalam 100 mL aquades, kemudian
diaduk perlahan selama 15 menit dan usahakan jangan sampai berbusa, hal ini bertujuan
untuk mempermudah proses pengamatan munculnya gelembung-gelembung DNA
sekaligus untuk melisis sel pada buah. Detergen bubuk yang telah di latutkan berwarna
putih kebiruan dan larutan detergen krim berwarna putih keruh.Detergen yang sudah
dilarutkan tadi kemudian masing - masing dicampur dengan 4 mLsetiap tumbuhanyang
sudah diblender.
Selanjutnya campuran ekstrak tumbuhan dan detergen (krim dan bubuk) masing-
masing sampel ditambahkan 1 batang pengaduk garam dapur halus (NaCl) dan diaduk
selama 10 menit (dihomogenkan).. Garam memegang peranan penting yaitu untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya
terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya
lysing buffer. Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang
dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif
fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak
satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan denagn kutub negatif
fosfat DNA. DNA akan terkumpul. Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer,
garam juga membantu proses pemekatan DNA. Pengadukan yang dilakukan bertujuan
untuk menghomogenkan larutan, selain itu tujuan pengadukan juga untuk merusak
dinding dan membran sel agar sel mengalami lisis, bila sel lisis maka DNA akan keluar
dari sel dengan warna putih. Pengadukan tidak boleh dilakukan dengan keras, jika
pengadukan dilakukan dengan keras maka DNA akan rusak dan dengan adanya buih
DNA akan sulit teramati karena warnanya sama dengan warna buih detergen.
Langkah berikutnya adalah melakukan penyaringan hasil campuran sebelumnya
sebanyak 2 kali untuk memisahkan kotoran yang mengendap dengan seratnya yang
banyak.Selain itu proses penyaringan dilakukan agar komponen-komponen sel lainnya
yang tidak diinginkan selain sampel DNA, tidak mengkontaminasi sampel DNA yang
akan diisolasi. Selain itu juga tujuannnya yaitu untuk memisahkan residu dengan
filtratnya.
Kemudian larutan hasil saringan masing-masing sampel dimasukan kedalam
tabung reaksi dan ditambahkan etanol dingin melalui dinding tabung yang bertujuan
agar tidak merusak proses pemurnian DNA pada bagian tengah. Penambahan ini juga
berfungsisebagai pengkoagulan DNA, dimana molekul etanol absolut dingin yang tak
bermuatan akan menarik molekul DNA yang bermuatan negative sehingga terjadi
koagulasi atau penggumpalan. Sehingga DNA yang bersifat transparan dapat terlihat
dengan jelas berupa benang-benang halus pada lapisan tengah campuran buah dan
sabun. Etanol yang digunakan harus dalam keadaan dingin, sebab jika etanol tersebut
dalam keadaan panas, maka DNA yang terkandung dalam ekstrak buah akan mengalami
denaturasi (kerusakaan) sehingga tidak dapat teramati.
Perubahan bentuk DNA yang dihasilkan oleh sumua jenis sampel pada
percobaan ini adalah berbentuk benang terpilin (serabut) dengan warna secara umum
adalah putih. Adanya hasil warna dan perbedaan lama waktu yang dibutuhkan untuk
menghasilkan DNA dipengaruhi oleh beberapa factor, selain karena masing-masing
deterjen, sumber DNA memiliki kemampuan yang berbeda-beda. Meskipun isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa
polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian
DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-
masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi
kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA
yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Dari hasil data yang diperoleh dalam praktikum yang telah dilakukan, pisang dan
brokoli menghasilkan benang berpilin yang banyak. Namu pada brokoli memerlukan
waktu yang lebih lama hampir mencapai 5 menit. Namun pada pisang paada deterjen
bubuk memerlukan waktu 2,58 menit sedangkan pada krim 1,11 menit.
Berdasarkan literatur didapatkan hasil bahwa antara detergen cair, bubuk, dan
krim yang seharusnya mempunyai daya rusak paling tinggi dalam memecah membran
sel adalah detergen cair. Karena di dalam detergen cair mengandung konsentrasi yang
tinggi misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan
disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada
dalam detergen cair. Detergen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih,
detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat
mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau
hampir sama dengan filtrat
.
H. KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :


1. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA
murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Untuk melakukan
isolasi DNA metode yang digunakan pada dasrnya ada tiga yaitu ekstraksi, pelisisan
sel dan pemurnian. Isolasi DNA beberapa jenis tumbuhan dilakukan dengan cara
mekanik dan kimiawi, cara mekanik yaitu dengan merusak dinding dan membrane
sel dan juga membrane inti yang mana pada praktikum ini digunakan blender;
sedangkan cara kimiawi yaitu dengan menggunakan deterjen, etanol dan garam
untuk membantu presipitasi DNA.
2. Kefektifan suatu deterjen untuk mengisolasi DNA dilihat dari tingkat daya rusaknya
terhadap membrane sel, semakin tinggi daya rusaknya semakin mudah DNA diamati,
dalam praktikum ini deterjen yang paling efektif dalam mengisolasi DNA adalah
deterjen bubuk.
3. DNA dari sel tumbuhan dapat diamati melalui percobaan isolasi DNA menggunakan
deterjen dimana DNA akan tampak dari hasil presipitasinya, semakin banyak hasil
presipitasinya semakin mudah diamati.Dari kelima macam tumbuhan yang
digunakan untuk sumber DNA menghasilkan DNA berbentuk benang terpilin
(serabut) dengan warna sesuai dengan warna asli buah tersebut.
DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N.A., L.G. Mitchell and J.B. Reece. 2004. Biology: Concept and Connections. The
Benjamin/Cummings Pub. Co., Inc.

Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta : Sagung Seto.

Lakmini, J.A.A., dan R. Kapilan. 2015. Efficient Genomic DNA Extraction From Leaves Of
Some Economically ImportantFruit Species of Sri Lanka. Jaffna, Sri Lanka:
University of Jaffna.

Martida, V., dan M. Pharmawati.2016. Pemilihan Primer RAPD (Random Amplified


Polymorphic DNA) pada PCR (Polymerase Chain Reaction) Tanaman Kamboja
(Plumeria Sp.). Bukit Jimbaran: Universitas Udayana.

Pambudiono, A., E. Suarsini, dan M. Amin. 2016. Isolasi DNA Genom Bakteri Potensial
Pengkelat Logam Berat Kadmium dari Limbah Cair Penepungan Agar.Malang:
Universitas Negeri Malang.

Sadava, D. 2004. Life: The Science of Biology. 5th ed. Sinauer Associates, Inc.

Suryo. 2012. Genetika Strata 1. Yogyakarta: UGM Press.

W.L. Ng dan S.G. Tan. 2015.Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers:Are We Doing It
Right?. Selangor: Universiti Putra Malaysia.