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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA


CÁTEDRA DE FÍSICA

Informe de Espectrofotometría
2do Cuatrimestre 2017

Nota: 6 El informe está bien en general pero no discutieron sus


resultados (los ejes según los cuales hacerlo estaban explicitados
en la rúbrica)

Autores:
Comisión 01 - Grupo 23: Bastiani Santiago, Camacho Vidal Cristina, Otero Daniela,
Rivanera Camila, Seva Nicolás, Simonotti Ornella Fabiola.

Docentes:
Fischerman Laura, Kouyoumdzian Nicolás, Monczor Federico, Nievez Luciano, Scochera
Florencia, Yaneff Agustín.

Fecha de entrega:
31/10/2017

Formatted: Left
❏ OBJETIVOS

● Analizar y realizar los controles espectrofotométricos.


● Diseñar el protocolo de trabajo para la cuantificación de un analito incoloro en una
muestra, utilizando una técnica colorimétrica para su determinación.
● Determinar la longitud óptima de trabajo correspondiente a la solución coloreada
mediante un barrido espectral.
● Determinar la concentración de colágeno hidrolizado en una muestra mediante el
uso de la técnica de Biuret para determinación de proteínas.

❏ FUNDAMENTOS

Se conoce como Espectrofotometría a una serie de técnicas analíticas que se


fundamentan en la espectroscopía atómica y molecular. Dichas técnicas permiten obtener
información a partir del análisis de las distintas interacciones de las radiaciones
electromagnéticas con la materia. Utiliza la zona de UV - Visible - IR cercano del espectro
electromagnético.

La espectrofotometría implica la determinación cualitativa de la intensidad absorbida de un


haz de luz monocromática al atravesar una muestra. Si se ilumina la solución con luz
monocromática, parte de la intensidad de esa luz (Io) será absorbida por las moléculas que
están en dicha solución (Ia), parte se reflejará (Ir) y parte será transmitida:

● Figura 1: Luz que incide sobre un tubo conteniendo una solución coloreada

Para hacer referencia a la intensidad de luz absorbida por una sustancia se definen los
parámetros de transmitancia y absorbancia. La transmitancia (T) se define como la
fracción de intensidad de luz que se transmite (It) a través de la solución respecto de la
intensidad de luz incidente (Io). El espectrofotómetro determina transmitancia a partir de la
medida de intensidad transmitida comparándola con la intensidad incidente. Por otra parte,
la absorbancia (Abs) se define a partir de la transmitancia, mediante un cálculo matemático.
El parámetro absorbancia es creado a partir de una relación matemática que surge de la
Ley de Lambert-Beer:
Abs = -log T = a.l.c,
en donde l representa al paso óptico, c a la concentración y a a la absortividad, una
constante propia de cada sustancia que depende de la longitud de onda, la temperatura, y
el solvente con el que se trabaja. Se puede definir como la absorbancia que presenta una
solución de concentración unitaria de sustancia, observada bajo un espesor unitario.

Las soluciones que cumplen con la Ley de Lamber-Beer presentan una relación lineal entre
su concentración y su absorbancia siempre que se trabaje con luz monocromática y bajas
concentraciones. No obstante, son comunes las desviaciones debidas a factores de orden
físico, químico o instrumental.

Por otro lado, además de las medidas que hay tomar en cuanto a la solución que se utiliza
para trabajar, se debe comprobar que el espectrofotómetro presente un buen
funcionamiento ya que de ello depende la calidad de los resultados que se obtienen. Por
ello se realizan los controles espectrofotométricos, que permiten controlar y analizar
determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de los rangos de aceptabilidad
establecidos. Dichos controles son:
● Control de Luz espuria accidental: la luz espuria accidental o errática es toda luz que
llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya absorbancia se quiere medir,
pudiendo ser de la misma o de diferente longitud de onda que la seleccionada. Commented [1]: Luz parásita.
Puede ocurrir por reflexiones internas dentro de la cubeta, luz que pase por arriba de
la muestra cuando el volumen cargado es insuficiente, entrada de luz externa, etc.

● Control de volumen mínimo: se considera como volumen mínimo, al mínimo volumen


contenido en una cubeta a partir del cual la lectura se estabiliza y no varía con el
agregado de más líquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la
solución y no pase por encima de la muestra o por el menisco, lo que produciría
resultados erróneos. Por otro lado, se busca minimizar el volumen de muestra a
utilizar al mínimo necesario, con el fin de ahorrar muestra y reactivo. En la práctica
no se coloca un volumen igual al volumen mínimo, sino que se utiliza un volumen
superior a éste en un 20% que se denomina volumen de trabajo.

● Control de cubetas: se comprueba la similitud de las cualidades ópticas entre


cubetas, de modo de poder utilizar varias en el proceso de medida sin que este se
vea afectado.

● Control de centro de banda: se verifica la concordancia entre la longitud de onda


fijada con el selector del equipo (aquella que se lee en el display) y la longitud de
onda que efectivamente llega a la muestra. Luego de realizado el control, el
resultado puede indicar que la λ real y la leída coincidan o bien puede haber una
diferencia entre ambas. Esa diferencia se la conoce como desplazamiento o
corrimiento de la longitud de onda y se mide en nm. Si esta es pequeña y entra
dentro del rango de aceptabilidad estipulado se la puede considerar como error
sistemático y corregir. En caso contrario se debe realizar un ajuste de la escala de
longitudes de onda.

● Control de linealidad fotométrica: tiene como finalidad comprobar que el equipo


responda linealmente y evaluar hasta qué valores de absorbancia la respuesta del
equipo es lineal. Para ellos se utilizan sustancias que ya se sabe que cumplen con la
ley de Lambert-Beer en las condiciones de trabajo elegidas. La fotodetección debe
ser concordante con el valor de absorbancia esperado.
● Control de veracidad fotométrica: se analiza la veracidad del método
espectrofotométrico. Las fallas que pueden ocasionar que no se cumpla con este
control son el envejecimiento de la lámpara, el agotamiento del fototubo, un defecto
en la calibración de la longitud de onda, la elevada absorción por parte de las
cubetas, una muestra mal centrada respecto del sistema óptico del instrumento, etc.

● Control de la precisión fotométrica: se evalúa la repetitividad de una serie de


medidas de absorbancia realizadas con una misma solución.

Una de las aplicaciones más importantes de la espectrofotometría consiste en la


cuantificación de analitos. Los analitos deben tener color porque de esa forma absorberán
en el espectro visible. Por lo tanto, si se tiene un analito incoloro se obtendrá un valor nulo
de absorbancia porque la absortividad es 0. En este caso se deberá efectuar una reacción
colorimétrica usando un reactivo que reaccione con el analito a través de una reacción de
estequiometría conocida (por lo general 1:1), formando un producto coloreado (que como
tal, que absorbe en el espectro visible). Por lo tanto, a través de la medición de la
absorbancia del producto coloreado,se podrá cuantificar al analito.
Para determinar la concentración de un analito en una muestra, el valor de absorbancia
obtenido debe corresponderse exclusivamente a dicho analito. Si en un tubo se coloca la
muestra y el reactivo (que está siempre en exceso para no limitar la formación del producto
coloreado) se desarrollará la reacción colorimétrica y se podrá registrar un valor de
absorbancia. Sin embargo, la absorbancia medida se deberá a la contribución de todos los
componentes presentes capaces de absorber a la longitud de onda de trabajo.
Adicionalmente, la presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no
sean específicamente el analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo
tanto contribuir a la absorbancia total leída. Para evitar este problema se debe preparar
otros tubos cuyas absorbancias se usarán para corregir el valor de absorbancia del tubo
muestra. Estos tubos pueden ser:
● Tubo de referencia o blanco de solvente: este tubo puede contener agua o el
solvente que se utilice en la reacción y que estará presente en todos los tubos.
Contra este tubo se leerán todos los demás tubos, es decir, con él se llevará a cero
de absorbancia y será la referencia.

● Tubo de blanco de reactivo: este tubo se denomina así pues contiene todos los
reactivos necesarios para que se realice la reacción, pero no contiene a la muestra o
al testigo. Por lo tanto, la medida de absorbancia de éste será descontada a la del
tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el valor de la
absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, según corresponda.

● Tubo de blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra, pero no al reactivo. Se


utiliza para medir la contribución de otros analitos o sustancias interferentes que
estén presentes en la muestra y que no son el “analito a procesar” y que pueden
absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia
final del tubo de medida. La medida de absorbancia de este tubo también será
descontada del tubo de muestra.

El valor de la absorbancia de la muestra debe ser corregido con los blancos


correspondientes. Para calcular un valor de concentración, en paralelo a la muestra y los
tubos blancos antes analizados, debemos preparar testigos. Un testigo es solución que
contiene el mismo analito a dosar en la muestra y cuya concentración es conocida. Los
tubos testigos se prepararán de la misma forma que la muestra: mediante adición del
reactivo colorimétrico se generará un producto coloreado cuya absorbancia se podrá medir
espectrofotométricamente. Dichos valores de absorbancias incluyen las absorbancias de
todos los componentes de la mezcla de reacción. En consecuencia, deberán corregirse por
los blancos correspondientes.

❏ MATERIALES Y MÉTODOS

Según guía de actividades de Espectrofotometría de la Cátedra de Física, 2017


Para la segunda parte trabajaron con un protocolo armado por ustedes. Este no está
detallado en la guía, por lo que correspondería que lo mostraran acá.
❏ RESULTADOS

♦ PARTE 1: CONTROLES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

● Control de luz espuria:


El porcentaje de transmitancia medido al realizar el control fue de 0%; por lo tanto, el
equipo no presenta luz espuria de ningún tipo.

● Control de volumen mínimo:

➔ Tabla Nº1: Valores de absorbancia de una solución de rojo fenol alcalino para
volúmenes crecientes de una solución coloreada a …nm.

Vol ±? Absorbancia
(mL)

0,2 0,028

0,4 0,028

0,6 0,030

0,8 0,029

1,0 0,051

1,2 0,077

1,4 0,123

1,6 0,181

1,8 0,205

2,0 0,203
2,2 0,203

2,4 0,204

2,6 0,205

2,8 0,205

3,0 0,205

➢ Volumen a partir del cual la absorbancia se mantiene constante, indicando que es el


volumen mínimo.
➢ Volumen de trabajo: volumen mínimo más un 20%.

❖ Gráfico N°1: Absorbancia en función del volumen de solución en la cubeta. Commented [2]: Título idem tabla.

● Control de cubetas:

➔ Tabla Nº2: Porcentaje de transmitancia de diferentes cubetas con respecto a una


cubeta de referencia.

Cubeta T(%)

Cubeta de 100
referencia

A 101,4

B 97

C 103,2

D 102,2
➢ Primer par de cubetas con porcentajes de transmitancia similares.
➢ Segundo par de cubetas con porcentajes de transmitancia similares.
A con D y C con D son más parecidas entre sí que la “cubeta de referencia” con A.
● Control de centro de banda:

➔ Tabla Nº3: Valores de longitud de onda y absorbancia del barrido espectral de una
solución de rojo fenol.

Longitud Absorbancia
de onda
(nm)

528 0,740

533 0,798

538 0,850

543 0,901

548 0,934

553 0,938

558 0,905

563 0,835

568 0,714

573 0,577

578 0,408

583 0,275

588 0,183

➢ Longitud de onda que presenta la máxima absorbancia.


➢ Longitud de onda de absorbancia máxima teórico: 558 ± 1 nm.

❖ Gráfico N°3: Barrido espectral de una solución de rojo fenol.


¿Y de la carta de control qué resultado obtienen?
● Control de linealidad fotométrica:

➔ Tabla Nº4: Absorbancia de distintas diluciones de una misma solución de trabajo de


concentración conocida.

Concentración Absorbancia
(%V/V)

0 0

12,5 0,149

25 0,290

50 0,553

75 0,764

100 0,932

➢ Absorbancia a partir de la cual el equipo deja de responder linealmente.


➢ El equipo se comporta linealmente dentro de un rango de absorbancias entre 0 y
0,740.

❖ Gráfico N°4: Absorbancia en función de la concentración de distintas diluciones de una


solución de trabajo de concentración conocidaControl de linealidad fotométrica
realizada con una solución de X g/mL de rojo fenol alcalino a 553nm.
En este gráfico se incluye el punto de Cc al 100% V/V por lo tanto no calculamos recta
promedio, ya que no representa correctamente el rango de linealidad.
¿Y cómo se dieron cuenta de que no era lineal hasta la absorbancia leída para la solución
de 100%?

❖ Gráfico N°5: Representación del rango de linealidad fotómetrica.

➢ Ecuación de la recta: Abs = (0,010x100mL/mL) x Cc (mL/100mL) + 0,019.


➢ Rango de linealidad fotométrica: 0-0,740.

● Control de veracidad fotométrica:

Teniendo en cuenta los valores experimentales informados en la carta de control, se


obtuvo un valor de error fotométrico porcentual de -0,05%. Debido a que se considera
como aceptable un error fotométrico comprendido entre +/- 5%, se puede decir que el
equipo es veráz.
● Control de precisión fotométrica:

Considerando la información brindada en la carta de control, se obtuvo un valor de


coeficiente de variación porcentual de 0,3%. Debido a que se considera como aceptable
un coeficiente de variación menor al 1%, se puede decir que el equipo es preciso.

♦ PARTE 2: APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA - DETERMINACIÓN


CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA TÉCNICA DEL BIURET

A) Determinación de la longitud de onda óptima de trabajo:

➔ Tabla Nº5: Valores de absorbancia para la determinación de la longitud óptima de


trabajo con tubo….

Longitud de Absorbancia
onda (nm)

510 0,524

515 0,531

520 0,557

525 0,561

530 0,580

535 0,558

540 0,583

545 0,581

550 0,594

555 0,593

560 0,583

565 0,544

570 0,535

➢ Pico máximo de absorbancia a 550 ± 1 nm.

❖ Gráfico N°6: Barrido espectral entre las longitudes de onda 510 nm a 570 nm, cada
5 nm.
➢ Longitud de onda óptima de trabajo: 550 nm.

B) Determinación de la concentración de colágeno hidrolizado (CH) en una muestra:

➔ Tabla Nº6: Contenido de los tubos usados en el protocolo experimental.

Testigo Testigo Testigo Testigo Agua Muestra Muestra Reactivo


1 2 3 4 destilad 1 2 Biuret
20 40 60 80 a (mL) (mL) (mL)
mg/mL mg/mL mg/mL mg/mL (mL)
(mL) (mL) (mL) (mL

Tubo 1 0,1 2.0

Tubo 2 0,1 2.0

Tubo 3 0,1 2,0

Tubo 4 0,1 2,0

Tubo 5 0,1 2,0

Tubo 6 0,1 2,0

Tubo 7 0,1 2,0

Tubo 8 0,1 2,0

Tubo 9 0,1 2,0

Tubo 10 0,1 2,0

Tubo 11 0,1 2,0


Tubo 12 2,0 0,1

Tubo 13 0,1 2,0

Tubo 14 0,1 2,0

Tubo 15 2,0 0,1

Tubo 16 2,1

➔ Tabla N°7: Medida de la absorbancia de cada tubo.

Tubo Contenido Función Absorbancia

1 Testigo 1 + reactivo de Biuret Testigo 1 0,203

2 Testigo 1 + agua destilada Blanco de testigo 1 0

3 Testigo 2 + reactivo de Biuret Testigo 2 0,366

4 Testigo 2 + agua destilada Blanco de testigo 2 0

5 Testigo 3 + reactivo de Biuret Testigo 3 0,513

6 Testigo 3 + agua destilada Blanco de testigo 3 0

7 Testigo 4 + reactivo de Biuret Testigo 4 0,597

8 Testigo 4 + agua destilada Blanco de testigo 4 0

9 Reactivo de Biuret + agua destilada Blanco de reactivo 0,067

10 Muestra 1 + reactivo de Biuret Muestra 1 0,463

11 Muestra 1 + reactivo de Biuret Muestra 1 0,447

12 Muestra 1 + agua destilada Blanco de muestra 1 0,009

13 Muestra 2 + reactivo de Biuret Muestra 2 0,459

14 Muestra 2 + reactivo de Biuret Muestra 2 0,451

15 Muestra 2 + agua destilada Blanco de muestra 2 0,036

16 Agua destilada Blanco de solvente 0

➔ Tabla N°8: Absorbancia corregida de los testigos ordenados según concentraciones


crecientes de colágeno hidrolizado.

Testigo Concentración (mg/mL) Absorbancia corregida


1 0,952 0,136

2 1,90 0,299

3 2,86 0,446

4 3,81 0,530

Tal vez sería más fácil de entender toda esa información si pudieran centralizarla en
una sola tabla.
❖ Gráfico N°7: Absorbancia en función de concentración de CH de los testigos
procesados.

Siendo la ecuación que define a la recta: Abs= 0,1394(mL/mg)x Cc(mg/mL) + 0,0209 Commented [3]: Pueden editar la ecuación misma
que aparece en el gráfico. Omitieron el punto de
concentración= 0
Concentración de la MUESTRA 1: (2,57 + 0,17) mg/mL
Concentración de la MUESTRA 2: (2,35 + 0,07) mg/mL Commented [4]: Ojo, esta es la concentración en el
tubo de reacción. La que interesa es la original. Para
eso, dado que en todos los tubos usaron en mismo
❏ DISCUSIÓN factor de dilución pueden graficar directamente en
función de la concentración de los testigos originales.

Se realizaron los controles al espectrofotómetro con el fin de evitar la llegada al detector de


luz que no haya atravesado la muestra, comprobar la concordancia entre la longitud de
onda fijada en el equipo y la longitud de onda que efectivamente llega a la muestra, definir
un rango para el cual la respuesta del equipo es lineal y comprobar la veracidad y precisión
del equipo.
Mediante un barrido espectral se determinó una longitud óptima de trabajo teniendo en
cuenta el pico máximo de absorbancia en el cual hay mayor sensibilidad (mayor
absortividad) y a su vez es reproducible, lo que implica la absortividad no se verá muy
afectada frente a una pequeña variación en la longitud de onda, para poder así determinar
la concentración de colágeno en una muestra mediante la técnica del Biuret. Para dicho
protocolo se tomó la absorbancia de distintos tubos blanco (muestra, reactivo y solvente)
para eliminar la contribución a la absorbancia total leída de aquellas sustancias ajenas al
analito a estudiar que absorban a la longitud de onda de trabajo y así corregir las lecturas.
¿Y la discusión sobre sus resultados?

❏ CONCLUSIÓN

Se logró realizar los controles espectofotométricos, como así también comprender la


importancia de efectuarlos previo de una medición.También mediante el barrido espectral se
pudo elegir una longitud de onda óptima y realizar el control de centro de banda.
Mediante la técnica de biuret se pudo determinar la concentración de colágeno hidrolizado
en muestra .

♦ Anexo de cálculos:

Concentraciones de testigos:

TESTIGO 1:

20 mg CH --- 1 mL sc
2 mg CH =x --- 0,1 mL sc

2 mg CH --- 2,1 mL sc
0,952 mg CH =x --- 1 mL sc

Cc T1 CH= 0,952 mg/mL

TESTIGO 2:

40 mg CH --- 1 mL sc
4 mg CH =x --- 0,1 mL sc

4 mg CH --- 2,1 mL sc
1,90 mg CH =x --- 1 mL sc

Cc T2 CH= 1,90 mg/mL

TESTIGO 3:

60 mg CH --- 1 mL sc
6 mg CH =x --- 0,1 mL sc

6 mg CH --- 2,1 mL sc
2,86 mg CH =x --- 1 mL sc

Cc T3 CH= 2,86 mg/mL


TESTIGO 4:

80 mg CH --- 1 mL sc
8 mg CH =x --- 0,1 mL sc

8 mg CH --- 2,1 mL sc
3,81 mg CH =x --- 1 mL sc

Cc T4 CH= 3,81 mg/mL

Corrección de la absorbancia medida por sus respectivos tubos blancos:

Absorbancia del testigo - Absorbancia del blanco de reactivo


Testigo 1: 0,203 - 0,067 = 0,136
Testigo 2: 0,366 - 0,067 = 0,299
Testigo 3: 0,513 - 0,067 = 0,446
Testigo 4: 0,597 - 0,067 = 0,530

Absorbancia de la muestra 1 - Absorbancia del blanco de reactivo - Absorbancia del


blanco de la muestra 1
Muestra 1: 0,463 - 0,067 - 0,009 = 0,387
Muestra 1: 0,447 - 0,067 - 0,009 = 0,371

Absorbancia de la muestra 2 - Absorbancia del blanco de reactivo - Absorbancia del


blanco de la muestra 2
Muestra 2: 0,459 - 0,067 - 0,036 = 0,356
Muestra 2: 0,451 - 0,067 - 0,036 = 0,348

Cálculo de la concentración de las muestras incógnitas por duplicado:

Muestra 1:

0,387 = 0,1394 L/mg x Cc mg/L + 0,0209


Cc = 2,36 mg/mL

0,371 = 0,1394 L/mg x Cc mg/L + 0,0209


Cc = 2,51 mg/mL

Xm Muestra 1= 2,57 mg/mL


DS Muestra 1= 0,085 mg/mL

Cc Muestra 1: (2,57 + 0,17) mg/mL

Muestra 2:

0,356 = 0,1394 L/mg x Cc mg/L + 0,0209


Cc= 2,40 mg/mL
0,348 = 0,1394 L/mg x Cc mg/L + 0,0209
Cc= 2,35 mg/L

Xm Muestra 2= 2,375 mg/L


DS Muestra 2= 0,035 mg/L

Cc Muestra 2: (2,38 + 0,07) mg/L

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