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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad Nacional del Perú, Decana de América)

FIGMMG
E.P. INGENIERIA AMBIENTAL
LABORATORIO N° 2 - BIOQUIMICA

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA: LA


CONCENTRACION DEL SUSTRATO

INTEGRANTES:

 ANYOSA HUAMANI, ROSA (17160298)


 BARRIONUEVO SEQUEIROS, LIZ (17160314)
 HUAMAN RAMOS, RACHEL (17160304)
 RUA ANYAIPOMA, PAMELA (17160310)
 XESSPE MARQUINA, ROCIO (17160124)

DOCENTE:

Mg. Blgo. ACOSTA C., OSCAR

Fecha de laboratorio: 17 / 04/ 18

Fecha de entrega: 24/ 07 /18

LIMA – 2018
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
OBJETIVOS
 Determinar de manera experimental la velocidad máxima (Vmax) y Km por medio de la gráfica
de Lineweaver – Burk.
 Reconocer la acción de una enzima y algunos factores que afectan la actividad enzimática.

PROCEDIMIENTO
EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO

Preparamos 7 tubos con agua destilada, HCl y Albumina y un tubo (8) con Pepsina.

Sustrato: Albumina

Enzima: pepsina

TUBOS N° 1 2 3 4 5 6 7 8
Agua 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5
destilada (ml)
HCl (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Albumina (ml) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
Pepsina (ml) 8.0
Concentración 10 20 30 40 50 60 70
del sustrato []
Lectura inicial 0.025 0.027 0.032 0.096 0.114 0.142 0.169
de la DO
Lectura final 0 0.015 0.005 0.013 0.003 0.003 0
de la DO

Hallamos la concentración del sustrato mediante la siguiente formula:

La concentración inicial de la albumina es 100 mg % y de la pepsina 1g%

𝑪𝟏 ∗ 𝑽𝟏 = 𝑪𝟐 ∗ 𝑽𝟐

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7

100*1=C2*10 100*2=C2*10 100*3=C2*10 100*4=C2*10 100*5=C2*10 100*6=C2*10 100*7=C2*10


C2 = 10 C2 = 20 C2 = 30 C2 = 40 C2 = 50 C2 = 60 C2 = 70

Teniendo los datos de la densidad óptica a 450 nm inicial y final, hallaremos la velocidad:

𝑽 = 𝑳𝒆𝒄𝒕𝒖𝒓𝒂 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍 − 𝑳𝒆𝒄𝒕𝒖𝒓𝒂 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍

TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7


V= 0.025-0 = V= 0.027 - V= 0.032 - V= 0.096 - V= 0.114 - V= 0.142 - V= 0.169 - 0 =
0.025 0.015 = 0.02 0.005 = 0.022 0.013 = 0.083 0.003 = 0.111 0.003 = 0.128 0.169

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METODO DE MINIMOS CUADRADOS

El método es aplicable solo para ajustes lineales con los datos xi (concentración) y yi (velocidad)
𝑛𝛴𝑥𝑖𝑦𝑖 − (𝛴𝑥𝑖)(𝛴𝑦𝑖)
𝑚=
𝑛𝛴𝑥2 − (𝛴𝑥𝑖)2
(𝛴𝑦𝑖)(𝛴𝑥𝑖2) − (𝛴𝑥𝑖)(𝛴𝑥𝑖𝑦𝑖)
𝑏=
𝑛𝛴𝑥2 − (𝛴𝑥𝑖)2
Datos obtenidos de las inversas de la concentración y velocidad
1 1 1 1 1
𝑋𝑖 = 𝑌𝑖 = 𝑋𝑖. 𝑌𝑖 = . 𝑋𝑖2 = ( ) 2
[] 𝑉 [] 𝑉 𝑋𝑖

0.1 40 4 0.01
0.05 83.333 4.167 0.0025
0.0333 37.037 1.233 0.0011
0.025 12.048 0.3012 0.0006
0.02 9.009 0.180 0.04
0.167 7.194 0.120 0.0278
0.0142 5.917 0.084 0.0001
𝜮 = 𝟎. 𝟐𝟓𝟗 𝜮 = 𝟏𝟗𝟒. 𝟓𝟑𝟖 𝜮 = 𝟏𝟎. 𝟎𝟖𝟓 𝜮 = 𝟎. 𝟎𝟏𝟒𝟗

𝑌 = 𝑚𝑋 + 𝑏

(7)(10.085) − (0.259)(194.538)
𝑚= = 501.4874
(7)(0.01491) − (0.259)2

(194.538)(0.01491) − (0.259)(10.085)
𝑏= = 9.2493
(7)(0.01491) − (0.259)2

𝑌 = 501.4874𝑋 + 9.2493

DISCUSIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Según Murray, Bender, Botham, Kennelly, Rodwell & Weil: “[…]Cualquier cosa que aumente la
frecuencia o energía de colisión entre sustratos aumentará el índice de la reacción en la cual
participen.” (Murray et al.,2010, p.64)

 En este laboratorio el factor que aumentó la colisión de moléculas, fue el aumento de la


concentración de sustrato la cual hizo que se incrementara la velocidad de reacción.

A partir de la concentración del sustrato(albúmina) y la velocidad de reacción (variación de la densidad


óptica a 450nm) se determinó la Vmáx y el Km de la enzima(pepsina).

-Gráfica 1: Se obtuvo con la concentración de sustrato en el eje X y la velocidad de reacción en


el eje Y.
Murray, et al indican: “Para una enzima típica, a medida que la concentración de sustrato
aumenta, Vi se incrementa hasta que alcanza un valor máximo Vmax. Cuando los aumentos
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adicionales de la concentración de sustrato no aumentan más de la Vi, se dice que la enzima
está saturada con sustrato” (Murray et al., 2010, p.67)
 Este enunciado se verificó, pues a medida que la concentración aumentaba, la velocidad
también lo hizo hasta cierto punto, a partir de ahí empezó a estabilizarse y crear una curva
asíntota respecto a su Vmax. Esto se dio por la acción de la enzima sobre el sustrato. Al
superar la concentración del sustrato no hubo ningún efecto sobre la velocidad de
reacción, pues la enzima al saturarse funciona a su máxima velocidad.

Stryer, Berg & Tymoczko mencionan: “La constante de Michaelis (Km) es la concentración de
sustrato cuando la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, es decir,
Vmax/2” (Stryer et al.,2015, p.231)

 Esto se puede verificar en la gráfica. Aunque ellos no se miden con precisión, por ello
pasaremos a la gráfica 2.

-Gráfica 2: Se obtuvo con las inversas de la gráfica 1, es decir la inversa de la concentración del
sustrato en el eje X y la inversa de la velocidad de reacción en el eje Y.

Según Stryer et al.: “[…] La determinación de valores de Km y Vmax requería de una


manipulación algebraica de la ecuación de Michaelis-Menten. Como la Km es la concentración
del sustrato a la que la velocidad es semimáxima, Vmax/2. También resulta imposible
determinar con precisión el valor de Km. Sin embargo, la Vmax se puede determinar con
exactitud, si la ecuación de Michaelis-Menten se transforma en otra que proporcione una
representación lineal”. (Stryer et al.,2015, p.233)
 Como lo decíamos anteriormente, la representación de una curva asíntota hace difícil
hallar la Vmax y el Km, por ello al invertirlo y usar la representación de Lineweaber-Burk o
representación doble recíproca obtenemos datos exactos.

Stryer et al. indican: “Una representación doble recíproca de la cinética de una enzima se
genera representando 1/Vo en función de 1/[S]. La pendiente es Km/Vmax la intersección con
el eje vertical es 1/Vmax y la intersección con el eje horizontal es -1/Km.” (Stryer et al.,2015,
p.235)

 A partir de esta representación en mención, utilizamos el método de mínimos cuadrados,


resultando una recta lineal, concluyendo que el Km= 54.22 y Vmax=0.10812.

CONCLUSIONES

 En este laboratorio se pudo aprender que la actividad de la enzima (pepsina) actúa sobre el
sustrato (albumina) de manera secuencial ya que para que pueda actuar esta enzima requiere
trabajar en un pH ácido por eso se usa HCl y a una cierta temperatura en esta caso fue a 37°C.
Y para poder medir esta reacción se tuvo que detener mediante un baño de hielo.
 La actividad enzimática o velocidad se determinó mediante la diferencia de las lecturas de
densidades ópticas (DO) estas con ayuda del espectrofotómetro. Estas velocidades varían de
acuerdo con como se desarrolló en el laboratorio.
 Para tener una mayor exactitud utilizamos el método de mínimos cuadrados para tener una
recta más exacta en la gráfica de Lineweaver-Burk. En esta grafica hallamos el Km ya que en
esta grafica es más factible hallarla a diferencia de la gráfica de Michaelis-Menten (la gráfica
se asemeja a la logarítmica la cual dificulta hallar el Km).

REFORZAR

1.- Los siguientes términos

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 Ecuación de Michaelis-Menten: La ecuación de Michaelis-Menten es capaz de describir el
cambio sufrido por la velocidad de una reacción catalizada por una enzima al variar la
concentración del sustrato.
 Ecuación de Lineweaver-Burk: El Km y Vmax está menos afectado por el margen de error ya
que se asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier concentraciones sustrato o
velocidad de reacción.
 Km: Es la concentración de sustrato en Vmax la cual no se puede medir exactamente, las
enzimas se caracterizan por la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es
la mitad de su máximo. Esta concentración de sustrato se llama constante de Michaelis-
Menten (KM). Muchas enzimas obedecen a la cinética de Michaelis-Menten.
 Velocidad máxima (Vmax): La velocidad máxima (Vmax) de la enzima, en este estado todos
los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato. Esto fue propuesto en 1913 por
Leonor Michaelis y Maud Menten. Dado que la concentración de sustrato en Vmax no se
puede medir exactamente, las enzimas se caracterizan por la concentración de sustrato a la
que la velocidad de reacción es la mitad de su máximo.
 Isoenzima: son proteínas con diferente estructura pero que catalizan la misma reacción. Con
frecuencia, las isoenzimas son oligómeros de diferentes cadenas peptídicas, y usualmente
difieren en los mecanismos de regulación y en las características cinéticas. Desde el punto de
vista fisiológico, la existencia de isoenzimas permite que haya enzimas similares con diferentes
características, personalizadas de acuerdo a los requerimientos especificos del tejido o a
determinadas condiciones metabólicas.
2.- Las características químicas de la albumina y de la pepsina. Busque otros sustratos y sus respectivas
enzimas.
 Albumina (sustrato) Grupo de proteínas, polímero de galactosa, Teb. 412 °C, Tf. 167 °C,
Densidad 1.8gr/cm3, solubilidad en agua 25g/l a 20°C.
 Pepsina (enzima) es una enzima que se secreta en el estómago, hidroliza las proteínas. Actúa
principal, entre sobre los enlaces peptídicos de naturaleza hidrófoba.
 Ejemplos: Grasas(sustrato) y Bilis(enzima); ARN(sustrato) y ribonucleasa; Triglicéridos y lipasa.

BIBLIOGRAFÍA:

-Lubert Stryer, Jeremy M. Berg & Jhon L.Tymoczko (2015) BIOQUÍMICA con aplicaciones
químicas. Barcelona: Reverté

- Robert K. Murray, David A. Bender, Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Victor W. Rodwell
& P Anthony Weil (2010) HARPER Bioquímica Ilustrada. Mexico D.F.: Mc Graw Hill

-User (2013) Bioquimica. Mexico: wikibook editor

-Jose Lopez, Francisco Garcia (2015) Los cuatro mosqueteros de la cinética enzimática, Revista
Eubacteria. Cien años de avance en la ciencia de la vida. N°34.

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