UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE

FACULTAD DE INGENIERÍA EN CIENCIAS AGROPECUARIAS Y

AMBIENTALES
CARRERA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Integrantes: Anrango Chayac. Campo Tania, Narváez Diego, Proaño Luis, Pulles
Rubén, Pupiales Elizabeth, Ruiz Paola, Tipanluisa Rosa, Tutillo Adriana

Nivel: cuarto
Fecha: 2018-05-23

Informe cultivo de microorganismos

INTRODUCCIÓN
Las levaduras son microorganismos muy importantes dentro de la Agroindustria por ello
es muy importante conocer el comportamiento de su crecimiento. Los procedimientos
que permitieron llevar a cabo el estudio de estos microorganismos proporcionaron datos
necesarios para realizar un análisis y tener resultados certeros de este proceso microbiano.

Los medios de cultivo utilizados en la práctica contenían los nutrientes necesarios para
permitir el crecimiento del microorganismo (levadura, lactobacilo), puesto que cada uno
requiere de condiciones específicas como son de pH y temperatura para su favorable
crecimiento.

El desarrollo de la práctica está enfocado en dar a conocer el total de microrganismos

presentes por ml de muestra, mismo que requirió de los equipos necesarios para la
obtención de los datos. Además permitió conocer si el cultivo era saludable o no era
saludable.

La metodología utilizada en la práctica, garantizó la obtención de los datos necesarios y

a través de ello obtener los resultados. Además cada uno de los temas y subtemas
realizados en el informe abarcan las partes más relevantes del estudio planteado.
OBJETIVOS

Objetivo General:
Poner en práctica los conocimientos adquiridos en el aula sobre cuantificar las levaduras
mediante la técnica de conteo directo al microscopio.

Objetivos Específicos:
 Determinar la disolución correcta para el conteo de las células
 Aplicar un correcto manejo de la cámara Neubauer
 Analizar el método correcto para el conteo.
 Reconocer el tipo de color que presentan cada célula.

MARCO TEÓRICO
Levaduras

Las levaduras “son organismos eucarióticos y unicelulares, pertenecientes al reino de

los hongos: Como tales, son organismos heterotróficos por el hecho de que solo
pueden alimentarse de materia ya preformada (como nosotros los mamíferos). Las
dimensiones pueden oscilar de 1 a 9 µm de ancho y 2 a más de 20 µm de longitud según
la especie, nutrición, edad y otros factores. Las levaduras constituyen la causa más común
de alteración de frutas y jugos, pues tienen azúcares fermentables y elevada acidez”
(UNSA, 2011).

Los principales criterios utilizados para la clasificación de las levaduras son los
siguientes:

1.-Producción de ascosporas.

2.-Aspecto de las células vegetativas: forma, tamaño, color, inclusiones.

3.-Forma de reproducción asexual.

4.-Producción de micelio.

5.-Forma de película en medio líquido.

6.-Color de la colonia.

7.-Propiedades fisiológicas: producción de ácido, actividad ureásica.

8.-Caracterización bioquímica

Reproducción de las levaduras

 Gemación multicelular: Es el mecanismo en el cual una porción del
protoplasma sobresale de la pared de la célula y forma una protuberancia, la cual
aumenta de tamaño y se desprende como una nueva célula de levadura.
 Reproducción por fisión binaria: Consiste en la división del ADN, seguidas de
la división del citoplasma (citocinesis), dando lugar a dos células hijas.

Lactobacillus o bacteria del ácido láctico es un género de bacterias Gram positivas

anaerobias facultativas, denominadas así debido a que la mayoría de sus miembros
convierte lactosa y otros monosacáridos en ácido láctico.

Beneficios de lactobacillus

 Regulación del funcionamiento intestinal: Los lactobacilos tienen la

particularidad de adherirse sobre la pared intestinal impidiendo así el
asentamiento de bacterias dañinas.
 Frente a algunos tipos de alergia: como asmas, y patologías dermatológicas.
 Como prevención contra la gripe.
 Son excelentes para la prevención de intoxicaciones alimentarias.
 Disminuyen el PH intestinal favoreciendo la absorción de calcio.
 Son necesarios para la síntesis de vitaminas, sobre todo del complejo B.
 Ayudan a disminuir el colesterol (LDL) en sangre.
(Adeley, 2015)

Medios de cultivo

Los Medios de Cultivo “son preparados estériles que contienen sustancias necesarias para
el desarrollo de los microorganismos” (Universidad Nacional del Nordeste, 2006). Todos
los microorganismos requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y
hierro como elementos vitales. Los microorganismos exigentes requieren además factores
de crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias que no son
capaces de sintetizar.
Normalmente son benignas e incluso necesarias, habitan en el cuerpo humano y en el de
otros animales. La producción de ácido láctico hace que su ambiente sea ácido, lo cual
inhibe el crecimiento de bacterias dañinas. Algunas especies de lactobacillus son usadas
industrialmente para la producción de yogurt y otros alimentos fermentados. Muchos
lactobacillus son los únicos seres vivos que no requieren hierro para vivir y tienen una
tolerancia extremadamente alta al peróxido de hidrógeno.

Los sistemas utilizados para la identificación de microrganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales que son preparados en los laboratorios.
“El material alimenticio donde crecen los microorganismos se le denomina medio de
cultivo”, podemos encontrar entre 10 000 cases de cultivo que se puede preparar en el
laboratorio para así tener un mejor hábitat para que los microorganismos puedan
desarrollarse fácilmente. (Rodriguez, 2014, págs. 56-57)

“Los factores más importantes que se debe tomar en cuenta a la hora de sembrar
microorganismos en los medios como la temperatura, grado de humedad y presión del
aire”, además de algunas condiciones como la disponibilidad de nutrientes adecuado, la
consistencia adecuada del medio, presencia o ausencia de gases u oxígeno, condiciones
adecuadas de humedad. (Losano, 2015, págs. 12-14)

Entre otras condiciones podemos encontrar luz, pH, temperatura y la esterilización de los
medios una vez realizado el proceso de conteo o reconteo y obtener resultados mediante
una serie de pasos

Figura N°1: Tipos de medios de cultivo

Fuente: Autores
Rosa Bengala

Medio de cultivo que posee una composición Polipeptona micológica 5,00 glucosa 10,00
g, sulfato de magnesio 0,50 g, Fosfato potásico 1,00 g Cloranfenicol 0,20 g Agar-agar
15,00 g. Para una mejor preparación de este medio se debe “disolver 32 g del medio en 1
litro de agua destilada. Calentar agitando hasta ebullición para su disolución. Autoclavar
a 121 ºC durante 15 minutos”. (Cheza, 2016, págs. 23-26)

Medio ideal para la máxima recuperación de hongos (levaduras y mohos). Las bacterias
acompañantes son inhibidas por el cloranfenicol, la rosa bengala ayuda o limita la
invasión de la placa por mohos de crecimiento rápido, pero si se lo tiene en la luz intensa
por mucho tiempo esta característica se pierde y además a la hora de poner a refrigerar
los medios si se lo realiza en estufa preferible solo dejarlo dentro de la misma un lapso
de 24 horas debido a q si se excede este tiempo los microorganismos tienden a morir o
secarse, entonces no tendríamos buenos resultados.

Figura N°2: Rosa Bengala

Fuente: Autores

Cámaras de recuento

Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad
de volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio

La cámara de neubauer, o hematocitometro.

“Se trata de una gruesa placa de cristal que poseen una forma como de portaobjetos,
además posee las siguientes dimensiones de unos 30 a 70 mm y de grosor unos 4mm”, es
utilizada para determinar el número de células tanto vivas como muertas presentes en el
medio de cultivo, del mismo modo existen cámaras dobles donde se puede encontrar dos
zonas de conteo, una superior y otra inferior al eje longitudinal de la cámara, como se
puede apreciar en la figura 1. (Bastidas, 2017, págs. 12-13)

Figura N°3: zonas de conteo

Fuente: Autores

En una cámara simple la zona o porción central donde se debe realizar el conteo se
encuentra divida en tres partes, en la parte central se puede encontrar grabada una retícula
cuadrangular, la retícula completa mide 3mm y 3mm de lado, que se encuentra subdivida
en 9 cuadritos de 1mm de lado cada uno. En el caso de recuento de sangre los cuadrados
de las esquinas son los destinados para el conteo de leucocitos, el cuadro central utilizado
para el conteo de hematíes y plaquetas.

Para este conteo se debe dividir en 25 cuadrados medianos que tengan una longitud de
0,2 mm de lado, del mismo modo se debe dividir estos cuadros en otros más pequeños
para tener un total de 16 cuadrados pequeños como se puede observar en la figura número
2.

Figura N°4: Divisiones de la cámara neubauer

Fuente: autores
Para el conteo de células en la cámara de neubauer primero se procede a la preparación
de la muestra, típicamente el rango de concentraciones que permite contar “el
hematocitometro está entre 250 000 o 2,5 millones de células por ml”, por debajo de este
rango la cantidad de células no es suficiente para poder dar una estimación fiable al
contenido celular total. La concentración óptima para conteo en hematocitometro es de 1
millón de células por ml = 106 células /ml. (Gonzales, 2017, págs. 45-46)

Figura N°5: Muestra

Fuente: Autores

Sin embargo, si se excede este rango la probabilidad de cometer errores crece demasiado,
otro factor que hay que tomar en cuenta para poder tener un resultado fiable es el tiempo
y una sugerencia es que si por alguna razón se sobrepasa este nivel es preferible diluir la
mezcla para intentar acercar la muestra a los rangos correctos. De esto dependerá
determinar el contenido celular total.

Figura N°6: Conteo celular

Fuente: Autores

El segundo paso a seguir es la Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer, para

ello se toma 10ul de la muestra preparada con el paso 1 con la micropipeta. Para un mejor
uso de la cámara se recomienda el uso de algunas características que ayudaran a tener
buenos resultados. Continuando con el tercer paso que consiste en la preparación y
enfocamiento en el microscopio y terminando con el cálculo correspondiente como un
ejemplo el cálculo de la concentración

Recuento celular

“Es una serie de procedimientos que permiten determinar el número total de cada uno de
los tipos celulares que se encuentran comprendidos en una unidad de volumen en una
unidad de volumen específicamente en 1mm3”. En este procedimiento podemos encontrar
tres fases o pasos a seguir para obtener buenos resultados, el primero es dilución de la
muestra que se desea analizar o esté usando en la práctica. (Ruales, 2016, págs. 23-34)

Posterior a eso se debe realizar un cómputo de célula ya se de forma manual (cámaras) o

automática (contadores electrónicos), es decir debe realizarse un primer conteo para
seguir con el reconteo donde se emplearía determinadas fórmulas para determinar el
número de células presentes en 1mm3de la muestra
MATERIALES Y MEDIOS
Materiales
1. Placas Petri

2. Tubos de ensayo

3. Pipetas

4. Vaso de precipitación

5. Mechero

6. Frascos de vidrio

7. Microscopio óptico

8. Cámara Neubauer
9
9. Centrifugadora

Medios
1. Rosa Bengala
2. MRS
PROCEDIMIENTO:
 Preparación de cultivos y muestras
1. Lavar y esterilizar todos los materiales a utilizar.

2. Preparar los medios de Rosa Bengala (levaduras) en placa y MRS (Lactobacilos

casei) en tubo, según las especificaciones presentes en cada envase del medio.

3. Realizar la siembra de levaduras en los tubos de medio MRS y sellarlos

completamente, poner los cultivos en incubación durante determinado tiempo,
para lograr su crecimiento.

 Preparación de la cámara
4. Limpiar la cámara y la laminilla superior cuidadosamente con alcohol al 70%

5. Secar con ayuda de papel libre de pelusas.

6. Colocar la laminilla sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada
7. Verificar con el microscopio que tanto la cámara como la laminilla se encuentren
sin restos de suciedad y que no esté quebrada o algún daño que interfiera en la
medición.

 Conteo

8. Con la ayuda de la pipeta, obtener cierta cantidad de las muestra (levaduras) a ser
introducidas en la cámara. Esto se logra con las respectivas diluciones realizadas
anteriormente en la preparación de muestras. El rango recomendado de
concentraciones que permite contar en cámara Neubauer está entre 250.000
células y 2,5 millones de células por ml.

9. Llenar la cámara, en un lugar donde sea cómodo pipetear, debe ser constante y
preciso, la apariencia en la cámara debe ser de líquido abundante sin desbordar,
esto garantizaría la distribución de las células.

10. Colocar la cámara de Neubauer en la bandeja del microscopio

11. Encender la luz del microscopio y enfocar hasta que puedan verse nítidas las
células a través del binocular.

12. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento de los lados inferiores
del cuadrante.

13. Anotar en una hoja de resultados la cantidad de células contadas en el primer

cuadro.
14. Repetir el proceso para el resto de los cuadros que deseamos contar, anotando el
resultado de cada uno de ellos.
15. Realizar los respectivos cálculos en base a los datos obtenidos.
 Siembra

16. Con la pipeta tomar 6 ml de muestra de levaduras y sembrar en los dos medios
de Rosa Bengala.

 Determinación de biomasa

17. Pesar los envases a centrifugar totalmente vacíos, es decir sin la tapa y
etiquetarlos numéricamente.

18. Introducir 5ml de muestra de medio MRS con la población de levaduras en ella

19. Centrifugar los envases.

20. Separar la biomasa del agua cuidadosamente, utilizando algodón para asegurar
un cálculo exacto.
 21. Realizar los cálculos respectivos para determinar biomasa a través del método
del peso húmedo.

CÁLCULOS

Tabla 1: Masas de muestras por medio del análisis de diferencia de masas

# Masa del frasco (g) Masa del frasco+ Masa de la muestra

muestra(g) (mf-mf;m=mm) (g)
1 9,6350 9,7958 0.1608
2 9,7159 10,0569 0,2601
3 9,7946 10,079 0,2844
4 9,6165 9,7489 0.1324

Tabla 2: Cantidad de muestras en mililitro de solución de medio

# Cantidad de muestra (g/ml)

1 0,03216
2 0,0522
3 0,05608
4 0,02648
Promedio 0,04693

Conteo de células

# 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑥 10 000
Conteo de células= # 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑥 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

(66𝑥16)𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠𝑥 10 000
=6,6x108células/ ml
4 𝑥 0,1𝑚𝑙

RESULTADOS

En las tablas que se presentaron se obtienen los porcentajes de bacterias que se tienen por
medio en una cantidad vertida de la solución, si tomamos en cuenta la tabla número 1 se
usa un método muy común el cual es la diferenciación de masas para saber la masa de las
bacterias por mililitro, Para que el resultado sea homogéneo y de fácil análisis en la tabla
número 2 se presenta un promedio total de las muestras dando una cantidad estándar de
la masa de las bacterias en un mililitro de solución siendo esta cantidad 0,04693 g/ml.

El conteo de células es un método numérico muy usado para saber la salud del cultivo y
su tasa de crecimiento, facilitando la intervención inmediata del humano en caso de que
el cultivo no tenga las condiciones necesarias para que el cultivo se desarrolle de la
manera más óptima. En el caso de la presente práctica dicho conteo arroja una cantidad
de 6,6x108células/ml que es una cantidad extraordinaria y da a resaltar la salud del medio
y el crecimiento en condiciones ideales del cultivo.

CONCLUSIONES
 Se debe tomar en cuenta que para el conteo celular los cuadrantes con los que está
conformada la cámara son cuatro los cuales se subdividen en 16 cada uno y el
método más factible es empezar a contar de manera horizontal, vertical y luego
horizontal ya que esta manera se puede determinar cuántas células hay en un
cuadrante y es así que al momento de realizar los cálculos respectivos se puede
establecer la cantidad de células existes.
 La determinación del tipo de coloración de células es indispensable ya que gracias
a ellos se verifica si las células están vivas, muertas o en procesos deceso, ya que
con ello se puede conocer cuando un cultivo está muriendo o no, y con ello actuar
y evitar que el cultivo pierda.

RECOMENDACIONES

 Para obtener un correcto conteo en levaduras, la disolución debe de ser de 1ml de

levaduras en 100ml de agua destilada, ya que esto permite tener una mejor
visualización de las células en la cámara Neubauer y esto se facilita el conteo
celular.
 Se determina que antes de realizar un conteo de células mediante la cámara, se
debe verificar que los lentes de dicha cámara se encuentren bien enserados y
mantener un correcto aseo para evitar cosas extrañas las cuales pueden intervenir
en el conteo, por lo que puede tener mayor cantidad de error.
 BIBLIOGRAFÍA

Adeley, P. (2015). Lactobacillus. Obtenido de

https://es.scribd.com/doc/95791211/Microbiologia-Lactobacillus

Bastidas, O. (2017). Conteo Celular . Mexico: Celeromics.

Cheza, F. (2016). Rosa bengala (Caracteristicas y composicion). Madrid : PUCE-

WORKS.

Gonzales, P. (2017). Cámaras de recuento. Madrid: BRAND.

Losano, E. (2015). Caracteristicas de los medios de cultivo. Ambato: SEILAGUA® .

Rodriguez, F. (2014). Los medios de cultivo y sus caracteristicas . Bogota: COMPACT-

DRY-PLATES®.

Ruales, M. (2016). Conteo y Recuentro Celular. Cuenca: Sysmex.

Universidad Nacional del Nordeste. (2006). Medios de Cultivo. Obtenido de

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

UNSA. (2011). Manual de Microbiología de los Alimentos. Obtenido de

http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20levaduras.pdf
 ANEXOS

Anexo 1 Materiales y medios

Anexo 2 Preparación de cultivos y muestras

Anexo 3 Preparación de la cámara

Anexo 4 Conteo
Anexo 5 Siembra

Anexo 6 Determinación de biomasa