You are on page 1of 19

LAPORAN MINGGUAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA II
ACARA IV
UJI KUANTITATIF PROTEIN

DISUSUN OLEH

NAMA : RO’YAL AINI

NIM : G1C 015 033

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS MATARAM

2018
ACARA IV
UJI KUANTITATIF PROTEIN

A. PELAKSANAAN PRAKTIKUM
1. Tujuan Praktikum
Untuk mencari konsentrasi protein dengan metode biuret.
2. Waktu Praktikum
Sabtu, 13 Mei 2018
3. Tempat Praktikum
Lantai II, Laboratorium Kimia Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Mataram.

B. LANDASAN TEORI
Protein adalah makromolekul yang banyak terdapat pada sel hidup dan
tersusun dari asam-asam amino yang disentesis berdasarkan kode yang dibawa
oleh informasi genetic yang berupa urutan nukleotida yang disebut kodon.
Protein merupakan polipeptida berbobot molekul tinggi dari asam L-amino yang
disentesis oleh sel hidup; biopolymer ini mempunyai jangka yang lebar dalm hal
bobot molekul, kompleksitas struktur, dan sifat fungsionalnya. Protein
memainkan peran yang sentral dalam system biologi. Meskipun informasi
evolusi dan organisasi biologi sel terkandunng dalam DNA, tetapi proses kimia
dan biokimia yang memlihara kehidupan sel/organisme dilakukan secara
eksklusif oleh enzim. Ribuan enzim telah ditemukan. Setiap enzim mengkatalis
reaksi biologi yang sangat spesifik di dalam sel. Protein juga berfungsi sebagai
komponen struktural sel dan organisme kompleks. Misalnya kolagen, keratin
dan elastin (Mufiddah, 2017 : 5).
Protein ini memungkinkan otot berkontraksi, sehingga dapat terjadi
gerakan. Dalam bentuk antibodi dan komponen lain dalam sistem kekebalan,
protein melindungi kita dari infeksi oleh organisme asing. Protein juga
mencegah kehilangan darah dengan membentuk serangkaian proses yang
diakhiri dengan pembentukan bekuan darah. Satu fungsi penting protein adalah
fungsi sebagai enzim, katalisator yang meningkatkan kecepatan biokimia. Tanpa
protein katalis ini, reaksi akan berlangsung sangat lambat sehingga kehidupan
menjadi mustahil (Marks, 2000 : 196).
Protein mempunyai peranan kunci dalam semua proses biologis
dalam semua tingkat organisme baik organisme tingkat rendah sampai
dengan orgamsme tingkat tinggi. Peranan biologis tersebut mempunyai
cakupan sangat luas, antara lain seperti transport dan penyimpanan,
pengaturan dan koordinasi gerak, penunjang mekanik, proteksi terhadap imun,
rangsangan, integrasi metabolisme, kontrol pertum-buhan dan diferensiasi
Protein merupakan makromolekul yang memiliki bahan dasar asam amino.
Asam amino penyusun protein ada 20 macam. Asam amino penyusun protein
memiliki rantai samping yang berbeda-beda dan mencirikan sifat kimia dari
masing-masing asam amino tersebut (Katili, 2009 : 25).
Struktur protein kuaterner dapat ditentukan dengan menggunakan
berbagai teknik eksperimental yang memerlukan sampel protein dalam berbagai
kondisi eksperimental. Percobaan sering memberikan perkiraan massa protein
asli dan, bersama-sama dengan pengetahuan tentang massa dan / atau
stoikiometri dari subunit, memungkinkan struktur kuaterner untuk diprediksi
dengan diberikan akurasi. Hal ini tidak selalu mungkin untuk mendapatkan
penentuan tepat komposisi subunit untuk berbagai alasan. Subunit sering
berhubungan satu sama lain dengan simetri operasi, seperti sumbu 2 kali lipat
dalam dimer. Multimers terdiri dari subunit identik disebut untuk dengan awalan
"homo" (misalnya homotetramer a) dan mereka terdiri dari subunit yang
berbedavdisebut dengan awalan "hetero-" (misalnya heterotetramer, seperti dua
alpha dan beta dua rantai hemoglobin) (Mandle, 2012).
Analisa protein dilakukan dengan beberapa cara yaitu: 1) Analisa
kualitatif: Test Biuret, Test Molish, Test Xanthoprotein, Test Millon, Test
Ninhidrin; dan 2) Analisa kuantitatif: Metode Dumas, Spektrofotometri UV,
Titrasi formol, Turbidimetri atau kekeruhan, Metode Kjeldahl yang terbagi
menjadi 3 tahap: a) Destruksi: Sampel dimasukkan dalam labu kjeldahl dengan
bantuan corong kecil ditambah campuran selenium, 25 ml H2SO4 pekat
kemudian dipanaskan dengan api kecil dulu sampai gas SO2 yang berwarna putih
hilang dengan posisi labu kjeldhal miring 450. Pemanasan dilanjutkan sampai
terjadi larutan yang jernih (Triwahyuni, 2010).
Analisis kuantitatif protein dapat digolongkan mejadi dua metode, yaitu
metode konvensional yang terdiri dari metode Kjedahl (terdiri dari destruksi,
destilasi, dan titrasi), dan titrasi Formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.
Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri Visible, metode
spektrofotometri UV digunakan untuk protein terlarut. Metode Kjedalh
merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen. Sampel
didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalis dengan katalisator yang sesuai
sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali kuat,
amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap
dan ditetapkan secara titrasi (Mufiddah, 2017 : 36).
Pada penelitian yang dilakukan Munthe, dkk (2012) metode Kjedahl
yang digunakan adalah metode Kjeldahl untuk menganalisis kadar protein kasar
dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis adalah kadar
nitrogennya. Kadar protein diperoleh dengan mengonversikan hasil analisis
tersebut dengan faktor konversi bahan makanan. Prinsip analisis Kjeldahl adalah
mula-mula bahan didekstruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis
selenium oksiklorida. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan
bantuan indikator.
Uji biuret digunakan untuk uji protein, karena uji ini dapat mendeteksi
adanya ikatan peptida yang diperoleh hasil reaksi berupa warna ungu pada
larutan yang menunjukkan adanya protein. Warna ungu pada sampel disebabkan
karena ion Cu2+ (dari pereaksi Biuret) dalam suasana basa bereaksi dengan
polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu (violet). Uji xanthoprotein membuktikan
adanya asam amino tirosin, triptofan, atau fenilalanin yang terdapat dalam
protein. Jika protein yang mengandung cicin benzena (tirosin, triptofan, dan
fenilalanin) ditambahkan asam nitrat pekat, maka akan terbentuk endapan putih
yang dapat berubah menjadi kuning sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang
terbentuk dalam suasana basa akan terionisasi dan warnanya berubah menjadi
jingga (Putri, 2016).
Kuantisasi dari total kandungan protein dalam sampel merupakan
langkah penting dalam protein analisis. Molekul UV-Vis spektroskopi
penyerapan sangat efisien dalam kuantitatif analisis seperti kuantisasi protein
dan memiliki aplikasi luas dalam kimia dan laboratorium klinis di seluruh dunia.
Di antara berbagai teknik untuk pengujian protein, biuret Tes adalah kepentingan
tertentu dalam penelitian ini. Penelitian ini berusaha untuk memverifikasi
sensitivitas biuret uji sampel protein dengan konsentrasi mulai,0100-5,00 mg /
mL. Telur ayam albumin digunakan sebagai sampel protein. Uji ini dinilai untuk
menentukan kisaran konsentrasi di mana ia akan menampilkan linearitas. Tes
biuret linearitas dipamerkan di berbagai konsentrasi (0,1000 ± 0,0004-5,00 ±
0,02 mg / mL). Mulai rentang konsentrasi protein yang didirikan untuk kurva
kalibrasi pengujian ini lebih rendah dari nilai sastra yang ditemukan (1 mg /
sampel). Studi ini menyediakan kisaran lebih dapat diterapkan uji biuret
(Janairo, 2011).
Protein telur digunakan dalam berbagai produk makanan karena
fungsional yang sangat baik sifat (kelarutan, emulsifikasi, berbusa dan gel) dan
kualitas protein. Kekhawatiran tentang kolesterol tinggi, alergi, kesejahteraan
hewan, biaya makanan tinggi, serta produksi makanan dampak negatif terhadap
lingkungan telah menyebabkan peningkatan minat alternatif sumber protein
yang dapat bertindak sebagai replacers telur dalam makanan. Studi literatur ini
memiliki tujuan untuk membandingkan sifat fungsional dan protein kualitas
kedelai dan kacang dengan telur, ini dalam rangka untuk mengevaluasi potensi
mereka sebagai telur replacers dalam makanan telur tradisional tanpa susu atau
hewan bahan. Temuan menunjukkan bahwa kedelai dan protein kacang memiliki
pola yang sama seperti kelarutan protein telur. Kedelai dan protein kacang
memiliki sifat pengemulsi yang mirip dengan protein telur dan mengubah pH
dapat mengatur ketebalan emulsi. Kedua kedelai dan kacang protein mampu
membentuk busa tapi protein kacang terbukti menjadi agen berbusa lebih baik
dari kedelai protein. Busa bentuk protein telur lebih kuat dalam suhu kamar dari
dua kacang-kacangan protein. Sifat gelling ditunjukkan untuk menjadi yang
terbaik untuk telur dan protein kedelai, tapi protein kedelai tidak membentuk gel
yang tepat pada suhu yang lebih tinggi dan tidak cocok untuk panas- diinduksi
gel makanan. Protein kacang membentuk gel yang lemah dan tidak berlaku
untuk makanan gel (Soderberg, 2013).

C. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM


1. Alat-alat Praktikum
a. Gelas kimia 50 mL
b. Gelas kimia 250 mL
c. Labu takar 10 ml
d. Kuvet
e. Pipet tetes
f. Pipet volume 1 mL
g. Pipet volume 2 mL
h. Rak tabung reaksi
i. Spektrofotometri UV-Vis
j. Tabung reaksi
2. Bahan-bahan Praktikum
a. Aquades (H2O(l))
b. Larutan tembaga (II) sulfat (CuSO4) 1%
c. Larutan natrium hidroksida (NaOH) 10%
d. Larutan sampel protein X
e. Larutan standar protein (0,2 mg/mL; 0,4 mg/mL; 0,6 mg/mL; 0,8
mg/mL)

D. SKEMA KERJA
1. Preparasi Larutan Standar
2 mL larutan standar protein 0,2 mg/ml
 Dimasukkan ke dalam labu takar
 Diencerkan sampai 10 ml
 Diambil 5 ml
 + 1mL CuSO4 1%
 + 1 mL NaOH 10%
 +1 mL aquades
 Diulang langkah diatas untuk larutan standar 0,4,
0,6, dan 0,8 mg/mL

Hasil

2. Preparasi Larutan Sampel

2 mL larutan sampel X

 Dimasukkan ke dalam labu takar


 Diencerkan sampai 10 mL
 + 1 mL CuSO4 1%
 + 1 mL NaOH 10%
 + 1 mL Aquades

Hasil

3. Preparasi Larutan Blanko


Tabung Reaksi
 Dimasukkan 1 mL CuSO4 1%
 + 1 mL NaOH 10%
 + 1 mL aquades
Hasil

4. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Protein

Diambil larutan standar 0,8 mg/mL yang sudah


 Dimasukkan ke dalam kuvet
 Dimasukkan ke dalam spektrofotometer
UV Vis
Hasil

 Diukur absorbansi pada λ 520 nm


 Diulangi langkah-langkah diatas untuk λ
yang berbeda dari (520 nm – 545 nm)
dengan interval 5
 Ditentukan λ maksimum
Hasil
5. Pembuatan Kurva Kalibrasi Standar dan Sampel

Diambil larutan standar 0,2 mg/mL yang sudah diencerkan


 Dimasukkan ke dalam kuvet
 Dimasukkan ke dalam UV-Vis
 Diukur nilai absorbansi pada λ maksimum
yang didapatkan pada percobaan 4.
 Diulang langkah di atas untuk larutan
standar dengan konsentrasi 0,4, 0,6, dan
0,8 mg/mL
 Dicatat nilai absorbansi
Hasil

6. Penentuan Konsentrasi Sampel


Diambil Sampel X
 Dimasukkan ke dalam kuvet
 Dimasukkan ke dalam UV – Vis
 Di ukur nilai absorbansi sampel dengan λ
max yang didapat dari percobaan 4.
 Dicatat nilai absorbansi
Hasil

E. HASIL PENGAMATAN
1. Menentukan Panjang gelombang Maksimal
No Panjang gelombang (nm) Absorbansi
1 520 0,263
2 525 0,327
3 530 0,339
4 535 0,378
5 540 0,446
6 545 0,518
2. Membuat kurva kalibrasi
a. Sebelum Pengenceran
No Konsentrasi Larutan Standar Panjang gelombang Absorbansi
(mg/L) (nm) (A)

1 0,2 0,027
2 0,4 545 0,043
3 0,6 0,069
4 0,8 1,06

b. Setelah Pengenceran
No Konsentrasi Larutan Panjang Gelombang Absorbansi
Standar (mg/mL) (nm) (A)
1 0,099
2 545 0,178
3 0,234
4 0,518

3. Menentukan Konsentrasi Sampel


a. Sebelum Pengenceran
No Sampel Absorbansi (A) Panjang Gelombang (nm)
1 X 1,25 545

b. Sesudah Pengenceran
No Sampel Absorbansi (A) Panjang Gelombang (nm)
1 X 0,25 545
F. ANALISIS DATA
1. Persamaan reaksi

Atau

2. Panjang gelombang maksimum

No Panjang gelombang (nm) Absorbansi


1 520 0,263
2 525 0,327
3 530 0,339
4 535 0,378
5 540 0,446
6 545 0,518
Kurva penentuan panjang gelombang maksimum
0.6
0.5

Absorbansi
0.4
0.3
0.2
0.1
0
515 520 525 530 535 540 545 550
 (nm)

Berdasarkan grafik di atas maka panjang gelombang maksimum untuk


pengukuran sampel protein adalah 545 nm.

3. Kurva standar
Sebelum pengenceran
Konsentrasi Larutan Standar (mg/L) Absorbansi
0,5 0,027
1,0 0,043
2,0 0,069
4,0 1,06

Pengenceran
a. M1 x V1 = M2 x V2
𝑀1 𝑥 𝑉1
M2 = 𝑉2
2 𝑥 0,2
= 10

= 0,04 mg/L

b. M1 x V1 = M2 x V2
𝑀1 𝑥 𝑉1
M2 = 𝑉2
2 𝑥 0,4
= 10

= 0,08 mg/L
c. M1 x V1 = M2 x V2
𝑀1 𝑥 𝑉1
M2 = 𝑉2
2 𝑥 0,6
= 10

= 0,12 mg/ L

d. M1 x V1 = M2 x V2
𝑀1 𝑥 𝑉1
M2 = 𝑉2
2 𝑥 0,8
= 10

= 0,16 mg/ L

Setelah pengenceran
Konsentrasi Larutan Standar (mg/L) Absorbansi

0,04 0,099
0,08 0,178
0,12 0,234
0,16 0,518

Sehingga diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut :

0.6

0.5 y = 3.2825x - 0.071


R² = 0.8632
0.4
Absorbansi

0.3

0.2

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2
Konsentrasi (mg/mL)
4. Penentuan Konsentrasi Sampel Protein
a. Sebelum Pengenceran
Diketahui : Absorbansi sampel protein X= 1,25 pada λ = 545 nm
Persamaan linear dari kurva kalibrasi : y = 3.2825x - 0.071
Dengan mensubtitusikan nilai absorbansi cuplikan pada persamaan
linearitas kurva kalibrasi sebagai nilai y, maka akan di dapat nilai
konsentrasi cuplikan sebagai nilai x:

y = 3.2825x - 0.071

1,25 = 3.2825x - 0.071

1,25 + 0.071 = 3.2825x

1,321 = 3.2825x

1,321
x = 3,2825

x = 0,402 mg/mL

Jadi, konsentrasi sampel protein sebelum diencerkan adalah 0,402


mg/mL.

b. Setelah Pengenceran
Diketahui : Absorbansi sampel protein X= 0,25 pada λ = 545 nm
Persamaan linear dari kurva kalibrasi : y = 3.2825x - 0.071
Dengan mensubtitusikan nilai absorbansi cuplikan pada persamaan
linearitas kurva kalibrasi sebagai nilai y,maka akan di dapat nilai
konsentrasi cuplikan sebagai nilai x:
y = 3.2825x - 0.071

0,25 = 3.2825x - 0.071

0,25 + 0.071 = 3.2825x

0,321 = 3.2825x
0,321
x = 3,2825

x = 0,09 mg/mL

Jadi, konsentrasi sampel protein setelah diencerkan adalah 0,09 mg/mL.

G. PEMBAHASAN
Protein merupakan poliamida atau polipeptida, polimer yang dibangun
atau dibentuk oleh monomer asam amino. Protein yang umum dikenal, dibuat
dari variasi kombinasi 20 asam amino yang berbeda dan terbentuk secara
alami. Molekul-molekul asam amino membagi sebuah pola struktur yang
umum. Empat spesies kimia yang berbeda terikat pada sebuah atom karbon,
spesies-spesias tersebut yaitu sebuah senyawa asam karboksilat, sebuah atom
hydrogen, sebuah senyawa amina, dan salah satu sisi mengikat senyawa R
dalam struktur.
Analisis kuantitatif protein dapat digolongkan mejadi dua metode, yaitu
metode konvensional yang terdiri dari metode Kjedahl (terdiri dari destruksi,
destilasi, dan titrasi), dan titrasi Formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.
Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri Visible,
metode spektrofotometri UV digunakan untuk protein terlarut.
Pada percobaan kali ini analisis kuantitatif protein dilakukan dengan
menggunakan Uji Biuret. Uji biuret dilakukan dengan tujuan untuk
menentukan adanya senyawa-senyawa yang mengandung ikatan peptida dalam
sampel protein berdasarkan pengukuran serapan cahaya oleh ikatan. Prinsip
dari analisis protein adalah pengukuran jumlah atau kadar N dalam bahan
pangan dan reaksi spesifik suatu senyawa/reagen dengan ikatan peptida.
Semakin tinggi kadar protein dalam sampel, jumlah ikatan peptida semakin
banyak. Keunggulan dari metode ini adalah pengukuran kadar proein secara
langsung (direct method), mendeteksi ikatan peptida protein secara spesifik,
tidak mendeteksi nitrogen dari senyawa non peptida dan metode ini merupakan
metode yang sederhana, cepat , dan murah.
Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu. Reagen
dalam uji biuret terdiri dari larutan CuSO4 dan NaOH dengan perbandingan
yang sama dan dicampurkan dalam sampel. Sampel yang digunakan adalah
enzim yang merupakan suatu protein dengan ikatan peptida di dalamnya.
Campuran dihomogenkan dan ditutup sebagai perlakuan inkubasi. Inkubasi ini
bertujuan untuk mencegah terjadinya reaksi sehingga sampel tidak mencapai
suhu biasa. Pada suhu rendah (4-10oC) semua protein tidak mengalami
degradasi.
Fungsi larutan NaOH agar sampel protein menjadi suasana alkalis.
Suasana alkalis (basa) bertujuan agar reaksi dapat berjalan dengan cepat.
Sedangkan larutan CuSO4 akan membentuk kompleks berwarna ungu dari
reaksi ion Cu2+/ kupri pada kondisi alkalis dengan polipeptida atau ikatan-
ikatan peptida. Hasil menunjukkan sampel protein yang diuji positif
mengandung ikatan peptida pada sampel yang ditandai dengan terbentuknya
kompleks berwarna ungu karena mengandung zat albumin memiliki rumus
bangun yang kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial
sehingga terbentuk ikatan peptida.
Larutan ungu yang terbentuk akan berguna dalam analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Zat yang dapat dianalisis
menggunakan alat ini adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tampak
berwarna. Jika zat tersebut tidak berwarna maka perlu direaksikan dengan
reagen tertentu sehingga dihasilkan suatu larutan berwarna. Larutan-larutan
berwarna yang dianalisis menggunakan spektrofotometer UV tidak boleh ada
partikel koloid ataupun suspensi. Karena adanya partikel-partikel koloid
ataupun suspensi akan memperbesar absorbansi, akibatnya bila dihubungkan
dengan rumus yang diturunkan dari hukum Lambert-Beer, konsentrasi zat yang
dianalisis makin besar dan apabila digunakan untuk penentuan struktur suatu
senyawa maka pita pada spektrum akan melebar dari yang sesungguhnya.
Analisis kuantitatif protein menggunakan alat spektrofotometer UV-
Vis dilakukan pada panjang gelombang 520-545 (interval 5 nm) untuk
mendapatkan serapan maksimum. Spektrum UV-Vis dgunakan untuk senyawa
organik yang berhubungan dengan transisi elektronik pada tingkat-tingkat
energi elektron tertentu. Transisi itu biasanya menyangkut transisi elektronik
bebas dan orbital yang tidak terisi pada non bonding atau orbital anti bonding.
Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh
molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul. Setiap senyawa
mempunyai tingkatan tenaga yang spesifik. Bila cahaya mempunyai tenaga
yang sama dengan perbedaan tenaga antara tingkatan dasar dan tenaga
tingkatan tereksitasi jatuh pada senyawa maka elektron-elektron pada tingkatan
dasar dieksitasi ke tingkat tereksitasi, dan sebagian tenaga dengan proses
radiasi panas dan kembali ke tingkatan dasar (asal). Karena perbedaan tenaga
antara tingkatan dasar dan tingkat tereksitasi spesifik untuk tiap-tiap bahan atau
senyawa, maka frekuensi yang diserap juga tertentu.
Komponen-komponen yang mengabsorpsi dalam spektrofotometri
UV-Vis dapat berupa absorpsi oleh senyawa-senyawa organik maupun
anorganik. Senyawa-senyawa organik yang mengandung ikatan rangkap 2 atau
rangkap 3 akan menghasilkan puncak-puncak absorpsi yang penting terutama
dalam daerah UV. Gugus-gugus fungsional organik tidak jenuh yang
mengabsorpsi sinar tampak dan UV ini dinamakan kromofor atau sering
dikenal dengan pembawa warna. Contoh kromofor, -NH2, -C=C-, C=O, -CHO,
-NO2, -N=N- dan lain-lain. Sedangkan absorpsi oleh senyawa-senyawa
anorganik, spektra dari hampir semua ion-ion kompleks dan molekul-molekul
anorganik menghasilkan puncak absorpsi agak melebar. Untuk ion-ion logam
transisi, pelebaran puncak disebabkan oleh faktor-faktor lingkungan kimianya.
Suatu contoh larutan Cu (II) encer berwarna biru muda, tetapi warna akan
berubah menjadi biru tua dengan adanya amonia. Bila unsur-unsur logam
membentuk kompleks, maka faktor ligan sangat menentukan. Proses absorpsi
ini kemudian dapat dijelaskan bahwa suatu molekul atau atom yang
mengabsorpsi radiasi akan memanfaatkan energi radiasi tersebut untuk
mengadakan eksitasi elektron. Eksitasi ini hanya akan terjadi bila energi radiasi
yang diperlukan sesuai dengan perbedaan tingkat energi dari keadaan dasar ke
keadaan tereksitasi dan sifatnya karakteristik.
Ketika melakukan pengukuran menggunakan alat spektrofotometer
UV-Vis harus menggunakan larutan blanko sebagai pembanding. Larutan
blanko adalah larutan yang berisi selain sampel yang akan diukur dapat berupa
pelarut sampel tersebut. Larutan blanko diukur pada absorbansi nol agar larutan
blanko tidak menyerap radiasi dari sinar. Pada praktikum ini larutan blanko
berisi pereaksi biuret dan aquades yang akan meneruskan sinar pada daerah
panjang gelombang yang digunakan tetapi tidak menyerap sinar.
Panjang gelombang maksimum dapat ditentukan dengan mengalurkan
absorbansi terhadap panjang gelombang dari suatu larutan dalam deret standar
yang dituangkan dalam bentuk kurva. Berdasarkan kurva tersebut maka
panjang gelombang maksimum untuk pengukuran sampel protein adalah 545
nm dengan absorbansi sebesar 0,518. Dengan demikian penentuan absorbansi
selanjutnya untuk konsentrasi yang berbeda ditentukan menggunakan panjang
gelombang maksimum. Hal ini sesuai dengan (Janairo, dkk, 2011) yang
menyatakan bahwa warna biru pada larutan protein dapat diamati pada 545 nm.
Penentuan panjang gelombang maksimum pada analisis dengan
spektrofotometri Uv-Vis dilakukan untuk memperoleh sensitivitas maksimum.
Pada λmax dapat diketahui adanya perubahan absorbansi yang tinggi pada tiap
konsentrasi. Pada panjang gelombang maksimum itulah yang kemudian
digunakan sebagai dasar pengukuran selanjutnya dan memberikan kepekaan
analisis yang maksimum sehingga dihasilkan kesalahan yang kecil.
Setelah mendapatkan panjang gelombang maksimum maka dapat
ditentukan konsentrasi sampel protein melalui kurva kalibrasi yang
mengalurkan hubungan antara nilai absorbansi dari masing-masing larutan
standar terhadap konsentrasi (mg/mL). Kurva kalibrasi menurut Lambert-Beer
adalah bentuk linear yang ditunjukkan dengan nilai R² = 0.8632. Kurva
kalibrasi yang linear ini menunjukkan kesesuaian dengan hukum Lambert-Beer
yaitu absorbansi dan konsentrasi larutan berbanding lurus, A = ε b C, semakin
besar konsentrasi larutan maka absorbansinya juga akan semakin besar.
Berdasarkan hasil analisis data didapatkan nilai absorbansi sampel
sebelum pengenceran yaitu sebesar 1,25 dan setelah pengenceran 0,25. Pada
kurva kalibrasi antara absorbansi dengan konsentrasi menunjukkan persamaan
linear dari kurva tersebut yaitu, y = 3.2825x - 0.071. Dengan mensubtitusikan
nilai absorbansi cuplikan pada persamaan linearitas kurva kalibrasi sebagai
nilai y, maka akan didapat nilai konsentrasi cuplikan sebagai nilai x dan
menghasilkan konsentrasi sampel protein X sebelum pengenceran sebesar
0,402 mg/mL dan setelah pengenceran sebesar 0,09 mg/mL.

H. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
unntuk menentukan nilai konsentrasi dari protein secara kuantitatif dapat
dilakukan dengan uji biuret. Prinsip metode biuret adalah reaksi protein dengan
ion Cu2+pada suasana basa yang menghasilkan warna ungu dan pengukuran
absorbansi menggunakan spektrofotometri UV-Vis yang diukur pada panjang
gelombang maksimum yaitu 545 nm. Persamaan yang didapat dari larutan
standar adalah y = 3.2825x - 0.071 sehingga dengan menggunakan Hukum
Lambert-Beer didapatkan konsentrasi protein pada sampel sebelum
pengenceran sebesar 0,402 mg/mL dan setelah pengenceran sebesar 0,09
mg/mL.
DAFTAR PUSTAKA

Janairo, Gerardo; Sy, Marianne Linley; Yap, Leonisa; Llanos-Lazaro , Nancy;


Robles, Julita. 2011. Determination of the Sensitivity Range of Biuret Test
for Undergraduate Biochemistry Experiments. Manila: De La Salle
University.

Katili, Abubakar sidik. 2009. Struktur Dan Fungsi Protein Kolagen. Jakarta :
LIPI.

Mandle, Anil Kumar; Jain, Pranita; Shrivastava, Shailendra Kumar. 2012. Protein
Structure Prediction Using Support Vector Machine. India: Technological
Institute Vidisha.

Marks, Dawn B. dkk. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar Sebuah Pendekatan


Klinis. New York : EGC.

Mufiddah, Ayu A. 2017. Biokimia kedokteran. Malang : Universitas Brawijaya.

Mufiddah, Ayu A. 2017. Teori Dasar Protein. Malang : Universitas Brawijaya.

Munthe, Iskandar, dkk. 2012. Analisis Kadar Protein Ikan Depik (Rasbora
tawarensis) Di Danau Laut Tawar Kabupaten Aceh Tengah. Banda Aceh :
Universitas Syiah Kuala.

Putri, Ariza Abu Bakar, Yuliet, Jamaluddin. 2016. Analisis Kadar Albumin Ikan
Sidat (Anguilla marmorata dan Anguilla bicolor) dan Uji Aktivitas
Penyembuhan Luka Terbuka pada Kelinci (Oryctalagus cuniculus).
Indonesia: Universitas Tadulako.

Soderberg, Johanna. 2013. Functional Properties Of Legume Proteins Compared


To Egg Proteins And Their Potential As Egg Replacers In Vegan Food.
Swedish: Swedish University of Agricultural Sciences.

Triwahyuni, Endang Maharani. 2010. Kadar Protein Kista Artemia Curah yang
Dijual Petambak Kota Rembang dengan Variasi Suhu Penyimpanan.
Semarang : Universitas Muhammadiyah Semarang.