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'I'ECNOLOGIADEL AGUA -
i
ARTIEULOS TECh¡leo5
Métodos directos
Métodos groviméiricos
Métodos espectrofofométri cos
Méiodos microscópicos de recuenio celulqr en cómoros de europio,
Microscopío de epifl uorescencio Noronio de ocridino, DAPI, queloto
Mg-'A'NS
CTC, SFDA
FISH
Métodos de siembro
Métodos indirectos
Méiodos físico-químicos indi rectos: COT, DQO
ATP
Actividod deshidrogenoso
Métodos cinéticos Adoptociones del Respirómeiro de Worburg
Tosq de respiroción
sustroto
Toso de desoporición de
Poienciol bioquímico de producción de metono
Métodos en continuo
de lo biomoso
Fig. 1. Esquemo de los disiintos métodos de deferminoción
el
2,2, Métodos de tal parámetro a partir de una sola por la profundtdad, obteniéndose
esPeclrof otométricos medida de la turbidez. número de micrt-rorganismos Por
(núrrnero cé-
Se basan en la existencia de tlna Se trata de métodos ráPidos, Pero unidad de volumen de
r,
relación directa entre el número to- de baja sensibilidad y que presentan lulas.ml generalmente).
(tiPo El recuento de microorganismos
tal de microorganisn-los Presentes problemas de calibración de
en cámaras no es un método muY
en una nlllestra y stl valor de turbi- cultivo, medio de cultivo) y de inter- exacto debido a las irregularidades
dez. Tras la determinación de la tur- ferencias con partículas.
bidez de la suspensión celular me- en la distribución de la muestra.
O resul-
O diante espectrofotometría, el 2,3, Métodos microscóPicos Además. pueden confundirse las cé-
e
c\ taclo se expresa en unidades de ab- de recuenlo celular en lulas con otras formas orgánicas
y
U sorbancia. Sin embargo, antes de cámoras inorgánicas existentes en el medio
M de Existen diversos tiPos de cáma-f no permite distinguir células vivas
cO utilizar 1a turbidez como método de células muertas.
l
reclrento, hay que tealizar una recta as pafa el recttento de rnicroorga-
(, nismos tales como la cámara de
de calibrado qLre relacione medidas
o directas (microscóPicas, Por re- Neubauer. Thoma, Bürker, Ttirk, 2.4. Métodos microscéPicos
rr) cuento en placa o Pcso seco) con las Fuchs-Rosenth¿rl, Mal assez, Petroff medianle epifluorescencid
O H ttrser, etc. El recuenlo de microol'- La microscoPía de ePifluores-
C\ indirectas de 1a turbidez. Esta recta a
de
w contiene datos sobre el nítmero ganismos se realiza en la cuadrícula cencia comenzó a emPlearse Prin-
ffi
células, permitiendo la estimación central cle la cámara y se multiplica cipios de los 70 Y hoY en día se con-
,f
IICNOI,OGIA I)IIL AGUA
ARTICULOS TECNTCOS
sidera como uno de los mejores mé- mente inactivas, y las vivas, ya que
todos para la estimación de la bio- el ADN conserva sus propiedades La epifluorescencia
masa. La epifluorescencia es debida incluso en células muertas.
a un agente fluorocromo, a la adi- El quelato de europio, al igual
ción de algún anticuerpo marcado que el naranja de acridina o el DA- es un método
con fluorescencia (inmunofluores- PI, es un colorante específico de
cencia) o a una autofluorescencia ácidos nucleicos. Otros fluorocro-
natural debida a la existencia de al- mos como las sales de magnesio
gún componente celular autofluo- del ácido 1 -anilino-8-naftalensul-
rescente. fónico (Mg-ANS) tiñen principal-
Cuando la epifluorescencia se mente componentes celulares co-
debe a un agente fluorocromo, el mo proteínas, lípidos o membranas
procedimiento consiste en la tinción celulares. En cambio, el comporta-
de las bacterias con dicho agente y miento de estos agentes fluorocro-
posterior recuento mediante mi- mos es el comentado anteriormen-
croscopía óptica con iluminación de te, sobrestiman el número de célu- cífica, y puede realizarse in situ.
epifluorescencia. Los sustratos las viables al no distinguir células También puede llevarse a cabo me-
que vivas de muertas. diante hibridación de sondas fluo-
fluorescentes o fluorocromos se
han empleado para la observáción En el segundo grupo quedarían rescentes de ADN o ARN (Fluores'
directa de bacterias se clasifican en englobados fluorocromos como el cent in situ hybridization, FISH),
dos grupos. En el primero de ellos cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil te- cadavezmás utilizadas en Ecolosía
quedarían englobados aquellos trazolio (CTC, Rodríguez et al., Microbiana.
fluorocromos que tras ser adsorbi- 1992) ó el 5- (y 6-) diacetato de
dos actúan específicamente sobre sulfofluoresceína (SFDA, Tsuji et 2.5 Mé¡odos de siembro
ácidos nucleicos u otros componen- al., 1995). Ambos fluorocromos, a El recuento de microorganis-
tes celulares. El segundo incluiría a diferencia con los anteriores, dis- mos viables se fundamenta en la
todos aquellos que tras ser sustratos tinguen bacterias metabólicamen- capacidad de dichas células via-
de una determinada actividad meta- te activas de las que no lo son ne- bles de desarrollar una colonia vi-
bólica, son convertidos en molécu- diante la observación microscópi- sible en un medio de cultivo apro-
las fluorescentes. ca del producto fluorescente resul- piado. En los recuentos.n piu.u
AI primer grupo pertenecen los tado de Ia actividad metabólica pa- por vertido, un volumen de 0,1- I
principales fl uorocromos utilizados ra la que son específicos. En el ca- ml de la suspensión microbiológi-
para la estimación de la población so del CTC 1a actividad metabólica ca se mezcla con el medio de culti-
total de una muestra: el naranja de es la respiratoria y en el del SFDA vo fundido y parcialmente enfria-
acridina y el 4,6-diamidino-2-feni- es la actividad esterasa. La epi- do en una placa de Petri. En los re-
(DAPI).
lindol Estos fluorocromos fluorescencia basada en fluorocro- cuentos en placa por siembra en
permiten distinguir células de partí- mos como eI CTC y el SFDA pon- superficie, se extiende un volumen
culas e identificar bacterias no sólo drá de manifiesto aquellos micro- de aproximadamente 0,1 ml de la
por su color, sino también por su organismos en los cuales estén suspensión sobre la superficie del
forma y tamaño. presentes dichas actividades meta- medio de cultivo. Los resultados
bólicas, pero sin cuantificarlas. de los recuentos en placa se expre-
El naranja de acridina colorea
Salvando este obstáculo se en- san como unidades formadoras de
tanto el ADN como eI ARN de las
cuentran las medidas bioquímicas colonia (UFC) por unidad de volu-
células emitiendo
a una longitud de
onda aproximada de 470 nm. Los de determinación indirecta de la men de la suspensión microbioló-
gica. Para que el recuento sea esta- a)
ácidos nucleicos de hebra simple se biomasa, que sí cuantifican activi- O
dísticamente srgnificativo, el núl-
colorean de un color naranja-rojo dades metabólicas. c\
fluorescente, mientras que los de La epifluorescencia es un méto- mero de colonias deberá estar
LIJ
comprendido entre 30 Y 300 colo-
doble hebra adoptan un color verde do simple y rápido. No obstante, su M
nias. En el caso de muestras mttY cO
fluorescente. EI fluorocromo DAPI reproducibilidad está cuestionada y _l
es un colorante específico del ADN
diluidas se puede emplear 1a filtra- F-
necesita un equipamiento relativa-
y su pico de excitación se encuentra ción de membrana, en la que tras la
mente caro.
filtración de la muestra es el filtro rr)
próximo a la región ultravioleta La fluorescencia mediante anti-
(365 el que es colocado finalmente so-
nm). A pesar de las ventajas cuerpos marcados con agentes fluo- O
que supone el uso de estos fluoro- rescentes está basada en las propie- bre el agar (Atlas, 1992). C\
cromos, no permiten distinguir en- dades inmunológicas de las células. Otro tipo de recttentos los consti-
tre las células muertas, metabólica- Es una técnica muy sensible y espe- ret
tuyen aquellos que emPlean tln me-
ARTIEULCIS TEeNTCOS
dio de cultivo líquido como es el ca- mar biomasa viva son los ácidos nu- análisis más sensibles necesitan del
so de la estimación del número más cleicos, las proteínas, Ios polisacári- uso de cromatografía líquida
probabie (NMP). dos,los lípidos y el ATP. (HPLC) o gaseosa (GC). Todas es-
El recuento de microorganismos
3.1 .l . Ácidos nucleicos tas técnicas son laboriosas. muy
viables se fundamenta en el desarro- largas y necesitan de un equipa-
llo de una colonia visible a partir de El ADNI y el ARN son dos com- miento caro (Figura 2).
cada organismo viable. El principal ponentes de las bacterias cuya sínte-
problema de este método es que no sis es proporcional a Ia tasa de creci- 3.1.4. Lípidos
todas las bacterias presentes en una miento. Mientras que las concentra- Los lípidos son un componente
muestra pueden crecer en el medio y ciones de ARN varían considerable- fundamental de las membranas ce-
las condiciones de cultivo seleccio- mente con el estado fisiológico ce- lulares. Su determinación para la es-
nado. Suelen ser, por tanto, métodos lular, la cantidad de ADN es relati- timación de la biomasa de una po-
infraestimativos y estadísticamente vamente más constante. blación bacteriana ofrece muchas
cuestionables (I .azarova y Manem, La cantidad de ADN se determi- ventajas sobre otros métodos. La
r99s). na mediante espectrofotometría, principal ventaja es su alto conteni-
3. Méfodos indirectos de tras su extracción y purificación. do específico y que se encuentran en
Existen diversas técnicas, si bien cantidades relativamente constan-
determinqción de lo presentan la desventaja de que los tes. Otra ventaja muy importante es
biomqsq procedimientos de purificación son que los lípidos no forman parte de
E,stos métodos se basan funda- complejos, con diversas interferen- las reservas ceiulares y se degradan
mentalmente en la determinación cias y bastante costosos. rápidamente durante la lisis bacte-
de algún componente celular espe- 3.1 .2. Proteínas riana. Aproximadamente, entre un
cífico, en la cuantificación de algu- 90-98Vo de los lípidos de las mem-
na actividad enzimática (métodos Existen varias técnicas para el branas celulares está en forma de
bioquímicos) o en la medida de análisis de proteínas totales de una fosfolípidos (Lazarova y Manem,
consumo de sustrato o de la forma- muestra biológica. Algunos están 1 995).
ción de algún producto (métodos muy extendidos y se caracterizan Las técnicas de análisis se basan,
cinéticos). También se incluyen en por su sensibilidad, rapidez y sim- fundamentalmente, en la extracción
este apartado algunos métodos fisi- plicidad. Es el caso de las técnicas celular de los fosfolípidos con un di-
coquímicos. de Lowry et al. ( 195 1 ) y Bradford solvente orgánico, su posterior hi-
Los métodos bioquímicos y ciné- (1916). drólisis ácida para liberar el fosfato
ticos determinan, más que la viabili- La principal desventaja de la de- y, por último, 1a determinación co-
dad de las bacterias la actividad ya terminación de proteínas es que su lorimétrica de éste. Son técnicas re-
que dependen más del estado meta- cantidad en las células está sujeta a lativamente sencillas, reproducibles
bólico de los microorganismos que fuertes variaciones debido, funda- y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fos-
de1 número de individuos. mentalmente, a cambios en las con- fato; Findlay et al., 1989).
diciones fisicoquímicas y al estado
3.l. Componenles celulares fisiológico celular. 3.1.5. Trifosfato de
específicos adenosina o ATP
Cualquier componente celular 3.1 .3. Polisacárídos El ATP presenta las ventajas de
seleccionado para 1a estimación de La mayoría de ias células proca- ser un componente bioquímico cen-
la biomasa viva de una muestra de- riotas contienen ácido murámico tral presente en todos los microor-
be responder a tres criterios filnda- (un peptidoglicano) como compo- ganismos y específico de los micro-
mentales: nente de la pared celular. E,xisten organismos vivos, circunstancias
o Estar presente únicamente en cé- varias técnicas para 1a determina- ambas que permiten relacionarlo
O
O lulas vivas. ción del ácido murámico en mues- con la biomasa viva.
C\l o Ser rápidarrente degradado lras que conlengan microorganis- Una de las técnicas más utiliza-
cuando las células mueran. mos. Todas ellas se basan en la con- das para medir ATP se basa en la re-
U
M
CO
¡ Ser relativamente constante el.l versión del ácido murámico a lac- acción luciferina-luciferasa, proce-
l
F-
concentración respecto a c¿1u.1- tato, segLrida del análisis enzrmáÍi- so responsable de la luz emitida por
bios en ei estado fisiológico celu- co o químico de la concentración las luciérnagas y qlle ha sido am-
lal y entle distintas especies. de lactato. El ácido murámico se pliamente estudiado. En este meca-
LO Hasta el nromento, no exi\tc nrn- extrae de 1as células mediante una nismo de luminiscencia se sabe que
O
C\ gún componente celular que cunpla hidró1isis aicalina y se purifica intervienen luciferina (fenol hetero-
estos tres requerimientos" Sin en- posteriormente mediante cromato- cíclico, LH2), luciferasa (enzima,
w bargo, los ntás adecuados para esti- grafía de intercambio iónico. Otros E), ATP, cationes de n-iagnesio y
rug
l'T.]CNOI,OGIA DEI, AGUA
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Por cada molécula
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de luciferina oxtdada
se emtte un cuanto
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conversión enzimática la fluores-
ceína. La fluoresceína puede ser vi-
aumentar las de ADP y AMP (Uh- sualizada como un proclucto intra-
linder y White, 1983). celular mediante el en-rpleo de la
Io rrricroscopía de epi lluorescencia o
E-LH,-AMP + PPi (1) cuanti ficada mediante espectrofo-
orígeno en un proceso de oxidorre- L + H,O + bioluminiscenciu (2) tometría tras ser extraída con disol-
clLrcción que ocurre en doble etapa: 3,2. Métodos bioquímicos ventes orgánicos.
EI principio en el que se basa la
lH +\TP:tr ---_>
""j +
Las medidas de alguna actividad técnic¿r del FDA es en el car¿'rcterhi-
E,-LH,-AMP+O, _- _____-_--> enzimática pueden considerarse co- drofóbico del diacetato de lluores-
mo una alternativa a los métodos ceína, lo que le permite penetrar a
Ya que por cada molécr¡la de lu- tradicionales. Los ensayos enzimá- través de la brcapa lipídica que for-
cil'erinaoxidada se emite un cuanto ticos son sirnples de realizar y sus ma la membrana celular. Una vez en
cle 1r-rz, la detenninación del ATP en resultados se obtienen rápidamente. el interior celulal',es convertido me-
Llnx mLrestra biológica puede hacer- Adcm¿is. el equiparniento lrecesiu'io diante la actividad esterasa en fluo-
se mediante extracción por ebulli- no es ni costoso ni complejo. La ma- resceína, mo1écula de carácter hi-
ción en tampón Tris (hipocloruro de yoría de las medidas de actividad drofílico que puede ser almacenada
tr'is-hi droximetil-aminoetano) del enzimática se realiza mediante 1a intracelul¿irmente dada 1a baja per-
ATP, incubación con lr,rciferina-lu- convelsión de sustratos específicos neabilidad de la membrana a ésta.
cif'crasay posteriol medida de la luz a productos coloreados que son Ya que las células muertas se carac-
pt'oducidaen un fotómetro con re- cuanti ficados fotométricamente. terizan por presentar abundantes
gistro. La principal desventaja de los orificios en sus r.nembranas, el FDA
I-a mayor desventaja de esta téc- métodos bioquímicos es la varia- sólo tefiirí célulls vivas.
uica es 1a necesidad de procesar 1a ción de las actividades enzimáticas El FDA se ha empleado princi-
ttlue stra con rapidez, ya que el estado celulares con los cambios fisiológi- palnentc en la determinación de la
f isiológico de las célLrlas cambia r¿'r- cos y qlre, una vez que ios microor- actividad de hongos y bacterias en
pidantente
tras la toma de muestra. ganisrnos rllueren, ]as enzimas libe- mllestras de suelos. Sin embargo, se
La lelación entre el ATP, el ADP Y radas pueden seguir actirras. Entre ha encontrado que no todas las espe-
el AMP y el contenido total de de-sox i cies plesentes en el suelo son sensi-
ene las distintas medicl¿ts de actividad
n'ibonucleótidos lefleja la carga r-
bles a esta técnica, ya sea porcllte el
enzimática cabe destacar l¿i activi-
uética de las células [(ATP + 0,5 cl¿rd esterasa y 1a actrvidad deshidlo- FDA no penetra adecuadamettte en
ADP)/(AMP
+ ADp + ATp)1. Esta genasa. las células o porqLle no es bien rete- O
relacitin O
puede duplicalse en sólo O
ttnos segundos. Aigur-ros autores sLl- C\
gielcn
que la carga energética es un U
t'alorntucho ntás preciso qLre el M
CO
conte l
nido absolr-rto de ATP ya que la nido. Tratanclo de ntinin-rizat estos t-
contposición
celular de desoxir.ribu- 3.2.1 Actividad esterasa problemas, en el campo de la ePi-
nttclctiticlos siolrir
varía con el estado fi- El diacetato cle I'luoresceín¿t lluorescencia se han utilizado deli-
r)
ieo cle los nlicloolglrnisrlo.: (FDA) es uu courpllesto que puede vados clel FDA como el diacetato clc O
duriurte
e l cr.ecimiento tlacteriano el ser hiclr'oliz¿ido por enzimas tales (CFDA) y C\
pool
energético clisrlinuye, al clis- coJro proteasas. lipasas y ester¿I-
6-calboxifluoresceína el
diacetato de -5- (y 6-) strlfofluores- ffiffi
ceína (SFDA). este últitro Inencio-
ffi
mlnLrir sas, sienclo e1 producto cle dicha
la conccntración de ATp y
3,2.2. Activídad
deshidrogendscl (DHA)
En una muestra biológica, la de-
terminación de 1a actividad del sis-
tema de transporte electrónico pue-
de realizarse por medida de la acti-
vidad deshidrogenasa. Todos los
microorgani smos aerobios poseen
un sistema de transporte de electro-
nes activo, en el que el más impor-
tante aceptor terminal de electrones
es el oxígeno. En la corriente princi-
pal de este transporte electrónico de lo
participan, entre otras, las deshidro- Figuro 1.3 Visión ol microscopio ópiico { I OOOx) de uno muestro de fongo octivo trotodo según el protocolo INT-
deshidrogenoso.
genasas piridín-dependientes que
necesitan NAD o NADP como co-
enzima y las deshidrogenasas fla- la cuantificación de la actividad res- tes en la muestra metabolizanlama-
vín-dependientes que contienen fl a- piratoria de la muestra. teria orgánica con 1a consecuente
vín-adenín-dinucleótido (FAD) ó El TTC presenta el inconvenien-te disminución del nivel de oxígeno,
flavín mononucleótido (FMN) co- de su elevada sensibilidad al oxí- que es consumido, y el aumento de
mo grupo prostético. Las deshidro- geno (Chung y Neethling, 1989). El la concentración de CO'que es pro-
genasas son enzimas de oxido-re- INT no tiene esta limitación y su uso ducido. El dióxido de carbono es ad-
ducción que participan en el trans- está cada vez más extendido. Sin sorbido en una solución de potasa,
porte de electrones desde un sustra- embargo, su precisión y correlación por lo que la disminución de la pre-
to orgánico a un aceptor final de con la cantidad de biomasa viva no sión en este sistema cerrado es debi-
electrones mediante la transferencia está suficientemente demostrada da al volumen de oxígeno consumi-
de hidrógeno. La determinación de (Singh etal.,1994). do por los microorganismos, lo cual
la actividad deshidrogenasa pttede puede ser medido mediante un sen-
hacerse midiendo la capacidad de 3,3. ffétodos cínéticos sor de presión y registrado. La re-
los microorganismos para reducir La base de estos métodos es la presentación en el tiempo del oxíge-
un indicador o colorante redox. En- medida del consumo de sustrato o no disuelto (mg.l ')informa del
tre estos colorantes se encLtentran de la formación de producto en en- consumo de oxígeno, siendo la pen-
sales de tetrazolio tales como el clo- sayos en discontinuo. El ejemplo diente de la recta de ajuste óptimo la
mro de 2,3,5-trifeniltetrazolio más típico en microorganismos ae- tasa de consumo de oxígeno (OUR)
(TTC) o el cloruro de 2-(p-iodofe- robios es la determinación de la en mg O'l-r.h-1.
ni l) - 3 - (p -n i trofenil )-5 -f'eniltetrazo- DBO, que indica la biodegradabili- Una adaptación del respirómetro
lio (lNT). Ambas se caracterizan dad de un sustrato en disolución a de Warburg para medir el biogás
por ser soh-rbles en agua en su forma través del consumo de oxíseno del producido en procesos anaerobios
oxidada y por formar depósitos ce-I medio. puede encontrarse en James et al. (
ulares insolubles de TTC-fonnazán e 1 ee0).
ffi
tes orgánicos y deterrriinado espec- pada para actúrar como Lllt respiró-
trofotométricamente, permitiendo metro, los microorganismos presen- pue\. se denomina tasa de respira-
]'l.lcN0LO(;t^t)lI_ AGU{
'Ft:{r"*xcs5
&*tTgf;¿-5t*s
La respiración
endógena es
=t directamente
=.
. proporcional a la
. .:¡,,::
concentración de
.
microorganismos
t.¡-t)
ción (en mg O,.l a la velocidad
Fig.4. Sistemo OXITOP lSó WTW poro o deierminoción de DBO con la que los microorganismos uti-
lizan el oxígeno en función a estos
dos conceptos.
La respiración endógena, en la
práctica, se considera qLle es cons-
tante a temperatufa y concentración
Instnimcnlo paru l;r rncclid;l de rnicroorganismos fijos. Por tan-
to, será directamente proporcional a
c1ctr crigeno
la concentración de microorganis-
mos presentes en la suspensión bio-
lógica, estimados como SSV.
La respiración debida a 1a meta-
boliz¿rción del sustrato orgánico
presente en la muestra o respira-
lllcct¡:oclo
ción exógena, será proporcional a
la concentración de sustrato orgá-
orígc11(]
nico rápidamente biodegradable e
inch"riría, si lo hubiera, el consumo
de oxígelro ocasionado por nitrifi-
cación.
La tasa de lespiración total refe-
rida a la concentración de microor-
ganisrnos, expresada como SSV, es
la tasa de respiración específica
(SOUR). Su principal característica
es que define l¿i actividad biológica
en un momento dado de una bioma-
sa específlca. O
La medida cle la actividad bioló- O
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