Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

Análisis Instrumental

Dr. Joaquín Adolfo Montes Molina

Práctica N. 1: Medición de Clorofila en Toloache.

Integrantes Numero de Control

Ariadna De Los Santos
Alegría 16270857
Humberto Morales Cordero
16270880
Soledad Ramírez Jiménez
16270890
Citlali Reyes Hernández
16270891
Alexander Solís Solís
16270896

Q4V

Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México, a 29 de Mayo del

2018.
 Introducción

La clorofila es el pigmento fotorreceptor responsable de la primera etapa en la

transformación de la energía de la luz solar en energía química, y
consecuentemente la molécula responsable de la existencia de vida superior en la
Tierra. Se encuentra en orgánulos específicos, los cloroplastos, asociada a lípidos
y lipoproteínas.

En el campo de la Ciencia y la Tecnología de los Alimentos el interés fundamental

de la clorofila está en el color que confiere a los vegetales verdes, ya que desde el
punto de vista nutricional, solamente el magnesio tiene alguna relevancia, y más
bien es casa.

La falta de estabilidad del color de la clorofila es un problema importante. No

obstante esta falta de estabilidad, se utiliza también la clorofila extraída de vegetales
como colorante natural en algunos alimentos. Es soluble en disolventes polares,
como alcohol o acetona.

La clorofila es un pigmento que se encuentra presente en las plantas. Este pigmento

les proporciona a las plantas su característico color verde. La clorofila absorbe la
luz necesaria para la fotosíntesis, proceso fundamental para fabricar materia
orgánica. La clorofila absorbe principalmente luz violeta roja y azul y refleja luz
verde.

La abundancia de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos

vegetales como los tallos, es la causa de que esas partes de las plantas aparezcan
verdes, aunque a veces en las hojas de algunas plantas la clorofila es enmascarada
por otros pigmentos.

La extracción y reconocimiento de estos pigmentos es interesante para su estudio

y conocimiento de sus propiedades.
 Objetivo

 Reconocer la presencia de clorofila en las hojas de plantas que consumismos

a diario en nuestra alimentación o que se encuentran en el entorno.
 Marco Teórico
Toloache

Es común escuchar a las abuelas y mamás decir: “te dieron toloache, mijito”, cuando
nos enamoramos más de la cuenta y nos traen cacheteando la banqueta. Pero,
¿qué es el toloache y para qué sirve?

Se trata de una planta de origen prehispánico, a la cual los mexicas

llamaban tolohuaxíhuitl o toloatzin. Pertenece al género datura, es originaria del
Continente Americano y en algunas regiones también se le conoce como ‘hierba del
diablo’ o ‘cardo cuco’.

Suele llamarse toloache a varias especies del género Datura, pero hay diferencias
taxonómicas y de toxicidad. El Nombre botánico del toloache corresponden
a Datura inoxia P. Mill. (TSN: 501974), secundariamente a Datura stramonium L.
(TSN: 30520), la familia de las solanáceas (Solanaceae). En el mundo se han
identificado unas 13 especies de toloache, de las cuales, supuestamente, 11 son
nativas de México.

 Datura stramonium L.
 Datura ceratocaula Art: Es un Toloache acuático o semiacuático y de fruto
liso, se ha observado en los estados de México, Querétaro y Oaxaca.
 Datura inoxia Mill: Presenta flores de color blanco, existen en Yucatán,
Nayarit, Sinaloa, Sonora, S. L. Potosí y Oaxaca; es conocido como
(nacazcul). Esta especie de toloache contiene un alcaloide llamado
levascolamina el cual tiene uso como anestésico en oftalmología y
odontología.
 Datura meteloides Dun: Sus flores son blancas o violáceo pálidas, se
encuentran en Baja California, Sonora, Chihuahua, Durango, Sinaloa y
Oaxaca.
 Datura discolor Bern: Se localizan en Chihuahua, Sinaloa y Tamaulipas.
 Datura pruinosa Grem: el fruto de esta especie está cubierta de espinas
delgadas y largas; solo se les ve en Oaxaca.
  Datura quercifolia H.B.R: De hojas pinatífidas, fruto con espinas desiguales
y duras. Se encuentran en Durango, Chihuahua y Sonora.
 Datura villosa Fern: Se ha observado en Durango, S. L. Potosí y Jalisco. Esta
especie es sudamericana y se cultiva en México, llevan el nombre general de
floripondios. "Planta de flores blancas simples o dobles, de 20 cm de largo o
más, florece en los climas cálidos o templados, pero no fructifica. En el
Instituto Médico Nacional se estudió esta datura; habiéndose llegado a la
conclusión de que contiene 0.02% de atropina en las hojas y 0.012% en las
flores".
 Datura arbórea L: De flores que no pasan de 12 cm de largo.
 Datura sanguínea Raíz et Pav: Se caracteriza por tener las flores rojas.
 Datura saveolents Humb. Sus flores son exageradamente olorosas.

El conocimiento popular se refiere a los efectos tóxicos pero representa también

propiedades medicinales, por su actividad analgésica, antiinflamatoria y
psicotrópica.

Debido a que tiene propiedades analgésicas, antibacterianas y antiinflamatorias,

nuestros antepasados la utilizaban para aliviar heridas y dolores severos. No
obstante, la empleaban en dosis muy pequeñas y bajo vigilancia de los médicos de
ese entonces (expertos en herbolaria).

Sin embargo, lo que no es tan difundido es su nivel de toxicidad, que puede producir
vómitos, alucinaciones, taquicardias y en casos severos, daños neurológicos
permanentes y hasta la muerte.

En dosis controladas, y recetadas por un especialista, tiene propiedades

analgésicas y antinflamatorias, tan poderosas que tradicionalmente es utilizado para
calmar dolores de partos.

Anteriormente, en la Santa Inquisición, fue utilizada como método de tortura y en el

México prehispánico se decía que permitía a los hombres viajar a otros mundos.
 LA CLOROFILA.

La clorofila es un pigmento que se encuentra en las plantas verdes y en ciertas algas

y que participa en el proceso de la fotosíntesis, es decir, la transformación de la
energía luminosa del sol en energía química necesaria para el desarrollo de dichas
plantas y algas. Se podría también definir la clorofila como energía solar
concentrada.

Existe una relación estrecha entre la clorofila, la « sangre » de la planta, y la sangre

que circula por nuestros vasos sanguíneos. El Doctor Hans Fischer, premio Nobel
de Química en 1930, ya observó que la sangre humana es prácticamente idéntica
a la clorofila desde el punto de vista molecular. La hemoglobina presente en
nuestros glóbulos rojos, que garantiza el transporte del oxígeno hacia las células
del organismo, contiene el elemento hierro en su estructura. Por otro lado, la
clorofila, cuya función consiste también en oxigenar las células vegetales, contiene
magnesio en su estructura química.

Otro científico, el Doctor Yoshihide Hagiwara, propone una teoría interesante sobre
la absorción y la asimilación de la clorofila en nuestro cuerpo. Según él, la clorofila
es soluble en las partículas grasas y, ya que éstas van directamente a la sangre a
través del sistema linfático, la clorofila también puede ser asimilada del mismo
modo. Una vez en el interior del cuerpo, el magnesio de la clorofila es sustituido por
el elemento hierro. En otras palabras, cuando la « sangre » de las plantas es
absorbida en el organismo humano se transforma en sangre humana, la cual
transporta los nutrientes hacia todas las células del cuerpo.

Además de ser oxigenante, estimulante y antianémica, la clorofila presenta

numerosas propiedades realmente benéficas para nuestra salud, como la
capacidad de inhibir el crecimiento de las bacterias patógenas que se encuentran
en exceso en el intestino y que son la causa de inflamaciones intestinales,
candidiasis, mal aliento, gases, diarrea, estreñimiento y otros problemas digestivos.
La clorofila posee también la capacidad de proteger el organismo de numerosas
substancias cancerígenas reforzando la resistencia de las células, desintoxicando
el hígado y el flujo sanguíneo y neutralizando químicamente dichas sustancias.

Gracias a su gran poder antioxidante se le considera como rejuvenecedor y «

antiaging », ya que ayuda a evitar el deterioro prematuro de las células. Por ello,
puede ser también muy útil para quienes practican una actividad física de alto
rendimiento.

La actividad desodorizante de la clorofila la convierte muy útil en caso de mal aliento

ocasionado por el tabaco, las bebidas alcohólicas, el café y ciertos alimentos.
También ayuda a eliminar los olores provocados por la transpiración, los olores
menstruales, así como los de la orina y las heces.

Numerosos estudios han demostrado que la clorofila estimula el sistema

inmunitario, puede ser beneficiosa para tratar la disolución de piedras de oxalato
cálcico, favorece la cicatrización (¡más de un 30%!) y contribuye, en general, al buen
equilibrio metabólico de nuestro organismo.

La clorofila se encuentra principalmente en las verduras de color verde como las

espinacas, el brócoli, la col, el berro, las acelgas, el perejil y el cilantro. También en
las semillas germinadas y el jugo de hierba de trigo y de cebada. Sin olvidar las
algas marinas y de agua dulce como la klamath, la espirulina y la clorela.

En caso de consumir complementos alimenticios a base de clorofila, es

recomendable empezar con dosis pequeñas debido a la alta concentración del
producto. Cabe destacar que las clorofilas farmacéuticas clásicas contienen cobre
en lugar de magnesio, lo cual podría ser peligroso en caso de una toma importante
o repetida.
 Cuantificación de Clorofila

Las clorofilas son una familia de pigmentos de color verde que se encuentran en las
cianobacterias y en todos aquellos organismos que contienen cloroplastos en sus
células (plantas y protistas), es crítica en la fotosíntesis, proceso que permite a los
organismos absorber energía a partir de la luz solar y transformarla en compuestos
orgánicos y oxígeno.

• La clorofila-a se utiliza para estimar la biomasa planctónica

• Todas las plantas verdes contienen clorofila-a
• Constituye entre el 1 y 2% del peso seco de las algas planctónicas
• Productos de degradación: clorofilides, feoforbides y feofitinas.
• Los pigmentos se utilizan para identificar los grandes grupos algales

Estructura de la molécula de clorofila

• Un anillo de porfirina que contiene magnesio y cuya función es absorber la

luz.
• Una cadena hidrófoba de fitol cuya función es mantener la clorofila integrada
en la membrana fotosintética
Las clorofilas tienen típicamente dos grupos de absorción en el espectro visible:

• En la zona de la luz azul (400-500 nm)

• En la zona roja del espectro (600-700 nm).

Las clorofilas reflejan la parte media de color verde (500-600 nm)

Precauciones en el procesamiento de las muestras

• Luz
• Calor
• Ácidos

Métodos de Cuantificación

• Espectrofotometría
• Fluorométrico
• HPLC – High-Performance Liquid Chromatographic

Fluorométrico

• Es más sensitivo que el espectrofotométrico

• Requiere menos volumen de muestra
• Puede ser utilizado en mediciones en vivo.
 • Puede sobre o subestimar la concentración de clorofila a

HPLC

Espectrofotométrico

• Concentración
• Extracción
• Clarificación
• Cuantificación
• Control analítico interno

Equipamiento y reactivos

• Sonicador Ultrasónico o Mortero de vidrio

• Centrífuga de mesada: 3000 rpm

• Solución saturada de MgCO3: Agregar 1 g de MgCO3 a 100 mL de agua reactivo.

Filtrar sobre membrana de fibra de vidrio de 1µm de poro.

• Acetona 90%: 90 partes de acetona + 10 partes de solución saturada de MgCO3

Equipamiento y reactivos

• Espectrofotómetro UV - Visible: Ancho de banda 0.5 a 2.0 nm

• Cubetas

• Ácido clorhídrico, HCL, 0.1N

• Patrón de clorofila a: 1 mg de Anacystis nodulans - Sigma

Concentración

• Homogeneizar suavemente la muestra

• Filtrar la muestra sobre membrana de fibra de vidrio de 0,7 a 1 µm de poro

• Antes de completar la filtración agregar 2 mL de solución de MgCO3

• Envolver al resguardo de la luz en papel de aluminio y colocar en freezer no más

de 28 días, si no se va procesar inmediatamente.

Extracción

• Ruptura Celular Disruptor Celular Ultrasónico Mortero

• Solvente Acetona 90% + 10% MgCO3

• Tiempo y temperatura de extracción 2 a 24 h a 4 °C

• Colocar la membrana con el contenido de fitoplancton en un tubo de centrifuga con

5 mL de acetona al 90%

• Romper las células de fitoplancton con disruptor celular en un tubo de centrífuga,

o con mortero de vidrio

• Ajustar el volumen total a 10 mL con acetona 90%

• Dejar 2 a 24 h a 4 °C en oscuridad

Clarificación

Centrifugación: 3000 rpm – 20 min Extraer 5 ml del extracto clarificado con pipeta

Filtración: Jeringa con filtro 0,45 µm de poro resistente a solventes

Cuantificación

• Lectura del extracto en espectrofotómetro

• Longitudes de onda: 664 y 750 (antes de acidificar) 665 y 750 (acidificado con 0,3
mL HCL 0,1 N/10 mL)

• Aplicar la fórmula para determinar concentración de Clorofila a

• ¿Por qué se acidifica?

• Porque la clorofila a puede ser sobreestimada incluyendo a los feopigmentos, que
absorben cerca de la misma longitud de onda que Clorofila a

• Al acidificarse la clorofila a pierde el átomo de magnesio, convirtiéndose en

feofitina a.

• Clorofila a pura es convertida en feofitina a pura por acidificación, la relación es

𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝟔𝟔𝟒/ 𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝟔𝟔𝟓= 1,70

Significa que no hay feofitina ha Estado fisiológico de las células es excelente

• Feofitina a pura no se produce la reacción al acidificar y la relación es

𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝟔𝟔𝟒 /𝒂𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝟔𝟔𝟓= 1,0

Significa que todo es feofitina ha Estado fisiológico de las células es senescente

Las mezclas de clorofila a y feofitina a tienen rangos que van entre 1,0 y 1,7. Usando
Acetona 90% como solvente

Cálculo y expresión de los resultados

• Restar las absorbancias leídas a 750 nm sin acidificar y acidificadas a las lecturas
a 664 y 665 nm. Con las absorbancias corregidas, calcular la concentración de
Clorofila a

(664-750) – (665a-750a)

Clorofila “a” (mg/m3) =(𝟐𝟔,𝟕 (𝟔𝟔𝟒 – 𝟔𝟔𝟓) 𝑽𝟏) /(𝑽𝟐 𝑳)

26,7= Corrección de absorbancia

664 y 665= DO corregidas

V1= Volumen del extracto en L

V2= Volumen de la muestra en m3

L = recorrido de luz de la cubeta en cm

Las unidades en mg/m3 son equivalentes a µg/L

• El valor 26,7 es la absorbancia corregida es igual A x K

• A= Coeficiente de absorbancia para clorofila “a” a 664 nm= 11,0

• K= Corrección por acidificación= 2,43

(664/ 665clorofila a pura)/((664 /665 clorofila a pura)-(664/ 665 feofitina a pura))=

𝟏, /(𝟏,𝟕−𝟏,𝟎)= 2,43

Control de calidad analítico interno

Evaluación del estándar Concentración: Dentro del rango de trabajo Frecuencia:

Cada vez que se analice una serie de muestras Evaluación: Carta control de medias

Control de calidad analítico interno

Análisis de blancos Blanco: Agua reactivo Frecuencia: Cada vez que se analice una
serie de muestras Evaluación: ≤ LD

Control de calidad analítico interno

Análisis de duplicados Muestra: Agua cruda – Estándar de 10 µg/L Frecuencia:

Cada vez que se analice una serie de muestras Evaluación: Carta de control de
rangos
 Materiales
 Medidor De Clorofila Spad Minolta 502 P Y Pdl.
 Flexómetro.
 Calibrador Vernier.
 Toloache (planta utilizada).

Procedimiento

1. Escoger una planta para medir su clorofila.

2. Medir el grosor de planta utilizando el calibrador Vernier y también la altura

con el flexómetro y anotar ambas medidas.

3. Escoger 3 hojas en una planta escogida (en este caso Toloache) y mide la
clorofila con el medidor de esta y observe la cantidad que tiene de clorofila
la hoja. Repita esto con las 3 hojas.

4. Anote las medidas y repita esto con 3 hojas de una planta de Toloache y
otras 3 hojas de otra planta de Toloache.
 Resultados y Observaciones

Como podemos observar, el Toloache utilizado en la práctica se midió tanto de

grosor como de altura, dando 8.41 mm en el grosor mediante el calibrador de
Vernier y de altura, utilizando un flexómetro midió 60 cm. Luego nos dirigimos a
realizar la medida de clorofila en las 3 plantas diferentes de Toloache.

En la imagen, en las tres plantas, hicimos 3 repeticiones con 3 hojas, donde pudimos
medir la clorofila que tiene específicamente utilizando el aparato especializado para
esto (medidor de clorofila) y ver el rango de la clorofila en una planta de Toloache.
A continuación, observamos una tabla con los números de plantas de Toloache
utilizadas y sus repeticiones mediante 3 hojas medidas en el transcurso de la
práctica:

Como podemos ver, cada planta tiene 3 repeticiones las cuales marcaron tales
números de clorofila en sus hojas, los cuales son señales de que el Toloache
medido tiene niveles normales y distributivos de clorofila, las hojas tienen
proporciones considerables en un rango y los números no varían muchísimo en el
como sucede en otras plantas con mayores incrementos de clorofila en unas hojas
más que en otras.
 Interpretación de la práctica de campo de la clorofila.

En esta práctica evaluamos la concentración de clorofila en diferentes plantas y

observamos las variaciones en los niveles de esta, también notamos como difieren
en cantidad sobre su clorofila en cada hoja y planta, esto debido en parte a la edad
de las plantas y otros factores a las que estas se encuentran expuestas.
Con los datos que recaudamos de clorofila de la planta de toloache y junto con los
datos de las demás plantas de otros equipos como la papaya, tabaco, cresta de
gallo, hawaiana y chipilín, pudimos obtener la siguiente grafica en la cual podemos
observar y comparar las diferentes concentraciones de su clorofila.

% clorofila dms= 9.5

ab
80 a
c bc
70
c
60
50 d
% clo

40
30
20 clorofila
10
0

plantas

Las concentraciones de clorofila en hojas tanto en plantas grandes como en

pequeñas mostraron diferencias estadísticas entre ellas (Método: 95.0 porcentaje
Tukey HSD)
En la planta de papaya se tuvo menor concentración de clorofila en sus hojas; por
el contrario, las hojas de la planta de toloache presentaron mayor concentración de
clorofila, por sus diferencias de clorofila en cada planta, en la grafica al compararse
se muestran claramente las variaciones.
 Conclusión
Sabemos que la clorofila es un factor importante en la fotosíntesis y que es capaz
de absorber la energía luminosa y gracias a ello puede promover la serie de
reacciones que conducen al almacenamiento de dicha energía en un compuesto de
alto poder calórico.

El organismo vegetal ha desarrollado un sistema para capturar un fotón de luz y

utilizarla energía para elevar el nivel energético de un electrón determinado quepo
steriormente regresa a su nivel basal' cuando esto sucede, el e! ceso de energía
es liberada en diferentes formas.

Medir la clorofila de las plantas es importante porque permite comprender su nivel

nutricional. Medir la clorofila de las plantas sin dañarlas es fundamental.
 Bibliografía

http://www.naturholistica.com/PDF/es/Clorofila.pdf

http://www.cofes.org.ar/descargas/relas/7_jornada/6_CLOROFILA.pdf

https://www.vix.com/es/ciencia/197096/que-es-el-toloache-y-por-que-no-es-una-
pocima-de-amor

http://www.vegetalista.cl/pdf/7experimento_2.pdf

https://aqinstruments.wordpress.com/2013/06/05/medir-la-clorofila-de-las-plantas/

http://www.monografias.com/trabajos10/clorofa/clorofa2.shtml

http://www.tlahui.com/medic/medic27/toloache3.htm