Un procedimiento de extracción alcalina rápida para la detección de ADN de plásmido

RESUMEN : Un procedimiento de para extraer el ADN plásmido desde bacteriana células es

descrito. La método es sencillo suficiente a permiso el análisis por gel electroforesis de 100 o más
clones por día todavía produce ADN de plásmido que es puro suficiente a ser digerible por enzimas
de restricción. El principio del método es la desnaturalización alcalina selectiva de cromosómica de
alto peso molecular ADN, mientras que covalentemente cerrado circular ADN sigue siendo de
doble cadena. Adecuado control del pH se lleva a cabo sin utilizar un medidor de pH. A
neutralización, renaturaliza ADN cromosómico a forma una insoluble coágulo, dejando plásmido
ADN en el sobrenadante. Grande y pequeña plásmido ADN tienen ha extraído por este método.

INTRODUCCIÓN ADN: plásmido bacteriano son ampliamente utilizado como vehículos de

clonación en re- la investigación del ADN recombinante. Después nuevo plásmidos son construido,
se mayo ser aislado y caracterizado con respecto a su tamaño y enzima de restricción patrón por
electroforesis en gel. Un método para la preparación de ADN plasmídico en un muy forma
purificada implica suavemente lisis de las células bacterianas, centrifugación para eliminar la
mayor parte del ADN cromosómico y, a continuación, bandas de ADN residual en un gradiente de
cloruro de cesio en presencia de bomide de etidio. Covalente circular cerrada (CCC) Se une al ADN
un diferente cantidad del tinte lo que lo hace abierto circular (OC) o lineal de ADN y es separarse
fácilmente de este último dos formas de DNA (1). La segundo, más rápida, método para plásmido
preparación ADN emplea hidroxiapatita cromatografía (2); esto también produce altamente
purificado DNA. Sin embargo, para muchos propósitos incluyendo análisis por gel electroforesis,
menos purificada ADN puede ser utilizado. Bajo favorable condiciones, un colonia de las células
lata ser lisadas y plásmido ADN puede ser detectado en crudo extractos después electro- foresis
(3-6); este permisos el analisis de muchos clones y marcas proyección posible. En este informe
nosotros Otro método para describir plásmido Extracción de ADN que es a la vez bastante simple a
detección permiso de muchos pequeño muestras, sin embargo, C) Recuperación de Información
los rendimientos de plásmido ADN en una forma suficientemente pura para ser digerible por
restricción enzimas o a ser usado a transformar otras células. En estos aspectos, el pro- nos
procedimiento describir es más versátil que otros métodos de extracción rápidos. El ADN del
plásmido puede ser detectada en tan poco como 0,1 ml de líquido no amplificada cultura o en una
colonia de células raspó de una placa.

PRINCIPIO DE EL MÉTODO DE EXTRACCIÓN ALCALINA

Trabajadores anteriores han demostrado que existe una estrecha gama de pH (Alrededor de 12,0
a 12,5) dentro de la cual la desnaturalización de ADN lineal, pero no CCC-DNA ocurre y que esta
propiedad puede ser utilizado para purificar CCC-ADN (7-10,20,21). Hemos utilizado este enfoque
para el desarrollo de un método de extracción rápida para plásmido ADN. Las células que
contienen el plásmido son tratados con lisozima se debilite la pared celular y entonces se lisaron
completamente con dodecil sulfato de sodio (SDS) y NaOH. Al elegir la relación de suspensión de
células a Solución de NaOH con cuidado, un alcalina reproducible pH valor es obtenido sin la
necesidad de monitorización el pH con un metro; aún más el control de pH se obtiene mediante la
inclusión de glucosa como una tampón de pH. El ADN cromosómico, todavía en una forma muy
alto peso molecular, es ind selectivamente desnaturalizado cuando el lisado se neutraliza con
ácido de sodio de etilo, la masa del ADN cromosómico renaturaliza y agregados a forma una red
insoluble. Al mismo tiempo, la alto concentración de acetato de sodio causas precipitación de
complejos proteína-SDS (11,12) y de alto peso molecular ARN peso (13). En este Así, la mayor
parte de las tres principales contaminantes macro moléculas son co-precipitado y puede ser
eliminado por un solo centrifugación en un sobremesa centrífuga. El ADN del plásmido (Y residual
molecular bajo peso RNA) son recuperado de la flotante por precipitación con etanol. El ADN del
plásmido mayo ser analizados por electroforesis en gel, ya sea en forma intacta CCC o después
digestión con un restricción enzima.

MATERIALES Y METODOS

Cepas celulares y los medios de comunicación: Escherichia cepas de E. coli HB101 (14), SK1592 (15)
y RRI (16) eran usado para más de la obra reportado aquí. E. Coli F ' cepas GM218 (Thr, leu, arg,
ILV, thy, ura, su, Reca / F'his ) Y JM856 (ThyA, lysA-, pheA, arg, relA, recA7 / F ' Tu +, lys +, phe +,
arg, relA + tif) desde J. George eran crecido en medio mínimo complementado con el de Créditos
proceda nutritionai requisitos en 300C. De lo contrario, L-caldo fue usado pasantes a cabo. Cuando
apropiado, La ampicilina (Ap) fue añadido en un concentración de 100 ug / ml para líquido medio
o 40 ug / ml para placas. Tetraciclina (Tc) fue usado 1514 para agar placas a un concentración de
10 ug / ml. Equipos y reactivos para el plásmido Extracción: De tipo Eppendorf (1,5 ml) y tubos de
polipropileno un sobremesa centrífuga capaz de generar 8-10.000 xg eran utilizado. Un estante de
la celebración de 60 Tubos Eppendorf velocidades arriba manejo de un mayor número de
muestras. Varios bastidores lata ser preparado por el apilamiento de 5 láminas de 2 mm de
espesor de aluminio (o otro metal) y la perforación 11 mm-dia. agujeros en 15 mm espaciamiento
a través de todos simultáneamente; los bordes de cada hoja son plegada como piernas. Para la
eliminación completa de sobrenadantes después de la centrifugación en Tubos Eppendorf, un
Pipeta Pasteur estirado fuera de un se utiliza punta fina. Reactivos: I. solución de lisozima - 2 mg /
ml de lisozima, glucosa 50 mM, CDTA 10 mM, 25 mM Tris-HC1 (pH 8,0). Preparar fresca todos los
días de cristalino soluciones de lisozima y acciones de la otra componentes. Tienda en 0Â ° C. II.
Alcalina línea de solución de SDS - 0,2 N NaOH, 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS). Tienda en
habitación la temperatura; estable durante aproximadamente 1 semana. III. Solución de alta sal - 3
M de sodio acetato (pH 4,8). Preparar disolviendo 3 moles de sodio acetato en un mínimo
volumen de agua, ajuste a pH 4,8 con ácido acético glacial y, a continuación, ajustar el volumen a 1
1. Tienda en habitación la temperatura. CDTA (ciclohexano diamina tetraacetato) es un agente
quelante que es más soluble en alcohol y formas complejos fuertes con iones metálicos que hace
EDTA. EDTA lata ser sustituido para las aplicaciones mencionadas aquí. CDTA de Sigma o Aldrich
Chemical Company fue utilizado. La solución madre de RNAsa A (1 mg / ml en 5 mM Tris-HC1, pH
8,0) es tratada por calentamiento a 1000 durante 10 min. Procedimiento estándar para la
extracción de ADN plásmido de volúmenes pequeños de Cultivos Celulares: (notas se refieren a los
comentarios a continuación.) El método ha sido utilizados principalmente con el plásmido pBR322
(Ref. 16) y sus derivados en E. Coli cepas HB101, RRI y SK 15921. Los clones seleccionados (APR,
TC5 en el caso de plásmidos híbridos con inserciones en el Hind III sitio de pBR322) son adulto en
2.5 ml de L-caldo que contiene 100 ug / ml Ap en 6 ml vials2. Después 18 h de incubación, 0.5 ml
de cultivo se transfiere a un 1.5 ml Eppendorf tubo para plásmido extracción, y el resto se
almacena a -200C después la adición de glicerol a 40%. Todos manipulaciones son realizado fuera
en habitación temperatura a menos que de otra manera se indica. El tubo es centrifugada durante
15 segundos3. La super- de Natant es cuidadosamente eliminado con un fina punta del aspirador y
la célula bolita es suspendido a fondo en 100 ul de solución I. Después un 30 min. período de
incubación a 0 ° C, 200 ml de solución de Se añade II y el tubo es suavemente vórtex. La
suspensión debe ser casi transparente y ligeramente viscoso. El tubo se mantiene para 5 min. en 0
° C y luego 150 ul de solución III es 1515 añadido. Los contenidos del tubo se mezclaron
suavemente por inversión para unos pocos segundo tiempo durante el cual un coágulo de formas
de ADN. El tubo se mantiene a 0 ° C durante 60 minutos. para permitir que la mayor parte de la
proteína, el ARN de alto peso molecular y cro- ADN mosomal precipite. Centrifugación durante 5
min. arroja un casi transparente sobrenadante. Cuatro décimas de ml del sobrenadante se elimina
y transparente 4 conferida a un segundo tube4 centrífuga. Pequeñas cantidades de material
flotante puede ser arrastrada en este momento. Se añade un ml de etanol frío y el tubo se
mantiene a -20 ° C durante 30 minutos. El precipitado se recogió por centrifugación para 2 min. y
se eliminó el sobrenadante por aspiración. El sedimento se disuelve en 100 ul de 0,1 M de acetato
de sodio / M Tris-HCl 0,05 (PH 8) y se volvió a precipitar con 2 volúmenes de etanol frío. Después
de 10 min. a -200C, el precipitado se de nuevo se recogió por centrifugación como antes. El
sedimento se disolvió en 40 ul a continuación, se añade 10 ul de tampón de muestra 5 x agua y.
10-20 ul se aplica a una gel de agarosa para el análisis electroforético. Modificaciones requeridas
cuando el ADN plásmido es para ser utilizado para bacteriana transformación o vaya a ser tratada
por restricción Enzimas: El sedimento en el último paso se vuelve a disolver una vez más en 100 ul
de acetato de sodio 0,1 M / 0,05 M Tris-HCl (PH 8) en lugar de agua y se precipitó con 2 volúmenes
de etanol como antes. Para la transformación, la pastilla puede disolverse en 40 ul de agua o diluir
tampón y unos pocos microlitros añadidos a las células competentes. Para restricción ción enzima
análisis, la bolita se disuelve en 36 ul H20 y 4 ul de pan- pancreática RNasa (1 mg / ml) está
agregado. Después de 30 min. de incubación a 370C, tración trado restricción tampón de enzima y
1 unidad de enzima son añadido. Siguiente un período de digestión (370, 60 min.), La muestra se
mezcla con concentrado tampón de muestra y parte de aplicó a una gel para análisis
electroforético. Conmments y otras modificaciones de la Método: 1. CCC-ADN en otros tipos de
células ha sido con éxito extraído por el método anterior. Incubación en la sala de temperatura o
370C con una solución de YO puede ser necesario a interrumpir Bacilo subtilis (SD Ehrlich, G.
Rapoport - comunicación personal). Una banda correspondiente en tamaño a el 2 p círculo de
levadura células fue detectado por electroforesis en gel cuando alcalina extractos de
Saccharomyces cerevisiae cepa Protoplastos GRF18 (Amablemente preparado por A. Hinnen) eran
examinado. 2. Un medio- culturas ml tienen estado adulto directamente en 1.5 ml Eppendorf tubo
; alternativamente, colonias (3-4 mm diá.) lata ser raspado desde la superficie de una agar placa y
resuspendió en 100 ul de solución de YO. 3. Si el número de células es muy bajo, un más
centrifugación tiempo puede ser necesario para el bolita pegarse adecuadamente a la pared de la
tubo o 0,2 ml de células portadoras lata añadir. 4. Si el 1516 célula número es bajo, 25 ug de ARNt
se puede añadir como vehículo para ayudar a precipitación tación de ADN plásmido. Electroforesis
en gel: 0,8% geles de agarosa eran utilizado, ya sea como 6-m dia. tubos o como de 3 mm de
espesor losas verticales. Tampón de electroforesis contenido 40 mM Tris, acetato de sodio 20 mM,
EDTA 2 mM, se ajustó a pH 7,8 con ácido acético ácido. 5 x tampón de muestra contenía 25% de
sacarosa, acetato de sodio 5 mM, 0,05% bromofenol azul, 0,1% SDS. Después de la electroforesis,
los geles se tiñeron con etidio bromuro (1 ug / ml) y fotografiado bajo UV iluminación. Las enzimas
de restricción: La mayoría fueron obtenidos a partir de Biolabs y utilizado bajo condiciones
descrito por el fabricante. Hind III se preparó en este instituto por A. Meier. Todos los
experimentos que interviene el ADN recombinante se llevaron a cabo con el el permiso de los
franceses Comisión en Recombinante ADN de acuerdo a la francesa Directrices.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tratamiento de ADN de plásmido con álcali: El método de extracción nosotros tener descrito
implica la exposición de un extracto crudo a pH alcalino para desnaturalizar cro- ADN mosomal. Sin
embargo, cuando ADN circular cerrado covalentemente se expone a > pH 13, da lugar a una forma
desnaturalizada que es no fácilmente renaturable (8,9). La generación de esta forma
"irreversiblemente desnaturalizada" (que es ser evitado en la preparación de plásmido ADN) se
ilustra en la Fig. 1. Fig. la muestra la movilidad electroforética de pBR322 ADN, purificado por
métodos convencionales (1). Banda 4 es el superenrrollado (CCC forma). La pequeño cantidad de
forma OC (Banda 3) y CCC-dímero (Banda 2) son También visible. Cuando tratados con 0,1 N
NaOH, se neutralizó, y ejecutar en una gel neutro, un más rápido movimiento banda (Banda 5), lo
que corresponde a la Forma "irreversiblemente desnaturalizado", lata ser visto (Fig. Lb). Dos
menores adicionales bandas que migran cerca a bandas 4 y 5 son también visto. Ella es probable
que éstos representan dos monocatenario formas de plásmido ADN (Lineal y circular) que surgen
por la desnaturalización de la forma OC. Este fue verificado (Higo. lc y ld) por el tratamiento la
forma CCC con nucleasa Sl a introducir un pocos solo capítulo nicks y luego el tratamiento con
álcali como en Fig. Bandas lb. 4 y 5 disminuidos y las bandas de plásmido monocatenario ADN
aumentado en intensidad. Este experimento permitido nosotros a identificar la posición de
"Irreversible desnaturalizado " CCC-ADN en geles, también como a establecer la posición
aproximada de simple Las moléculas de ADN de plásmido varados. 1517
figura 1. alcalina tratamiento de plásmido de ADN y los extractos celulares que contienen plásmido
de ADN. a-agarosa gel electroforesis de pBR322, purificada por con- métodos convencionales. b-
como en a, pero tratados con 0,1 N NaOH para 5 min. en temperatura ambiente antes
electroforesis. c- como en b, pero tratados con nucleasa Si durante 15 min. antes tratamiento con
álcali; d- como en c, pero tratada para 30 min. con Si. e- alcalino extracto de las células de E. coli
HB101 que contienen pBR322. Este gel es sobrecargado para demostrar la posición de bandas
fluorescentes otra que el CCC-forma de plásmido pBR322 (Banda 4). Band 1 - ADN cromosómico;
banda 2 - dímero pBR322; banda 3 - pBR322, OC-forma; banda de 5 - "Irreversiblemente
desnaturalizado" forma de pBR322 CCC ADN; banda de 6 - región de ARN de bajo peso molecular.

El método de extracción alcalina fue diseñado a evitar la generación del "Irreversible

desnaturalizado " forma; en la mismo tiempo, la extractos debe ser alcalino suficiente para la
desnaturalización del ADN cromosómico a ocurrir. Fig. le espectáculos una ejemplo de tal una
extraer, preparado conforme a el método estándar. La gel está sobrecargado a indicar la relativa
posiciones de menor componentes. La pequeño cantidad del "Irreversible forma desnaturalizada "
(Banda 5) carreras justo por delante de la forma CCC (banda 4). Cromosómico contaminante ADN
(Banda 1) y un grande cantidad de bajo molecular peso ARN (Banda 6) son presente. OC DNA
(Band 3) y CCC-dímero ADN (Banda 2) son también detectable. Desde estos otra fluorescente
bandas mayo ser presentar a diverso extensiones durante rutina extracciones de plásmido ADN,
un conocimiento de sus movilidades relativas es útil en la interpretación gel el ectrophoresis
patrones. Cribado por el tamaño de los plásmidos recombinantes preparados por la alcalino
método de extracción: A por lo general usado primero paso en la caracterización de un nuevo
plásmido recombinante es la determinación de su tamaño. Si está formado por integración de un
fragmento de ADN extraño, el tamaño de el fragmento mayo ser estimado por agarosa
electroforesis en gel de cualquiera de los recombinante intacta plásmido o el fragmento cortado.
La al-Kaline extracción método permite ambos tipos de análisis. Un ejemplo de los resultados de
proyección plásmidos recombinantes en un "Escopeta" tipo de experimento es se muestra en Fig.
2. ADN del ratón fue troceados
 Figura 2. Proyección de ratón ADN / pBR322 recombinante plásmidos de gel electro- foresis de -
álcali extraído plásmido DNA. r - mezcla de referencia de la CCC-ADN; los tamaños de referencia
plásmidos (en orden de decreciente movilidad) son 4,3 kpb (PBR322), 5.7 kpb, 8.5 kpb y 11.2 kpb
(PSF 2124). Bandas menores son minación ginarios OC formas en la mezcla de referencia.

por Hind III y se insertó en el único sitio Hind III de pBR322. ApR TcS Se seleccionaron clones y el
plásmido ADN extraído por el método estándar. Después electroforesis en gel de agarosa, la banda
principal de visto en cada ranura tiene una movilidad menor que la de la CCC-DNA pBR322
utilizado como referencia (El más rápido banda en movimiento en la ranura r). El rango estimado
de ADN integrado fragmentos, basado en movilidad relativa a marcador CCC-ADN, era de unos
pocos cientos de pares de bases hasta 3 kpb. Una banda de ADN de plásmido se puede detectar en
cada ranura aunque, en una rutina cribado de base, la recuperación de ADN plásmido varió algo.
Estimamos que, en el promedio, hay aproximadamente 1 ug de ADN del plásmido extraído de 1 ml
de original la cultura no amplificado.

Restricción de la enzima de digestión: Un segundo método importante para caracterizadora

plásmidos recombinantes es la digestión con enzimas de restricción. Tenemos encontró que el
procedimiento de extracción alcalina da una preparación de plásmido ADN que es suficientemente
puro para ser susceptibles a la digestión por varios restricción enzimas incluyendo Eco RI, Hind III,
Bam HI, Hinf I, Ava II, Hinc III y Pst I (Datos no mostrada). Al eliminar el requisito de ADN más
altamente purificado, este método debería simplificar la caracterización de los plásmidos
recombinantes.

Transformación de ADN plásmido extraído: A menudo es útil para ser capaz de pasar de ADN
plásmido de una célula a otras cepas o especies de células bacterianas. Extractos preparado
conforme con el procedimiento que hemos descrito contiene DNA adecuado para uso en
transformación. Rapoport et al. (19) han utilizado una anterior versión del método para este
propósito y se encontraron con que en algunos casos una relativamente baja eficiencia de
transformación fue obtenido. El rendimiento de transformación ha sido mejorada por el
procedimiento de lavado descrito en el Materiales y METODOS. Ahora encontramos que los
extractos de pBR322 transformar com- células HB101 competente en niveles comparables a
pBR322 altamente purificada.

Preparación de grandes ADN plasmídicos : Los plásmidos recombinantes, preparados por la

técnica de "cósmido" (22), se espera que sean 38-52 kpb de longitud. Nosotros probado nuestro
método de extracción alcalina a ver si pudiera ser aplicado a plásmido Los ADN en este rango de
tamaño ya que otros métodos empleando alcalino han sido utilizados con éxito (20,21). E. Coli
ADN, se digirió parcialmente con Hind III, fue insertado en el plásmido pHC79 (De B. Hohn). En
vitro embalaje del ADN ligado y transducción en la cepa de E. coli SF8 fue realizado fuera bajo la
dirección de B. Hohn durante una EMBO Curso. Varios ApR clones eran seleccionado y el ADN
plásmido fue preparado desde dos 4 mm de diámetro. colonias como descrito en Materiales y
Métodos. La ADN fue examinado por agarosa electroforesis en ya sea directamente (Fig. 3a y 3e),
o después de la digestión con Hind III (Higo. 3b y 3f). ADN cósmido lineal, generado por digestión
con Hind III, migra en un tarifa muy cercana a la del fragmento de 7,0 kpb X. La migrar lentamente
bandas en 4a y 4e son presunto a ser grande CCC-AND. La digestión con Hind III generado el
fragmento de tamaño pHC79 esperados como bien como varios otros fragmentos, Incluyendo
algunos muy grande queridos. Aunque la digestión con restricción enzima mayo no han sido
completa en este experimento, es evidente estos grandes plásmidos mayo ser preparado por el
método de extracción alcalina. Preliminar resultados sugerir que F'-plásmidos (60-120 x 106
daltons) lata ser también extraído a partir de cepas adecuadas de E. coli (amablemente
proporcionado por R. d'Ari).

CONCLUSIONES Hemos descrito un procedimiento para extraer parcialmente purificada un b c d e

F Figura 3. Análisis de dos "Cósmido" ADNs preparado por la extracción alcalina método. un y e-
plásmido sin digerir ADN; b y f- digerido con Hind III; c- referencia CCC-ADN, con el fin de
disminución de la movilidad: 4.3, 4.9, 5.7 y 11.2 kpb; d- referencia ADN lineal (Hind III digesto de
fago X ADN): 2.2, 2.5, 4.8, 7.0, 10.0 y 24.0 kpb.

plásmido de ADN que creemos que será una adición útil a la lista de otros los métodos
actualmente disponibles. El método es simple y fiable y ha sido usado con éxito en varios otros
laboratorios sin dificultad apreciable. Proyección nuevos plásmidos recombinantes por tamaño es
útil en un principio que caracteriza nuevo plásmidos, en la búsqueda para los plásmidos que
contienen insertos de un tamaño particular, y tal vez en casos donde no selección específica
marcador es disponible para detector recombinantes. Análisis de ADN superenrollado puede dar
una mejor estimación de longitud que el ADN lineal de moléculas de alto peso molecular (23).
Plásmido ADN en esta forma parcialmente purificada es sensible a la digestión por aquellos
restricción enzimas que hemos probado. Esta propiedad de los extractos debe simplificar análisis
de ADN recominant moléculas. AGRADECIMIENTOS HCB fue apoyado en parte por una a largo
plazo Beca EMBO. HCB desea agradecer al Dr. B. Bernardi, en cuyo laboratorio este trabajo fue
realizado a cabo, por su especie hospitalidad.