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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

MICHELLE YUKARI HAYASAKA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO

BIOMEDICINA
SETOR: IMUNOLOGIA (16/04/2018 - 17/05/2018)

Mogi das Cruzes, SP

2018
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

MICHELLE YUKARI HAYASAKA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO

BIOMEDICINA
SETOR: IMUNOLOGIA (16/04/2018 - 17/05/2018)

Relatório de estágio supervisionado do curso

de Biomedicina apresentado à Universidade de
Mogi das Cruzes, como requisito parcial para
obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina.

Supervisor: Professora Renata Castillo

Mogi das Cruzes, SP

2018
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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................................3
1.1. ANTÍGENO........................................................................................................................4
1.2. ANTICORPO .....................................................................................................................4
1.3. INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO.....................................................................5
1.4. SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (AIDS).................................6
1.4.1. Diagnóstico.......................................................................................................................7
1.4.2. Testes de identificação ....................................................................................................7
1.4.2.1. Imunoensaios enzimáticos ...........................................................................................7
1.4.2.2. Testes rápidos ...............................................................................................................8
2. OBJETIVO............................................................................................................................8
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................................9
4. DESENVOLVIMENTO .....................................................................................................10
4.1. REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO ....................................................................................11
4.1.1. Tipagem sanguínea .......................................................................................................11
4.1.2. Teste de Coombs ...........................................................................................................12
4.1.3. PCR ................................................................................................................................13
4.1.4. ASO ................................................................................................................................13
4.1.5. Fator reumatoide ..........................................................................................................14
4.1.6. Waaler-Rose ..................................................................................................................14
4.1.7. Chagatest HAI...............................................................................................................15
4.1.8. Toxotest HAI .................................................................................................................15
4.2. REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO ......................................................................................16
4.2.1. VDRL .............................................................................................................................16
4.3. ELISA................................................................................................................................17
4.3.1. HBsAg ............................................................................................................................17
4.3.2. Anti-HBc ........................................................................................................................18
4.3.3. Chagatest ELISA recombinante..................................................................................19
4.3.4. Bioelisa Toxoplasmose IgG ..........................................................................................20
4.3.5. Biolisa HIV 1/2/O ..........................................................................................................21
4.3.6. Dot Imuno Assay (DIA) ................................................................................................21
4.4. IMUNOCROMATOGRAFIA ........................................................................................22
4.4.1. Dengue............................................................................................................................23
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4.4.2. Beta-HCG ......................................................................................................................24

4.4.3. Sífilis Bio ........................................................................................................................24
4.5. MUCOPROTEÍNAS........................................................................................................25
5. CONCLUSÃO .....................................................................................................................26
REFERÊNCIAS......................................................................................................................27
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1. INTRODUÇÃO

1.1. ANTÍGENO

A resposta imunológica surge como resultado da exposição a um estímulo estranho. Os

chamados, antígenos, são capazes de ativar o sistema imune e induzir a produção de
anticorpos, ou seja, apresentar imunogenicidade. Um antígeno constitui qualquer agente capaz
de se ligar especificamente a componentes do sistema imunológico, sendo eles: o anticorpo ou
a receptores presentes em linfócitos B (BCR, B cell receptor) ou linfócitos T (TCR, T cell
receptor)(COICO; SUNSHINE, 2008; ABBAS; LITCHMAN; PILLAI, 2015).

1.2. ANTICORPO

Moléculas de glicoproteína que são produzidas pelos plasmócitos em resposta a um

imunógeno e que funcionam como anticorpos. As imunoglobulinas derivam seu nome da
descoberta de que elas migram com as proteínas globulares quando soro contendo anticorpos
é colocado em um campo elétrico (MAYER, 2018).
A estrutura básica da imunoglobulina consiste em um monômero formado por duas
cadeias polipeptídicas leves e duas cadeias polipeptídicas pesadas. As cadeias leves são
referidas pela letra “L” (light) e as pesadas por “H” (heavy), estando as quatro cadeias
polipeptídicas unidas entre si por pontes dissulfídicas. Trata-se de uma estrutura tetrapeptídica
básica (FORTE, 2007).
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Figura 1: Estruturação básica de imunoglobulina.

Fonte: COICO (2008)

Para possibilitar a sua participação no sistema imunológico, a estrutura das

imunoglobulinas apresenta várias características essenciais. As duas características mais
importantes são a especificidade e as atividades biológicas. A especificidade é atribuída a uma
determinada região da molécula do anticorpo, constituída pela região hipervariável ou região
de determinação da complementaridade (CDR). Esta região restringe o anticorpo a se
combinar apenas com aquelas substâncias que contêm uma determinada estrutura antigênica.
A existência de um vasto conjunto de potenciais determinantes antigênicos, que são também
conhecidos como epítopos, induziu a evolução de um sistema para a produção de um alto
repertório de moléculas de anticorpos, cada uma capaz de se combinar com uma estrutura
antigênica específica (COICO, 2008).

1.3. INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO

Como já foi citado, a ligação antígeno-anticorpo é altamente específica. O reconhecimento

do antígeno pelo anticorpo envolve ligação não covalente e reversível. Vários tipos de
interações não covalentes podem contribuir para a ligação do anticorpo ao antígeno, incluindo
forças eletrostáticas, ligações de hidrogênio, forças de van der Waals e interações
hidrofóbicas. A força da ligação entre um único local de combinação de um anticorpo e um
epítopo de um antígeno é chamada de afinidade do anticorpo (ABBA; LITCHMAN. PILLAI,
2015).
Os imunocomplexos podem ser dissociados em agregados menores pelo aumento da
concentração do antígeno, de modo que moléculas de antígeno livre deslocarão o antígeno
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ligado ao anticorpo (zona de excesso de antígeno), ou pelo aumento da concentração do

anticorpo, de modo que as moléculas de anticorpo livre deslocarão o anticorpo ligado aos
determinantes antigênicos (zona de excesso de anticorpo). Se uma zona de equivalência é
alcançada in vivo, grandes imunocomplexos podem se formar na circulação. Os
imunocomplexos que são presos ou formados nos tecidos podem iniciar uma reação
inflamatória. (ABBA; LITCHMAN; PILLAI, 2015).

Figura 2 – Complexo antígeno-anticorpo.

Fonte: ABBA (2015).

O fenômeno pró-zona refere-se à formação subótima de imunocomplexos quando os

anticorpos ou antígenos estão presentes em excesso. Esse fenômeno pode causar uma
interpretação incorreta dos resultados (falso-negativo ou falso-positivo), sendo necessário que
se faça uma titulação do anticorpo com quantidades fixas de antígeno, para evitar tais erros
(PARSLOW et al., 2004).

1.4. SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (AIDS)

A AIDS está associada com uma infecção dos linfócitos T, ou seja, os linfócitos que
participam da regulação das respostas imunológicas. Assim, como resultado da infecção com
o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o qual promove uma diminuição na quantidade e
função de uma subpopulação vital de células T, acarretando deficiência imunológica e
tornando o paciente incapaz de resistir a infecções por microrganismos que, em geral, são
benignos (COICO, 2008).
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Diante disso, existem dois sorotipos de HIV. O HIV-1 é o principal sorotipo em todo o
mundo. O HIV-2 ocorre mais vulgarmente na África Ocidental. Ambos causam AIDS e os
canais de transmissão são os mesmos. No entanto, a transmissão de HIV-2 é ligeiramente
mais difícil e o HIV-2 causa uma progressão mais lenta das infecções relacionadas com o HIV
e com a AIDS. Nos adultos, há um período latente longo e variável desde a infecção pelo HIV
até ao aparecimento de infecções relacionadas com o HIV e com a AIDS. Um adulto
infectado com HIV pode não ter quaisquer sintomas durante dez anos ou mais (BRASIL.
Ministério da Saúde, 2015).

1.4.1. Diagnóstico

O diagnóstico sorológico da infecção por HIV é obtido, rotineiramente, por meio da

detecção de anticorpos para HIV no sangue ou em outros fluidos corporais. Os anticorpos são
6 induzidos, em média, em, aproximadamente, 4-6 semanas após a infecção, embora, em
alguns casos, o desenvolvimento de anticorpos detectáveis pode levar até 3-6 meses após a
infecção. Dessa forma, a infecção por HIV não pode ser excluída com base em um teste
negativo realizado 4-6 semanas após a exposição documentada. Durante o período inicial da
replicação viral, os anticorpos estão ausentes e o diagnóstico do HIV pode não ser feito de
forma precisa, utilizando testes que se baseiam apenas em anticorpos. O período de janela
agudo pode ser reduzido por meio do uso de métodos que detectam diretamente um ou mais
componentes (antígeno p24 ou RNA) do HIV (BRASIL. Ministério da Saúde, 2015).

1.4.2. Testes de identificação

1.4.2.1. Imunoensaios enzimáticos

Logo após a descoberta do HIV, os imunoensaios enzimáticos (EIA) foram desenvolvidos

para o diagnóstico da infecção por HIV. Esses EIA detectavam anticorpos específicos para
HIV, um indicador de infecção por HIV, e utilizavam lisados virais como antígenos. Os
ensaios de primeira geração logo foram substituídos pelos de segunda geração, que empregam
antígenos mais específicos na forma de peptídeos sintéticos ou proteínas recombinantes. Esses
ensaios eram mais sensíveis e específicos para detectar anticorpos para HIV. Entretanto, eles
ainda não identificavam respostas precoces de anticorpos na forma de IgM (imunoglobulina
M), devido ao seu formato e desenho. A terceira geração de EIA, por final, utiliza um formato
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sanduíche, que inclui antígenos marcados com enzima e são capazes de detectar respostas de
IgM precoce, reduzindo, assim, o período de janela (BRASIL. Ministério da Saúde, 2016).

1.4.2.2. Testes rápidos

Quando comparados aos EIA, os testes rápidos levam vantagem no quesito tempo.
Enquanto os EIA levam 2-4 horas para detectar anticorpos para HIV, os testes rápidos levam
10-15 minutos, possuindo dispositivos otimizados para acelerar a interação antígeno-
anticorpo. Isso requer o uso de altas concentrações de antígeno e a detecção de complexos
antígeno-anticorpo com reagentes coloridos sensíveis, tais como o ouro coloidal. Os testes
rápidos são ideais para fornecer resultados no mesmo dia em diversas situações, tais como a
realização de testes em populações de difícil acesso, testagem e aconselhamento em
domicílio, testagem por iniciativa do serviço, teste em gestantes e realização de testagem
móvel (BRASIL. Ministério da Saúde, 2016)
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2. OBJETIVO

Aprender a executar técnicas diagnósticas em imunologia, bem como os fundamentos

e metodologias envolvidos em cada uma delas. Saber se relacionar com os demais alunos, se
portar adequadamente no ambiente de trabalho, além de pontificar quanto ao cuidado de
manuseio das amostras e materiais, conduta em laboratório e procedimentos corretos para a
realização dos exames de forma eficaz.
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3. JUSTIFICATIVA

A vivência em um laboratório de análises clínicas é de suma importância para que o aluno

possa aprender a se relacionar com outros profissionais, aplicar a teoria aprendida nos anos de
formação, e principalmente no setor de imunologia, saber como executar cada técnica, e quais
são os princípios e fundamentos envolvidos em cada uma delas.
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4. DESENVOLVIMENTO

4.1. REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO

A reação de aglutinação consiste no princípio imunológico de formação de

imunocomplexos. Na aglutinação, o antígeno utilizado é particulado, ou seja, é fixo a uma
partícula, a qual pode consistir num eritrócito, látex, bactéria, fungo, entre outros (SILVA,
2014; PARSLOW, 2004).
Reações de aglutinação podem ser diretas ou indiretas. No teste de aglutinação direta,
o antígeno faz parte naturalmente da célula, e haverá a aglutinação dessas células promovida
por anticorpos contra esses antígenos. São exemplos de aglutinação direta: a identificação de
antígenos eritrocitários na tipagem sanguínea utilizando anticorpos específicos e a
sorotipagem de bactérias utilizando anticorpos específicos. Os testes que utilizam hemácias
como células antigênicas também podem ser chamados de hemaglutinação direta (VAZ;
TAKEI; e BUENO, 2007).
Já o teste de aglutinação indireta ou passiva emprega a adsorção de anticorpos ou
antígenos solúveis proteicos ou polissacarídeos na superfície de micropartículas inertes
(suportes) que não interferem na interação antígeno-anticorpo, como plásticos, gelatina,
carvão e hemácias formolizadas de aves e carneiros. Um suporte muito utilizado são
micropartículas de poliestireno (látex), homogêneas quanto ao tamanho, com a vantagem de
permitir a realização de testes rápidos de aglutinação em lâminas ou placas planas e com
leitura em minutos. Suportes com antígeno adsorvido são utilizados na pesquisa de anticorpos
específicos, enquanto o teste com suporte revestido de anticorpos, é empregado, por exemplo,
na determinação semiquantitativa de proteínas de significado clínico, como proteína reativa C
(VAZ; TAKEI; BUENO, 2007).
Os testes de aglutinação (ou agregação) estão entre os imunoensaios mais consagrados
e tradicionais. Hoje em dia, grande parte desse método foi substituída por técnicas mais
sensíveis de detecção de anticorpos. Entretanto, os ensaios baseados na aglutinação continuam
sendo rotineiramente utilizados (PARSLOW, et al., 2004).
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4.1.1. Tipagem sanguínea

Fundamento

A tipagem sanguínea é um método que consiste na identificação dos tipos sanguíneos

pelo sistema ABO e Rh, caracterizando-se pela presença ou não de aglutinogênios na amostra
do material biológico (sangue). A determinação do fenótipo ABO pode ser feita pela detecção
sorológica com uso de reagentes imuno-hematológicos, que irão identificar os carboidratos
específicos das hemácias, pela presença ou não das substâncias A e B (BATISSOCO;
NOVARETTI, 2003).
Já a determinação do fenótipo Rh refere-se à presença ou ausência do antígeno D. Esse
método se dá por reação de aglutinação direta ou ativa, ou seja, ocorre o processo
aglutinogênio com o próprio antígeno como partícula, que nesse caso são as proteínas A, B,
AB, ou O e o fator RhD, presentes na membrana das hemácias. Na prática, essa técnica é
muito importante para transfusões de sangues, pois é necessário que haja compatibilidade a
respeito dos sistemas ABO e Rh para que tenha sucesso, sendo evitadas reações no paciente
receptor com o sangue do doador (NARDOZZA, 2010).

4.1.2. Teste de Coombs

Fundamento

Existem duas versões do teste de Coombs: o teste de Coombs direto e o teste de

Coombs indireto. As duas versões diferem de certa maneira na mecânica, porém ambas são
baseadas no mesmo princípio: a utilização de anti-imunoglobulinas heterólogas para detectar
uma reação entre imunoglobulinas e antígeno. No teste de Coombs direto, as anti-
imunoglobulinas são adicionadas às partículas (eritrócitos) que se suspeita tenham anticorpos
ligados aos antígenos em sua superficie. Se, por exemplo, um recém-nato é suspeito de ter a
doença hemolítica do recém-nascido causada pelos anticorpos IgG anti-Rh maternos ligados
aos seus eritrócitos, a adição de imunoglobulina anti-humana a uma suspensão dos eritrócitos
da crianç̧a (teste de Coombs direto) causaria a aglutinação dos eritrócitos. O teste de Coombs
indireto pode então ser utilizado para determinar se o soro da mãe contém anticorpos anti- Rh.
Neste caso, os reagentes anti-imunoglobulinas são adicionados apenas após o soro materno
ser combinado com eritrócitos Rh+. Desta forma, o teste de Coombs direto mede o anticorpo
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ligado, enquanto o teste indireto mede o anticorpo sérico (COICO; SUNSHINE, 2008;
NICÉSIO, 2018).

4.1.3. PCR

Fundamento

A Proteína C reativa é detectada no soro pela reação com um anticorpo específico

absorvido sobre um suporte inerte de látex. Quando presente no soro, une-se aos anticorpos
absorvidos produzindo aglutinação das partículas de látex. Tempos de reação maiores de 2
minutos podem produzir reações falsamente positivas pelo efeito de secagem dos reagentes
(WIENER LAB).

Significado clínico

A Proteína C Reativa (PCR) é uma proteína termolábil que não atravessa a barreira
placentária. Seu nome deve-se à capacidade para precipitar os polissacarídeos C dos
pneumococos. É uma das chamadas proteínas de fase aguda e aumenta no soro em uma
grande quantidade de doenças inflamatórias e como resposta a necrose tissular. Sua
determinação é muito importante devido a seu aumento rápido no começo das doenças, 14 a
26 horas logo após da presença da inflamação ou injuria tissular, desaparecendo na fase de
recuperação. Só aparece durante a fase ativa do processo inflamatório (WIENER LAB).
A PCR encontra-se normalmente aumentada em: artrite reumatoide ativa, infecções
virais, tuberculose, febre reumatoide ativa, enfarte agudo do miocárdio, etc. Também pode-se
encontrar aumentada depois de cirurgias ou após transfusões sanguíneas. A determinação de
PCR não só indica a intensidade da doença, também a resposta do paciente a um tratamento
realizado (WIENER LAB).

4.1.4. ASO

Fundamento

Os anticorpos antiestreptolisina O detectam-se em soro pela sua reação com a

estreptolisina-O adsorvida sobre um suporte inerte de látex. Os anticorpos antiestreptolisina
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reagem com a estreptolisina produzindo uma aglutinação visível macroscopicamente

(WIENER LAB).

Significado clínico

O anticorpo antiestreptolisina-O encontra-se presente em quase todas as pessoas em

títulos baixos, devido a que as infecções estreptocócicas são comuns. Um título alto ou em
aumento de antiestreptolisina O, indica uma infecção recente, produzida pelo estreptococo
beta hemolítico do grupo A, como amigdalite, escarlatina, erisipela, sepse puerperal
(WIENER).

4.1.5. Fator reumatoide

Fundamento

O método fundamenta-se em uma reação de aglutinação de partículas de látex

sensibilizadas com IgG, especialmente tratadas para evitar aglutinações inespecíficas. A
aglutinação é visível em amostra com concentração de FR igual ou superior a 8 UI/mL, de
acordo com as referências estabelecidas pelos Padrões Internacionais da OMS (BIOCLIN).

4.1.6. Waaler-Rose

Fundamento

A técnica de Waaler-Rose (WR) utiliza uma suspensão de hemáceas de carneiro

sensibilizadas com IgG de coelho contra hemácias de carneiro. Estas são sensibilizadas
quando colocadas em contato com soro contendo fator reumatóide aglutinam (ALVARO,
2018).

Significado clínico

Os fatores reumatoides (FR) são um grupo heterogêneo de auto anticorpos dirigidos

contra o fragmento Fc da IgG. Geralmente pertencem ao tipo IgM, mas também foram
encontrados FR de todos os tipos de imunoglobulinas (IgG, IgA, IgD e IgE). Os FR
encontram-se em 70-80% dos pacientes adultos com artrite reumatóide, em 10% dos jovens
com artrite reumatóide juvenil e em uma variedade de outras doenças do tecido conectivo
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como: síndrome de Sjögrems e esclerose sistêmica. São os auto-anticorpos mais comuns

encontrados em pacientes com artrite reumatóide e representam a determinação sorológica
mais requerida para o diagnóstico desta doença. Seu reconhecimento isolado não determina a
presença da doença e é só um dos tantos critérios necessários (clínicos, radiológicos e
bioquímicos) para o diagnóstico de artrite reumatóide (WIENER).
Alguns interferentes podem resultar em um diagnóstico errôneo, como por exemplo:
Utilizar plasma, soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação
inespecífica; Resíduo de detergente na placa pode interferir no teste e gerar resultado falso
(BIOCLIN, 2018).

4.1.7. Chagatest HAI

Fundamento

O teste utiliza glóbulos vermelhos de ave sensibilizados com antígenos

citoplasmáticos e de membrana do Trypanosoma cruzi. Os anticorpos interferentes, que
podem causar aglutinação inespecífica, eliminam-se com a adição da solução protéica que
possui inibidores destes anticorpos (WIENER LAB).
Alguns dos interferentes encontrados nesta técnica são: realização do jejum
inadequado pelo paciente antes da coleta; soros envelhecidos; falta de acondicionamento
prévio da microplaca; falta de homogeneização dos reagentes antes de seu uso; vibrações
acidentais durante o repouso necessário; contaminações acidentais dos reagentes ou do
material utilizado no ensaio; dentre outros (WIENER LAB).

Significado clínico

A doença de Chagas, é uma infecção parasitária produzida pelo Trypanosoma cruzi.

Na maioria dos casos a doença evolui até a fase crônica. O diagnóstico de laboratório depende
do estágio no qual se encontra a doença. Durante a fase aguda, o diagnóstico se efetua
mediante a comprovação dos parasitos no sangue. Durante a fase crônica, utilizam-se métodos
sorológicos como teste de triagem (WIENER LAB).
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4.1.8. Toxotest HAI

Este teste, baseia-se na propriedade que têm os anticorpos anti-Toxoplasma gondii de

produzir aglutinação na presença de glóbulos vermelhos sensibilizados com antígenos
citoplasmáticos e de membrana do parasito. O emprego de ambos tipos de antígenos
incrementa a sensibilidade do método e permite a detecção precoce da infecção (WIENER
LAB).
Alguns interferentes podem acarretar em uma leitura equivocada, como: soros
envelhecidos ou congelados e descongelados repetidamente; falta de acondicionamento prévio
da microplaca; falta de homogeneização dos reagentes antes de seu uso; diluente de Soros
HAI conservado por mais que 5 dias; vibrações acidentais durante o repouso; entre outros
(WIENER LAB).

Significado clínico

A toxoplasmose é uma doença infecciosa geralmente benigna e assintomática do

homem e dos animais, cujo agente etiológico é o Toxoplasma gondii, parasito intracelular
obrigatório de distribuição mundial. Quando a infecção por T. gondii é adquirida durante a
gestação, existe um alto risco de infecção para o feto, podendo provocar aborto ou lesões
graves que são mais severas quanto mais precoce for a contaminação materna (WIENER
LAB).

4.2. REAÇÃO DE FLOCULAÇÃO

O teste de floculação, variante da aglutinação indireta, ocorre quando há interação

direta de anticorpos específicos com o antígeno levando a formação de imunocomplexos em
meio líquido, detectáveis com o auxílio de lupa ou microscopia óptica (VAZ; TAKEI; e
BUENO, 2007).

4.2.1. VDRL

Fundamento

As "reaginas" que se encontram presentes em indivíduos infectados por T. pallidum,

são detectados no soro pela reação com um antígeno cardiolipínico purificado e estabilizado.
Se a amostra contém reagina, esta se unirá ao antígeno produzindo uma floculação visível ao
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microscópio. Desde o início da infecção as reaginas aparecem no soro do indivíduo infectado

que reagem com antígenos de cardiolipina, lecitina e colesterol. Estas reaginas juntamente
com os sinais clínicos são os procedimentos mais rápidos e úteis disponíveis para o
diagnóstico da sífilis (WIENER LAB).
Significado clínico

A sífilis é uma doença venérea causada pela espiroqueta Treponema pallidum, que
possui a capacidade de invadir as mucosas intatas ou a pele em áreas de abrasão. O contato
sexual é a forma mais comum de transmissão. A detecção e tratamento da doença em seus
estágios iniciais são fundamentais a fim de evitar complicações graves como a sífilis
cardiovascular, a neurosífilis e a sífilis congênita (PARSLOW, et al., 2004; WIENER LAB).
Resultados falsamente positivos podem ser observados em indivíduos com quadros
patológicos diversos como: hepatite, gripe, brucelose, lepra, malária, asma, tuberculose,
câncer, diabetes e doenças autoimunes. Estes casos não são muitos comuns e geralmente
apresentam reações com títulos baixos e um histórico clínico que não coincide com as
características da sífilis. Por isso é imprescindível que frente a toda prova qualitativa reativa
seja realizada a prova semiquantitativa (WIENER LAB).

4.3. ELISA

O ensaio Elisa baseia-se na imobilização de um dos componentes, antígeno ou

anticorpo, em fase sólida, e na utilização de um conjugado, que também pode se antígeno ou
imunoglobulina, ligado a uma enzima, com a preservação da atividade enzimática e
imunológica. Como o substrato forma um produto colorido, a alteração de cor é monitorada
visualmente ou por meio de espectrofotômetro, que determina a relação entre a intensidade da
cor e a quantidade do que está sendo analisado na amostra. Esse teste é empregado para a
detecção de antígenos ou anticorpos em um grande número de sistemas (VAZ; TAKEI; e
BUENO, 2007).

4.3.1. HBsAg

Fundamento

A amostra é colocada em contato com um anticorpo monoclonal anti HBs imobilizado

sobre o suporte sólido. Se a amostra contém antígeno HBsAg, esta formará um complexo com
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os anticorpos e permanecerá unido ao suporte. A fração não unida é eliminada por lavagem
depois de agregado outro anticorpo monoclonal anti HBs conjugado com peroxidase. Caso
haja reação na primeira etapa do processo, esta se unirá ao conjugado. Depois de uma nova
lavagem, se agrega o substrato enzimático. Nos casos em que o HBsAg esteja presente em
uma amostra, haverá o desenvolvimento de cor para celeste. A reação é detida com o
acréscimo de ácido sulfúrico, sendo que a cor celeste vira para amarela (WIENER LAB).
Resultados errôneos são possíveis quando há contaminação de reagentes, assim como,
a contaminação do tampão; falta de homogeneização das amostras com o conjugado; lavagem
incorreta; além de contaminação cruzada de amostras (WIENER LAB).

Significado clínico

O HBsAg é geralmente a primeira evidência de infecção por HBV, que pode preceder
em semanas ou meses a qualquer outra manifestação laboratorial ou aos sintomas e
significados clínicos da doença. Pode ser que em alguns casos seja o único indicador de
portadores assintomáticos em indivíduos com a hepatite B crônica. A detecção do HBsAg é
importante, portanto, não só para diagnóstico de doença aguda, mas também para o controle
de portadores em bancos de sangue, unidades de diálise e áreas hospitalares onde exista a
possibilidade de transmissão da infecção (SILVA, et al., 2012).

4.3.2. Anti-HBc

Fundamento

A amostra é colocada em contato com o antígeno HBcAg imobilizado sobre o suporte

sólido na presença do anticorpo anti-HBc conjugado com peroxidase. Na presença de
anticorpos específicos na amostra, estes competirão com o conjugado pelo antígeno presente
no suporte. Depois que incubar e lavar para eliminar a fração não unida, acrescenta-se o
substrato enzimático. Quanto maior a quantidade de anti-HBc presente na amostra, menor
será o desenvolvimento da cor (WIENER LAB).
Constituem causas de resultados errôneos: lavagem incorreta das cubetas de reação;
contaminação cruzada de amostras não reativas com anticorpos procedentes de uma amostra
reativa; contaminação dos reagentes; falta de homogeneização das amostras com o conjugado;
conservação inadequada das tiras de cubetas não utilizadas; contaminação do tampão de
lavagem diluído (WIENER LAB).
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Significado clínico

O antígeno "core" (HbcAg) normalmente não é detectado em soro, porém seu

anticorpo (anti-HBc) apresenta-se entre 10 à 25 dias posteriores à aparição do HbsAg,
persistindo até depois do desaparecimento deste último antígeno e antes da aparição de seu
anticorpo (anti-HBs). Portanto na ausência do HbsAg e anti-HBs, o anti-HBc é o único
marcador sorológico de infecção recente pelo vírus da hepatite B. Por outro lado, visto que
este anticorpo permanece detectável no soro por um longo período (WIENER LAB).

4.3.3. Chagatest ELISA recombinante

Fundamento

Nesta técnica qualitativa para a detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi, a

amostra é diluída num suporte onde se encontram imobilizados antígenos recombinantes,
provenientes de proteínas específicas das formas tripomastigota e epimastigota, constituindo-
se em um método de 3ª geração. Estes antígenos são obtidos pela técnica de ADN
recombinante partindo de proteínas específicas dos estágios epimastigota e tripomastigota do
T. cruzi, correspondentes a zonas altamente conservadas entre diferentes cepas (WIENER
LAB).
Se as amostras de soro contêm os anticorpos específicos, estes formarão um complexo
com os antígenos e permanecerão unidos ao suporte. A fração não ligada é eliminada por
lavagem e após se acrescentam anticorpos anti-imunoglobulina humana conjugados com
peroxidase. No caso de ocorrer a reação na primeira etapa do processo, o conjugado então se
ligará. Após uma nova lavagem se acrescenta o substrato enzimático. A peroxidase presente
no conjugado reagirá com o substrato promovendo o desenvolvimento de coloração azul. A
reação é interrompida com ácido sulfú- rico, que muda a coloração do azul para o amarelo. A
tecnologia empregada permite assegurar uma mistura antigênica de composição conhecida e
constante lote a lote, oferecendo resultados reproduzíveis, específicos e com alta sensibilidade
(WIENER LAB).
Contudo, o procedimento apresenta algumas limitações, como: lavagem incorreta das
cubetas de reação; contaminação cruzada de amostras não reativas com anticorpos
procedentes de uma amostra reativa; contaminação dos reagentes; falta de homogeneização
das amostras com o conjugado; conservação inadequada das tiras de cubetas não utilizadas;
contaminação do tampão de lavagem diluído (WIENER LAB).
 20

Significado clínico

A enfermidade de Chagas, é uma infecção parasitária produzida pelo Trypanosoma

cruzi. O diagnóstico de laboratório depende do estágio no qual se encontra a enfermidade.
Durante a fase aguda, o diagnóstico se efetua diretamente mediante a comprovação dos
parasitas no sangue ou por métodos imunológicos que detectem IgM. Durante a fase crônica,
podem ser utilizados os métodos imunológicos como a reação de fixação de complemento de
Machado e Guerreiro, ou aglutinação de látex, floculação, hemaglutinação, aglutinação direta,
imunofluorescência e ultimamente, ELISA (WIENER LAB).

4.3.4. Bioelisa Toxoplasmose IgG

Fundamento

Ensaio imunoenzimático em fase sólida baseado no princípio de detecção qualitativa e

quantitativa indireta de anticorpos IgG para Toxoplasma gondii em soro ou plasma humano.
anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii, presentes na amostra, se ligam aos Antígenos
revestidos na microplaca formando complexos antígeno-anticorpos IgG. Anticorpos anti-IgG
humano conjugados à peroxidase são adicionados à microplaca, que é então incubada. Os
anticorpos Anti-IgG humano conjugados a enzima ligam-se aos Anticorpos IgG presentes,
ligados aos antígenos. Após esta etapa, o substrato é adicionado e incubado produzindo uma
cor azul, que indica a quantidade de anticorpos IgG Anti-Toxoplasma gondii presentes nas
amostras. A solução de parada é adicionada para interromper a reação havendo uma mudança
de cor de azul para amarelo (BIOCLIN, 2017).

Significado clínico

Após a infecção por T. gondii, os anticorpos IgM aparecem em 5 dias e apresentam

níveis reduzidos dentro de algumas semanas ou meses. Os anticorpos IgG aparecem
geralmente de 1 - 2 semanas após a infecção, alcançando níveis de pico em 6 - 10 semanas
persistindo para toda a vida. Em crianças, o risco de infecção fetal varia de acordo com o
tempo de gravidez, quando a mãe é infectada. Nas infecções maternas que ocorrem durante o
primeiro trimestre, a probabilidade da infecção passar para o feto é menor. Porém, se a
transmissão ocorre, desfechos graves, como aborto espontâneo e hidrocefalia, são mais
prováveis. Infecções adquiridas mais tarde na gravidez, onde as transmissões fetais ocorrem
 21

com mais frequência, tendem ser menos graves, mas mesmo assim podem gerar
manifestações congênitas, incluindo calcificações cerebrais e aprendizagem deficiente
(BIOCLIN, 2017).

4.3.5. Biolisa HIV 1/2/O

Fudamento

Se fundamenta em um ensaio imunoenzimático em fase sólida baseado no princípio

“sanduíche” para a detecção de anticorpos totais (IgG, IgM e IgA) para HIV-1, HIV-2, e/ou
subtipo O em soro humano ou plasma. A microplaca é revestida com antígenos HIV
recombinantes específi cos para HIV-1 (p24, gp41), HIV-2 (gp36) e subtipo O. Anticorpos
contra o HIV-1, HIV-2, e/ou subtipo O presentes nas amostras se ligam aos antígenos HIV
recombinantes revestidos na microplaca formando complexos antígenos - anticorpos HIV.
Após a incubação inicial, a microplaca é lavada para remover materiais não ligados. As
enzimas conjugadas com antígenos recombinantes do HIV são adicionadas à microplaca e
então incubadas. A enzima conjugada com antígenos recombinantes do HIV liga-se aos
complexos imobilizados antígeno-anticorpo HIV presentes. Após esta etapa, os Substratos A
e B são adicionados e incubados, produzindo uma cor azul que indica a quantidade de
anticorpos HIV presentes nas amostras. A Solução de Parada é adicionada para interromper a
reação, havendo uma mudança de cor para amarelo, medida em um leitor de microplacas
(BIOCLIN, 2016).

4.3.6. Dot Imuno Assay (DIA)

Fudamento

Este método se baseia em um imunoensaio que utiliza um suporte sólido em forma de

pente, contendo imobilizados em cada "dente", peptídeos sintéticos de antígenos de
transmembrana de HIV-1 e HIV-2. Se a amostra contiver anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-1
grupo O e HIV-2 vai-se formar um imunocomplexo que ficara unido ao suporte. Após o
lavado, incuba-se o pente com o conjugado de proteína A-ouro coloidal (revelador). A
proteína A se une ao fragmento Fc dos anticorpos. O aparecimento de uma mancha roxa no
lugar onde se encontram fixados os peptídeos sintéticos é indicativo de que se formou o
imunocomplexo e portanto da presença na amostra de anticorpos anti-HIV-1, anti-HIV-1
grupo O ou HIV-2 (WIENER LAB).
 22

Podem-se obter resultados falsos positivos nas seguintes situações: doenças

autoimunes, tuberculose, lúpus eritematoso sistêmico, gravidez, vacinação contra a hepatite B
e outras imunizações, hemodiálise, doença hepática e outras doenças (WIENER LAB).

Significado clínico

A detecção de anticorpos anti-HIV no soro, plasma ou sangue total é mais eficiente e

uma forma comum de determinar se um indivíduo foi exposto ao HIV. Apesar das diferenças
em suas características biológicas, atividades sorológicas e sequências de genoma, o HIV-1,
HIV-2 e subtipo O mostram forte reatividade cruzada antigênica. A maioria dos soros
positivos HIV-2 podem ser identificados por meio de testes sorológicos com HIV-1. O teste
utiliza antígenos recombinantes do HIV para detectar seletivamente anticorpos do HIV-1,
HIV-2 e/ou subtipo O em soro ou plasma. Apesar das diferenças em suas características
biológicas, atividades sorológicas e seqüências de genoma, o HIV-1, HIV-2 e subtipo O
mostram forte reatividade cruzada antigênica (WIENER LAB).

4.4. IMUNOCROMATOGRAFIA

A imunocromatografia significa uma alternativa aos métodos tradicionais, pois trata-se

de uma tecnologia inovadora que concentra a reação antígeno-anticorpo em uma única fase
sólida, sendo esta mantida e utilizada a temperatura ambiente pelo agente de saúde. Além de
possuir sensibilidade e especificidade elevadas, a imunocromatografia possui baixo custo,
pois não exige equipamento ou treinamento específico para realizar o teste ou interpretar o
resultado (VAZ, 2007).
O princípio deste método emprega-se uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada
a uma tira de acetato transparente, que, para detectar antígeno, utiliza-se um anticorpo de
captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado específico ao antígeno pesquisado. Já para
detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como
conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Para assegurar a qualidade dos
reagentes e a realização adequada do procedimento, esses testes rápidos utilizam controles
internos, como nos testes imunoenzimáticos (VAZ, 2007).
 23

Figura 3 – Esquema de teste de imunocromatografia.

Fonte: Biomedicina Padrão, 2018

4.4.1. Dengue

Fundamento

A técnica se baseia no método imunocromatográfico que detecta separadamente

anticorpos das classes IgM e IgG para o vírus da dengue, onde é utilizado anticorpos de cabra
anti-IgG humano na linha teste para IgG, e anticorpos de cabra anti-IgM humano na linha de
teste para IgM. Após a adição da amostra, antígenos do vírus da dengue conjugado a
partículas de ouro coloidal, se ligam aos anticorpos da amostra e migram por capilaridade
através da membrana. Em caso de amostras positivas para IgG, será formada uma linha
vermelha na região teste para IgG. Amostras positivas para IgM formarão uma linha vermelha
na região teste para IgM. A mistura amostra-antígeno continua percorrendo a membrana até
linha controle, onde ocorre a formação de uma linha vermelha, tanto para amostras positivas
quanto negativas. A formação da linha vermelha demonstra que o kit está adequado para uso
(BIOCLIN, 2013)

Significado clínico

O vírus da dengue é um Flavivírus transmitido pelo mosquito Aedes aegypti. Seu

período de incubação é de 3 a 15 dias, com média de 5 a 6 dias. Os sintomas clínicos são
caracterizados por febre alta (39°C a 40°C) de início abrupto, mal-estar, anorexia (pouco
apetite), cefaléias, dores musculares e nos olhos. Casos de dengue hemorrágica pode provocar
gengivorragias e epistáxis, hemorragias internas e coagulação intravascular disseminada, com
danos em vários orgãos, o que pode causar a morte (LAM, 1995).
A infecção primária da dengue causa um aumento de anticorpos IgM após 3 a 5 dias
do início da febre. Anticorpos IgM normalmente permanecem na circulação por 30 a 90 dias.
 24

Pacientes de regiões endêmicas podem apresentar infecções secundárias, que resultam em

níveis elevados de anticorpos IgG, isoladamente ou simultaneamente com uma resposta de
IgM. Desta forma, uma detecção específica de anticorpos IgM ou IgG pode ajudar a
diferenciar uma primária ou secundária. Uma interferência que pode ser comum, seria a
reatividade cruzada com outros vírus do grupo flavivírus (BIOCLIN, 2013).

4.4.2. Beta-HCG

Fundamento

O método emprega uma única combinação de anticorpos monoclonais e policlonais,

para seletivamente identificar a subunidade beta e subunidade alfa do hCG nas amostras, com
alto grau de sensibilidade. O teste consiste no fluxo da amostra sobre um plano absorvente, no
qual um conjugado pigmento-anticorpo marcado liga-se ao hCG da amostra formando um
complexo antígeno/anticorpo. O complexo ligado ao anti-hCG anticorpo na zona positiva de
reação produz uma banda de cor rosa quando o hCG está em concentrações acima de 25
mUI/ml. Na ausência de hCG não há nenhuma linha na zona positiva de reação (EBRAM,
2017).

Significado clínico

Além da gravidez, hCG tem sido produzido em pacientes com ambas doenças
trofoblásticas gestacional e não gestacional. O hCG de neoplasma trofoblástico é similar ao
produzido na gravidez. Estas condições, que incluem coriocarcinoma, mola hidatiforme,
câncer de próstata, câncer de mama e câncer de pulmão causam elevados níveis de hCG,
portanto devem ser descartadas antes que o diagnóstico de gravidez seja definido (EBRAM,
2017).

4.4.3. Sífilis Bio

Fundamento

O Sífilis Bio é um ensaio imunocromatográfico para a detecção qualitativa de

anticorpos totais (IgG, IgM e IgA) anti-T. pallidum em amostras de soro, plasma ou sangue
total. Neste teste, antígenos recombinantes de T. pallidum estão imobilizados na região da
linha teste. Quando uma amostra é adicionada, esta reage com partículas coradas conjugadas a
 25

antígenos de T. pallidum. Este complexo migra ao longo da tira teste e interage com os
antígenos imobilizados. Se a amostra apresentar anticorpos anti-T. pallidum, uma banda
colorida irá aparecer na região teste indicando um resultado positivo. Se a amostra não
apresentar anticorpos anti-T. pallidum, essa banda não irá aparecer indicando um resultado
negativo (BIOCLIN, 2012).

4.5. MUCOPROTEÍNAS

Fundamento

As proteínas se precipitam em solução de Ácido Perclórico, resultando uma fração

glicoprotéica denominada Seromucóide ou Mucoproteínas. Estas são precipitadas no filtrado
com Ácido Fosfotúngstico, posteriormente dissolvidas e dosadas através do conteúdo em
Tirosina com o Reagente de Folin. A coloração azul desenvolvida é proporcional à
concentração de Mucoproteínas presentes na amostra (BIOCLIN, 2013)

Significado clínico

As Mucoproteínas são conhecidas como proteínas de fase aguda. Elevam-se

consideravelmente nos processos inflamatórios agudos e são um importante índice da
atividade reumática, pois se mantêm elevadas, quando outras provas já se normalizaram.
Valores aumentados são observados na tuberculose, doenças do colágeno, diabetes mellitus,
febre reumática, gota e neoplasias. Valores diminuídos são observados nas nefroses,
insuficiência adrenocortical, hipofisária e hepática (BIOCLIN, 2013).
Hemólise com valores de hemoglobina até 10 g/L não interferem na dosagem de
Sífilis. Não foram encontradas interferências significativas até 30 g/L de lípides, 0,2 g/L de
bilirrubina e 60 g/L de proteínas. Além de nenhuma reação cruzada com HBsAg, HCV e HIV
foi verificada (BIOCLIN, 2013).
 26

5. CONCLUSÃO

Todas essas técnicas realizadas no setor de Imunologia são de extrema importância

para o diagnóstico precoce e controle de patologias, pois através delas é possível direcionar o
paciente para o tratamento mais adequado a ser realizado. Ter conhecimento dos fundamentos
em que estão baseadas cada uma das técnicas, promove uma melhor compreensão da
metodologia e interpretação dos resultados de cada exame.
 27

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