UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Bioquímica 2018-A

Practica 3: CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS

Presentado por:

Presentado a:

Dr en C Luis Antonio Páez Riberos

 CURVA DE CALIBRACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN
¿Qué se entiende por curva de calibración?

Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una

sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la
cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita.
En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la magnitud o
intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. Por
ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la aparición de un
color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de
proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente.

Materiales y Reactivos:
Solución estándar de albúmina 10 mg/ml
Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% en NaOH 14%)
Muestra proteica
Vaso de precipitado de 100 ml
Pipeta parcial de vidrio de 2 ml
Vórtex
Reloj
Cubeta para espectrofotómetro
Gradilla para cubetas
Micropipeta
Agua destilada
Espectrofotómetro

Método

Al comenzar nuestro trabajo debemos recordar la manera de usar las micropipetas, ya

que solo unos microlitros de error nos alterarían todo nuestro resultado. Además hay que
tener presente que 500 uL es equivalente a 0.5 mL.
Para obtener nuestras muestras debemos realizar algunas disoluciones, para lo cual
utilizaremos la siguiente igualdad, y de esta manera sabremos el volumen de la solución
de albúmina que necesitamos ocupar:

V1 * C1 = V2 * C2

Como ya conocemos la cantidad de muestra de albúmina que vamos a ocupar el resto del
volumen lo debemos completar con agua destilada. Procedimiento que hay que realizar
para cada muestra.

Tubo 1: agua destilada 0.5 ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 2: Solución estándar 0.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 3: Solución estándar 1.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 4: Solución estándar 2.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 5: Solución estándar 5.0 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

Tubo 6: Solución estándar 7.5 mg/ml + Reactivo de Biuret 2ml

El paso más importante en esta etapa es el agregado del reactivo de Biuret que solo se
agrega cuando todos los tubos estén con su disolución lista ya que a partir de que se
coloca comienza la reacción, y deben comenzar todas las soluciones al mismo tiempo.

Mezclamos y agitamos los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vórtex

Dejamos los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos

Comienza la etapa de la utilización del espectrofotómetro. Para ello tuvimos que elegir 1
cubeta para espectrofotómetro que estuviera en buen estado.

Después de esto con nuestra muestra blanco lo calibramos a cero para comenzar con
nuestro último paso práctico que corresponde a la lectura de la absorbancia.

Tener cuidando de limpiarlas después de haber vaciado el contenido

Luego introducimos cada cubeta en el espectrofotómetro, anotando los datos de

absorbancia de cada muestra

A partir de estos datos se construyó una curva de calibración.

Resultados

Se prepararon seis disoluciones de 500µl, cada una con distinta concentración de BSA, a
partir de una solución madre 10mg/ml. Para esto se utilizó la igualdad:

Cinicial . Vinicial = Cfinal . Vfinal

Donde

C = Concentración de la solución (mg/ml)

V = Volumen de la solución (µl)

Ejemplo para calcular el volumen del tubo nº 1 :

Cinicial = 10mg/ml (concentración de la solución madre)(biuret)

Vinicial = X
Cfinal = 0,5mg/ml (concentración de la solución que se obtendrá después de la dilución)

Vfinal = 500µl (volumen de la solución obtenida)

Luego, reemplazando los valores en (1) tenemos:

10mg/ml . X = 0,5mg/ml . 500µl

Multiplicamos la expresión por 1/10mg/ml

1/10mg/ml . (10mg/ml . X ) = (0,5mg/ml . 500µl) . 1/10mg/ml

Simplificando llegamos a:

X = 0,5mg/ml . 500µl : 10mg/ml X = 25µl

Si el volumen total de la solución es 500µl, necesitaremos

500µl – 25µl = 475µl de agua destilada para completar la dilución.

Luego, usando el espectrofotómetro, se midió la absorbancia del blanco reactivo, de la muestra

problema y de los estándares. Se obtuvieron los siguientes resultados:

Gráfico de la curva (realizado en papel milimetrado)

De acuerdo a la ecuación de la recta del Gráfico I, calculamos la concentración de la muestra.

y = Valor de la absorbancia de la solución. = 0,188

x = Concentración de la solución en mg/ml

Luego:

0,188 = 0,0339 . x à x1 = 5,546mg/ml