Ispitna pitanja za prvi deo praktičnog ispita iz biohemije :)

✔ Ispitati uticaj pH na enzimsku aktivnost

✔ Aktivatori i inhibitori enzimskih reakcija
✔ Specifičnost dejstva enzima
✔ Uticaj temperature na aktivnost enzima
✔ Dokazati proteolitičko dejstvo pepsina
✔ Dokazati proteolitičko dejstvo tripsina
✔ Katalaza u životinjskom tkivu
✔ Dokazati prisustvo ksantin oksidaze u mleku
✔ Ispitati razgradnju skroba dejstvom dijastaze iz pankreasnog ekstrakta
✔ Odrediti aktivnost amilaze u serumu po metodi Wohlgemuth-a
✔ Određivanje aktivnost sGPT i sGOT po metodi Reitman-Frankel-a
✔ Odrediti aktivnost alkalne i kisele fosfataze u serumu po Raabe-ovoj metodi
✔ Dokazati prisustvo vitamina C Tauber-ovom metodom
✔ Dokazati prisustvo vitamina A
✔ Dokazati prisustvo vitamina D
✔ Dokazati prisustvo šećera u mokraći po Benedikt-u i Feling-u
 ✔ 1. Ispitati uticaj pH na enzimsku aktivnost
• Utiče na stepen jonizacije funkcionalnih grupa
aminokiselina koje ulaze u sastav aktivnog mesta enzima
• Utiče na održavanje tercijerne strukture
• Enzimi su aktivni samo u uskom intervalu pH vrednosti
• Izvan tog intervala se njihova katalitička aktivnost naglo
smanjuje
• Optimalni pH omogućava enzimu da bude u najpovoljnijem
jonskom obliku koji će mu omogućiti vezivanje supstrata i
Teorija : formiranje ES kompleksa
• Optimalna vrednost pH za većinu enzima iznosi između
4 i 8
• ali postoje i enzimi koji su najaktivniji u jako kiseloj ili
baznoj sredini
npr. optimalna vrednost pH za :
• pepsin iznosi 1,5-2;
• za amilazu 8,
• kiselu fosfatazu 5,
• arginazu 9,7

Praktični deo : Reagensi :

✔ 1 % rastvor skroba
✔ 0,1 M fosfatni pufer
(pH : 4,5; 6,2; 7; 8; 9; 11)
✔ Lugolov rastvor
Izvođenje :
 potrebno nam je 6 epruveta.
 u svaku od njih direktno iz bočice sipamo po 3 ml svih
vrednosti fosfatnih pufera i obeležimo te vrednosti na
epruvetama.
 zatim u svaku epruvetu dodamo po 2 ml 1 % rastvora skroba
i po 0,5 ml razblažene pljuvačke.
 epruvete promućkamo i ostavimo ih da stoje 15 min u
 vodenom kupatilu na 37 ° C.
 nakon inkubiranja epruvete rashladiti pod mlazom vode i u
svaku dodati po 3-4 kapi Lugolovog rastvora.
Zaključak :
 pri pH 8 skrob se razlaže do ahrodekstrina( koji je
bezbojan) jer je to optimalan pH za dejstvo ptijalina.
 u epruvetama sa pH 6,2 i 9 skrob je počeo da se razlaže do
amilodekstrina (ljubičasta boja)
 a pri pH od 4,5 i 11 skrob nije mogao da se razloži te su ove
epruvete ostale mastilo plave boje.

✔ 2. Aktivatori i inhibitori enzimskih reakcija

• To su supstance koje utiču na aktivnost enzima tako što se
vezuju za katalitičko mesto na enzimu menjajući njegovu
Teorija : konformaciju i omogućavaju lakše (aktivatori) ili teže
(inhibitori) vezivanje supstrata za aktivno mesto

A Aktivatori :
• to su supstance koje povećavaju aktivnost enzima
podela :
a) nespecifični (joni metala i nemetala)
b) specifični (joni H+ iz HCl-a, enterokinaza)

Aktivatori : Primeri :
• Amilaza se aktivira jonima nemetala VII grupe : Cl-,, Br- i J-
• Ksantin oksidazu aktivira metal Molibden
• Arginazu dvovalentni katjoni Mg 2+,, Mn2+,, Co2+
• Pepsinogen se aktivira jonima H+ iz HCl
• Tripsinogen se aktivira enterokinazom i prevodi se u tripsin
B Inhibitori :

• to su supstance koje u malim koncentracijama smanjuju

Inhibitori : aktivnost enzima

Podela :
• a) nespecifični - dovode do inaktivacije enzima (visoka T,
kissline, baze...)
• b) specifični - deluju samo na pojedinačne enzime i dele se
 na povratne i nepovratne inhibitore.
I Povratna inhibicija :
• u ovom slučaju nakon odvajanja inhibitora enzim može da
povrati svoju aktivnost.
II Nepovratna inhibicija :
• kod nje enzim ostaje neaktivan i nakon odstranjivanja
inhibitora.
• u nepovratne inhibitore spadaju :
• 1) organofosforna jedinjenja koja inhibiraju acetilholin
esterazu (npr. nervni gas sarin koji se koristio kao bojni
otrov)
• 2) respiratorni otrovi koji inhibiraju citohrom oksidazu
(CO, cijanidi, vodonik sulfid)
• 3) natrijum fluorid koji inhibira enolazu i Ca zavisne
enzime.
• Prema tipu inhibicije specifični enzimi se dele na :

1) kompetitivne
2) nekompetitivne
3) akompetitivne

• oblik povratne inhibicije pri kojoj se inhibitor vezuje za

aktivni centar enzima.
• izazivaju je supstance koje imaju sličnu građu kao supstrat
1) te mogu lako da zauzmu njegovo mesto.
kompetitivna • vezivanjem za aktivni centar ovi inhibitori stvaraju enzim-
inhibicija : inhibitor kompleks, blokiraju enzim i onemogućavaju njegovu
katalitičku aktivnost na supstrat.
• stepen inhibicije zavisi od odnosa koncentracije inhibitora i
supstrata.
• oblik nepovratne inhibicije kod koje se inhibitor vezuje za
2) alosterijski centar slobodnog enzima ili ES kompleksa
nekompetitivna • inhibitor i supstrat nisu slične strukture
inhibicija • porast koncentracije supstrata ne može da smanji stepen
inhibicije (kao kod npr. trovanja organofosfatima)
• se dešava prilikom vezivanja inhibitora za ES kompleks
• na taj način inhibitor sprečava razlaganje ES kompleksa i
3) akompetitivna obrazovanje produkta biohemijske reakcije
inhibicija : • porast koncentracije supstrata ne može da smanji stepen
inhibicije
 Praktični deo : Reagensi :
✔ 1 % rastvor skroba
✔ 1 % rastvor NaCl
✔ 1 % rastvor CuSO4
✔ Lugolov rastvor
✔ Destilovana voda
✔ Razblažena pljuvačka

Izvođenje :
 potrebne su nam 3 epruvete :

 u I sipamo 1 ml destilovane vode,

 u II 1 ml rastvora NaCl,
 a u III 1 ml rastvora CuSO4.

 zatim u sve epruvete dodajemo po 2 ml skroba i po 0,5 ml

razblažene pljuvačke.

 epruvete promućkamo i ostavimo ih da stoje 15 min u

vodenom kupatilu na 37° C .

 nakon toga ih rashladimo pod mlazom vode i u svaku od njih

dodajemo 2-3 kapi Lugolovog rastvora.
Zaključak :
➔ Razgradnja skroba pod dejstvom ptijalina se najbrže
odvijala u epruveti sa NaCl, jer je Cl- aktivator ovog enzima.
➔ U epruveti sa CuSO4 je usled prisustva jona Cu 2+ razlaganje
bilo usporeno jer su joni Cu2+ inhibitori amilaze.

✔ 3. Specifičnost dejstva enzima

Teorija : • Enzimi su biološki katalizatori i za razliku od neorganskih
pokazuju specifičnost dejstva.
• oni mogu da katalizuju određeni tip hem. r-je i omoguće
transformaciju jednog supstrata ili manjeg broja srodnih
jedinjenja.
• Postoje 2 vrste specifičnosti dejstva enzima koje određuje
apoenzim :
1. Specifičnost prema supstratu
 2. Specifičnost prema tipu hemijske r-je

1. Specifičnost prema supstratu može biti :

a) apsolutna specifičnost
b) grupna specifičnost
c) stereo-hemijska specifičnost

a) apsolutna specifičnost :
- kod enzima koji selektivno deluju SAMO na jedan određeni
supstrat (arginaza, katalaza, glukokinaza, ureaza, aminoacil t-RNK
sintaza)

b) grupna specifičnost :
- kod enzima koji katalizuju istovetan tip hemijskih reakcija u
jedinjenjima bliske strukture (pepsin, lipaze, fosfataze)

c) stereo-hemijska specifičnost :
- kod enzima koji deluju samo na određen tip stereoizomera
organskih jedinjenja (LDH razgrađuje samo L-mlečnu kiselinu,
malat dehidrohenaza L-jabučnu kiselinu, L-amino oksidaze samo L-
aminokiseline, D-amino oksidaze samo D-aminokiseline )
Praktični deo : Reagensi :

✔ 2 % rastvor saharoze
✔ 1 % rastvor skroba u 0,3 % NaCl
✔ Razblažena i profiltrirana pljuvačka
✔ Felingov rastvor I i II
 Izvođenje :

 Potrebne su nam 4 epruvete.

 U I i III stavljamo po 4 ml skroba,

 a u II i IV po 4 ml saharoze

 Zatim u I i II dodajemo po 2 ml pljuvačke,

 a u III i IV po 2 ml rastvora saharoze.

 Epruvete treba promešati i ostaviti 15 min u vodenom

kupatilu na 37 °C.

 Nakon toga sa sadržajem svake epruvete izvodimo Lugolovu i

Felingovu probu.
Zaključak : Dobijene rezultate analizirati prema sledećem
primeru :

Broj Supstrat Enzim Felingova Lugolova

epruvete proba proba
I Skrob Amilaza + -
II Saharoza Amilaza - -
III Skrob Saharaza - +
IV Saharoza Saharaza + -

✔ 4. Uticaj temperature na aktivnost enzima

Teorija : • veoma je izražen zbog proteinske prirode enzima
• optimalna T je ona na kojoj enzim ispoljava svoju
maksimalnu aktivnost
• za većinu enzima je to T od 37-38 °C
• sa povećanjem T se povećava i brzina hem. r-je, ali na
visokim T većina enzima gubi katalitičku aktivnost

• Toplotni koeficijent iznosi od 1,5 - 2 i predstavlja odnos

aktivnosti enzima na nekoj T, i aktivnosti enzima na T nižoj
za 10 °C.
 • Enzimi su termolabilni :
• Sa povećanjem T dolazi do nepovratnog gubitka aktivnosti
enzima, usled toplotne denaturacije koja u osnovi ima
promenu 2° i 3° strukture enzima.

• Sa smanjenjem T brzina hem. r-je reverzibilno (povratno)

opada
• Na T od 0° C enzim prestaje da deluje.
• Niže T (-25 - 0 °C) se koriste za čuvanje enzima.

U termostabilne enzime spadaju :

* LDH1
* Alkalna fosfataza iz placente
* Ribonukleaza
U termolabilne enzime spadaju :
* LDH5
* Alkalna fosfataza iz kostiju
Praktični deo : Reagensi :
✔ 0,5 % rastvor skroba u 0,3 % NaCl
✔ Lugolov rastvor
✔ 1,0 M H2SO4
Izvođenje :

 Potrebne su nam 4 epruvete.

 U svaku od njih dodajemo po 2 ml skroba.

 I epruvetu stavljamo u ključalo vodeno kupatilo,

 II i III u vodeno kupatilo na 37° C,
 A IV u led.

 Posle 10 minuta u I, II i IV epruvetu dodati po 0,5 ml

razblažene pljuvačke,
 a u III 0,5 ml PROKUVANE pljuvačke.

 Epruvete promućkati i ostaviti ih da i dalje stoje pod istim

uslovima.

 Nakon 2-3 min, s vremena na vreme uzimati po kap sadržaja

iz II epruvete i dodati 2-3 kapi Lugolovog rastvora.

 Zapaziće se nastajanje dekstrina (AMILOdekstrina,

ERITROdekstrina i AHROdekstrina)
  Kada se u toj epruveti završi razlaganje skroba pod uticajem
ptijalina (maltoza i maltotrioza) u sve epruvete dodati po 2
ml H2SO4.

 Zatim čekamo par minuta da se epruvete ohlade i u svaku

dodajemo 2-3 kapi Lugolovog rastvora.

Zaključak :
➔ Samo je u II epruveti, gde je enzim delovao pri približno
optimalnoj T (37 °C) došlo do razlaganja skroba, tj. sa
Lugolom se javlja žuta boja.

✔ 5. Dokazati proteolitičko dejstvo pepsina

Teorija : Pepsin
• Klasa : III klasa (hidrolaze)
• Grupa : proteaza

• Stvaranje pepsina :
Pepsin se stvara u glavnim ćelijama sluzokože želuca u vidu
neaktivne forme – pepsinogena, koja će se aktivirati pod
dejstvom HCl iz želudačnog soka.

• Struktura pepsina :
u njegovom aktivnom centru se nalaze dva ostatka
asparaginske kiseline.

• Uloga :
deluje kao endopeptidaza na peptidne veze koje se
formiraju između aromatičnih aminokiselina i dikarboksilnih
aminokiselina, pri čemu se kao rezultat dobija smeša
polipeptida.

• PH :
Za ostvarivanje reakcije neophodna je pH od 1,5 – 2,5.
Praktični deo : Reagensi :
✔ 0,2 % rastvor HCl
 ✔ 1 % rastvor Na2C03
✔ Ekstrakt želudačne sluzokože u 0,2 % rastvoru HCl
✔ Koagulisano belance

Izvođenje :

 Potrebne su nam 4 epruvete koje obeležavamo od I-IV.

 U svaku epruvetu stavljamo 1-2 kockice koagulisanog

belanca

 U prve tri epruvete dodajemo po 5 ml HCl,

 a u četvrtu 5 ml rastvora Na2C03.

 U epruvetu I i epruvetu IV dodajemo : 0,5 ekstrakta

želudačne sluzokože (pepsinogen)

 U epruvetu II : ne dodajemo ništa

 U epruvetu III : ekstrakt želudačne sluzokože (koji je

prethodno prokuvan na plameniku).

 Inkubiramo epruvete u vodenom kupatilu 30 min na 37C,

nakon čega sa sadržajem iz svake epruvete radimo Biuretsku
probu (dodajemo 1-2 ml 10 % NaOH i 10ak kapi CuSO4 u
svaku epruvetu).
 Pojava ljubičaste boje pokazuje prisustvo peptidnih veza i
da je proba pozitivna.
Zaključak :

➔ Biuretska proba je pozitivna samo sa sadržajem prve

epruvete - > ljubičasta boja, dok će ostale epruvete zadržati
plavu boju od CuS04 (plavi kamen).

✔ 6. Dokazati proteolitičko dejstvo tripsina

• Teorija : Tripsin
 • Klasa : III klasa (hidrolaze)
• Grupa : proteaza
• Podgrupa : endopeptidaze

• Formiranje tripsina :
Izlučuje ga pankreas u obliku proenzima – tripsinogena, koji
će se aktivirati u prisustvu enterokinaze, u slučaju kada
ponkreasni sok dospe u tanko crevo.

• Uloga : tripsin vrši ragradnju proteina u tankom crevu tako

što razlaže produkte peptidskog varenja do peptida.
Razlaže one peptidne veze u čijoj izgradnji učestvuju
diamino-monokarbonske kiseline, arginin i lizin, sa jednom
NH2 grupom, dok druga amino grupa mora da bude slobodna.

• PH :
Za vršenje njegove uloge neophodna je optimalna vrednost
pH 7,9 -8,6.
Reagensi :
Praktični deo : ✔ Rastvor Na2CO3
✔ 0,2 % HCl
✔ Neutralni ekstrakt pankreasa
✔ Neutralni ekstrakt crevne sluzokože
✔ Koagulisano belance
Izvođenje :

 Potrebne su nam 4 epruvete, koje obeležavamo 1-4.

 U svaku epruvetu stavljamo po 1-2 kockice koagulisanog

belanca.

 U prve tri epruvete sipamo 0,5 ml Na2CO3, a u poslednju 5

ml Hcl.

 U epruvetu 1 i epruvetu 4 dodamo : 0,5 ml ekstrakta

pankreasa (tripsinogen) i 0,5 ml ekstrakta crevne sluzokože
(enterokinaza)

 U epruvetu 2 : 0,5 ml ekstrakta pankreasa (bez

enterokinaze)

 U epruvetu 3 : 0,5 ml ekstrakta crevne sluzokože (bez

 tripsinogena)

 Epruvete mućkamo, i ostavljamo da stoje u vodenom kupatilu

30 min na 37C, nakon čega radimo biuretsku probu
(dodajemo u svaku epruvetu po 2 ml NaOH i 10ak kapi 0,25
% CuSO4).

 Biuretska proba je pozitivna samo ako u nekoj epruveti

uočimo ljubičastu boju.
Zaključak :
➔ Biuretska proba je pozitivna samo u prvoj epruveti. U
ostalim je negativna. ( u drugoj nedostaje enterokinaza, u
trećoj tripsinogen, a u četvrtoj nije odgovarajući pH)

✔ 7. Katalaza u životinjskom tkivu

Teorija : Katalaza
• Klasa : I klasa (oksidoreduktaze)
• Struktura : spada u hemohromoproteide; molekul katalaze je
tetramer sastavljen iz 4 subjedinice, a za svaku sibjedinicu
je vezan po jedan molekul hema sa trovalentnim gvožđem u
centru. Četiri molekula hema ulaze u aktivni centar ovog
enzima.
• Aktivnost : katalaza je najaktivnija u jetri, eritrocitima i
bubrezima, nešto manje u miokardu i vezivnom tkivu; na
ćelijskom nivou – u peroksizomima
• Biološka uloga :
Sastoji se u razlaganju toksičnog H2O2. Katalaza ima
sposobnost da redukuje samo H2O2, dok peroksidaze mogu
da redukuju i neke druge organske perokside.
• Kada katalaza deluje na H2O2, ona može da ispolji II tipa
enzimske aktivnosti : katalaznu & peroksidaznu aktivnost
(katalazna r-ja se odigrava pri visokim konc. H2O2, dok se u
niskom konc. H202, odigrava peroksidazni tip reakcije. )
Praktični deo : Reagensi :
✔ 3% rastvor H2O2
✔ sveže tkivo jetre
 Izvođenje :
 Potrebna nam je samo jedna epruveta u koju ćemo sipati
destilovanu vodu do pola i staviti komadić svežeg jetrinog
tkiva.
 Epruvetu zatim dopunjujemo do vrha H2O2, okrećemo
palcem naniže i stavljamo u čašu sa vodom.
Zaključak :
➔ Uočavamo da se oslobodio kiseonik iz H2O2 zbog prisustva
katalaze u svežem tkivu jetre.

✔ 8. Dokazati prisustvo ksantin oksidaze u mleku

Teorija : Ksantin oksidaza
• Klasa : I klasa (oksidoreduktaze)
• Grupa : flavin dehidrogenaza
• Struktura :
To je složeni proteid-enzim koji katalizuje oksidaciju
hipoksantina i ksantina u mokraćnu kiselinu.
• Rasprostranjenost : nalazi se u tkivima sisara, mleku i
bakterijama
• Mokraćna kiselina i njene soli (urati) su slabo rastvorljivi i
to predstavlja razlog njihovog povećanog taloženja koji se
manifestuje kao giht.
• Giht je oboljenje koje se manifestuje taloženjem kristala
prvenstveno u hrskavicama sitnih zglobova šake i stopala.
• Naslage urata se nazivaju tofi. Fagocitoza ovih kristala od
strane fagocita i leukocita izaziva zapaljensku r-ju → akutni
gihtički artritis (često prelazi u hroničnu formu).
• Ukoliko se tofi nađu u bubrezima → uratna nefropatija
Praktični deo : Reagensi :
✔ 0,40 % rastvor metilen plavog
✔ 0,4 % rastvor folmaldehida
✔ sveže nekuvano mleko
Izvođenje :
  Potrebne su nam 2 epruvete
 Prva epruveta : odmerimo 5-6 ml nekuvanog mleka
 Druga epruveta : 5-6 ml prokuvanog mleka (kuvamo na
lampici)
 U obe epruvete potom dodamo po 1,5 ml rastvora
folmaldehida i po jednu kap metilen plavog; mućkamo i
ostavljamo u vodeno kupatilo na 45C.
Zaključak :
➔ Prva epruveta (sa nekuvanim mlekom) : plava boja postepeno
nestaje, jer aldehid dehidrogenaza mleka oduzima sa
formaldehida 2 atoma vodonika i prenosi ih na metilensko
plavo, koje je u svom redukovanom stanju neobojeno (to je
njegova leuko forma).
➔ Ukoliko dođe do dužeg stajanja, vraća se plava forma, jer je
leuko forma autoksidabilna
➔ Druga epruveta (sa prokuvanim mlekom) – ne dolazi do
obezbojavanja metilenplavog, zato što se enzim kuvanjem
denaturiše.

✔ 9. Ispitati razgradnju skroba dejstvom dijastaze iz pankreasnog ekstrakta

Teorija : Skrob
- polisaharid biljnog porekla; predstavlja najvažniji izvor UH iz
hrane

Struktura :
Skrob čine dva polisaharida :
a. amilaza (15-20 %; čine jezgro skroba i ima
nerazgranatu strukturu sačinjenu od molekula glukoze vezanih alfa
1-4 glikozidnim vezama)
b. amilopektin (80-85 %; nalazi se oko amilaze, ima
razgranatu strukturu - 8-10 molekula glukoze je povezano alfa 1-4
glikozidnim vezama, a onda se obrazuju mesta grananja pri čemu se
stvara alfa 1-6 glikozidne veze)

Zastupljenost UH u hrani:
* 2/3 - skrob i ostali polisaharidi
* 1/3 - disaharidi (saharoza i laktoza)
* vrlo malo zastupljeni - monosaharidi

Hidroliza (razlaganje/razgradnja) oligosaharida iz skroba kao i

unetih disaharida :
- vrši se pod uticajem odgovarajućih enzima
 - enzimi koji razlažu oligosaharide iz skroba nalaze se u membrani
epitelnih ćelija intestinalne mukoze :
* maltAZA - razlaže maltOZU do monosaharida
* saharAZA - razlaže saharOZU do monosaharida
* laktAZA - razlaže laktOZU do monosaharida
(maltaza i saharaza su iz grupe alfa-glikozidaza, a saharaza iz
grupe alfa-glukozidaza)

Proces razgradnje:
- kada disaharid dođe u kontakt sa membranom ep. ćelije koje
sadrže maltazu, saharazu ili laktazu, najpre se oslobodi
monosaharid.
- monosaharid se dalje apsorbuje i transportuje putem krvi do
jetre, pi čemu se glukoza i glukoza transportuju aktivnim
transportom, a fruktoza procesom olakšane difuzije
- u jetri se vrši pretvaranje galaktoze i fruktoze u glukozu
* galaktoza & fruktoza --- > glukoza (u jetri)
- izvesna količina glukoze napušta jetru i odlazi u sistemsku
cirkulaciju i putem krvi se prenosi do svih ćelija
- glukoza u ćelije ulazi procesom olakšane difuzije i fosforiliše u
glukozo-6-fosfat (pod dejstvom heksokinaze)

Poenta fosforilizacije glukoze jeste zadržavanje glukoze unutar

ćelije, jer fosforilizacija glukoze ne može da prođe kroz ćelijsku
membranu.

Stepen razgradnje skroba možemo pratiti pomoću Lugolovog

rastvora (rastvor J u KJ).

Lugolova proba dokazuje prisustvo skroba;

Ukoliko je proba pozitivna - javlja se plava boja.

Niži polimeri skroba :

* amilodekstrini - boje se ljubičasto
* eritrodekstrini - crveno
* ahrodekstrini - bezbojni
Praktični deo : Reagensi :
✔ 1 % skrob
✔ Felingov reagens
✔ Lugolov rastvor
✔ Neutralan ekstrakt pankreasa
Izvođenje :
  Potrebne su nam 2 epruvete.
 U obe sipamo po 5 ml skroba.
 Epruveta 1 : dodamo 10ak kapi ekstrakta pankreasa
 Epruveta 2 : dodamo 10ak kapi prokuvanog pankreasa

 Epruvete inkubiramo na 37C.

 Radimo Lugolovu probu u epruveti 1 i dokazujemo nastajanje

dekstrina (plavo).
 Kada dobijemo ahrodekstirne (bezbojno), vadimo epruvete iz
kupatila.

 Epruveta 1 : radimo Felingovu probu (+/crveno)

 Epruveta 2 : delimo sadržaj i radimo Lugolovu i Felingovu
probu; obe probe su negativne Lugolova - (plava boja -/ jer
je dijastaza (amilaza u pankreasu) kuvanjem denaturisana i
nije razložila skrob)
 Felingova (-) - skrob ne pokazuje redukujuće osobine

✔ 10. Odrediti aktivnost amilaze u serumu po metodi Wohlgemuth-a

Teorija : Amilaza
Klasa : III klasa (hidrolaza; hidrolitički enzimi koji katalizuju
razgradnju skroba, glikogena, amiloze i amilopektina)
Podela :
* Alfa amilaza
* Beta amilaza
* Gama amilaza

Alfa amilaze
su endo amilaze; razlažu unutrašnje 1,4 veze u polisaharidima i pod
njihovim uticajem se molekuli skroba usitnjavaju, pa se stvaraju
međuprodukti – dekstrini.
Dekstrini se u prisustvu joda boje ili ljubičasto (amilodekstrin), ili
crveno (eritrodekstrin), ili se uopšte ne boje (bezbojni su –
ahrodekstrin).
Krajnji produkt delovanja Alfa amilaze na skrob : maltoza

B amilaza
– prisutna samo u biljkama

Gama amilaza
 je egzoamilaza; otcepljuje terminalne molekule glikoze od
polisaharida

pH (za alfa amilaze ) :

- optimalni pH – blizak neutralnoj vrednosti - 7
- postoje i kisele amilaze – pH 4,8 – 5,0
- neutralne – Ph 6,0 – 6,5

Alfa amilaze se kod čoveka najviše stvaraju u egzokrinom

pankreasu, pa se može smatrati markerom bolesti pankreasa.
U manjoj količini se nalazi i u : pljuvačnim žlezdama, jetri,
bubrezima, testisima, ovarijumu, plućima, masnom tkivu i mišićima.

Praktični deo :  Aktivnost amilaze se izražava u Volgemutovim jedinicama

(WJ).
 1 WJ = ona količina enzima, koja za 30 min na 37C razgradi 1
mg skroba, u prisustvu NaCl, do produkata koji sa J ne daju
nikakvu boju (ahrodekstrini).
 Normalne aktivnosti amilaze :
u serumu 2-32 WJ
u urinu 4-64 WJ

Princip :
➢ Određivanje aktivnosti amilaze se zasniva na sposobnosti
amilaze da razloži skrob;
➢ kao indikator se koristi J, pomoću koga se određuje stepen
razgradnje skroba

Reagensi :
✔ Puferisani rastvor NaCl
✔ 1 % rastvor skroba
✔ Lugolov rastvor

Izvođenje :
 Treba nam 9 epruveta (obeležavamo ih br. od 1-9) i u svaku
dodamo po 1 ml NaCl.
 Prva epruveta : dodajemo 1 ml seruma; dobro mućkamo i
 uzimamo 1 ml i prenosimo u drugu epruvetu
 Druga epruveta : dodajemo 1 ml iz prve epruvete, mućkamo,
uzimamo 1 ml i prenosimo ga u treću epruvetu
 Treća epruveta : isti postupak, sve do devete epruvete, iz
koje 1 ml sadržaja iz epruvete bacamo.
 Nakon toga u svih devet epruveta dodamo po 1 ml skroba i
stavimo ih u vodeno kupatilo na 37C da se inkubiraju 30 min.
 Posle inkubiranje hladimo epruvete i u svaku dodajemo po 2
kapi Lugolovog rastvora.
Zaključak :
➔ Aktivnost amilaze jednaka je razblaženju seruma u epruveti,
u kojoj je došlo do ljubičaste boje - prva epruveta, u njoj
se skrob razložio do amilodekstina.

✔ 11. Određivanje aktivnost sGPT i sGOT po metodi Reitman-Frankel-a

Teorija : Transaminaze
Ovi enzimi pripadaju II klasi enzima (transferazama) i katalizuju
r-ju prebacivanja amino grupe sa neke AMINO na neku KETO
kiselinu, pri čemu je to najčešće alfa-keto glutarna kiselina.
Njihov koenzim je : vitamin B6 (piridoksal fosfat)
Najpoznatije transaminaze su :
* Aspartat – transaminaza (AST, GOT)
* Alanin – transaminaza (ALT, GPT)

Zastupljenost: jetra, miokard, bubrezi i skeletni mišići

Klinički značaj: markeri oboljenja jetre i miokarda

✔ 12. Odrediti aktivnost alkalne i kisele fosfataze u serumu po Raabe-ovoj

metodi
Teorija : Fosfataza

a. Alkalna fosfataza
Klasa : III klasa (hidrolaza).
Grupa : fosfo-mono-esteraza
Uloga : razlaže monoestre fosforne kiseline (pri čemu se oslobađa
neorganski fosfat)
Vrednost optimalne Ph : 9,8 – 10,5
Rasprostranjenost : široko rasprostranjen enzim; nalazi se u svim
tkivima čoveka, najaktivniji u ćelijskoj membrani, a u manjoj
količini u GA i ER
Struktura : glikoproteid (složeni enzim); spada u enzime koji čine
sastavni deo ćelijske membrane
Zastupljenost u tkivima:
* proksimalni tubuli bubrega (najviše)
* sluznica creva
* placenta
* osteoblasti
* mlečna žlezda
* žučni kanalići
* plazma membrane epitelnih ćelija (velika količina)
Aktivnost :
Porast aktivnosti se zapaža u periodu rasta kod dece i u toku
trudnoće (fiziološki uslovi).

Dijagnostička vrednost :
Najveću dijagnostičku vrednost određivanje AF u serumu ima kod :
* oboljenja kostiju
* bolesti hepatobilijarnog sistema
Ipak, najveći porast aktivnosti AF će se sresti kod osoba sa
dugotrajnom žuticom, ili sa cirozom jetre.

b. Kisela fosfataza
Klasa : III klasa (hidrolaze)
Uloga : hidrolizuje monoestre fosforne kiseline; ima optimalnu Ph u
kiseloj sredini (otuda i poreklo naziva)
Rasprostranjenost : u svim tkivima čoveka; najveću aktivnost
ispoljava u kostima, jetri, bubrezima, ćelija mononuklearnog
fagoticnog sistema, prostati, plućima, mišićima, mlečnoj žlezdi i
koštanoj srži
KF je aktivna u leukocitima i trombocitima, ali najveću aktivnost
pokazuje u eritrocitima.. Najveći deo surmske KF potiče iz krvi, a
kod zdravih muškaraca i iz prostate.
Dijagnostika : KF ima najveću primenu kod postavljanja dijagnoze
karcinoma prostate sa metastazama u kostima
Kod ovog oboljenja, u serumu pacijenata nalazi se povišena
vrednost tartarat senzitivne KF (40-50, nekad i do 100 puta veća
vrednost).
 * tartarat senzitivna KF – može se naći i kod zapaljenja prostate
* tartarat rezistentna KF – prisutna u eritrocitima; značajna za
dijagnozu hemolitičkih anemija
Porast aktivnosti :
Ukupni porast aktivnosti KF (i tartarat senzitivne i tartarat
rezistentne) javlja se i kod : Pedžetove bolesti, Goušerove bolesti,
hiperparatireodizima i osteoporoze

✔ 16. Dokazati prisustvo šećera u mokraći po Benedikt-u i Feling-u

Teorija : • Glukoza je najzastupljeniji MONOSAHARID u prirodi.
• Mokraća zdravih ljudi NE SADRŽI glukozu.
• Filtriranje G se obavlja u glomerulima, a njeno
reapsorbovanje u promaksimalnim tubulima (aktivnim
transportom iz primarne mokraće).
• Tubularni transportni maksimum – max količina G koja može
da se reaprorbuje i za G iznosi 350 mg/min; kada nivo G u
primarnoj mokraći nadmaši ovu vrednosti, sav višak G će se
naći u mokraći → glukozurija (prisustvo G u mokraći)
• Glukozurija nastaje kada konc. G u krvi dostigne vrednost
od 8-8,5 mmol/l, što predstavlja bubrežni prag za glukozu.
• Glukozurija može biti :
a. Fiziološka (prolaznog karaktera, nakon obroka bogatog UH)
b. Patološka (kod oboljenja: šećerne bolesti, oboljenja hipofize –
akromegalija, gigantizam; Kušingov sindrom, renalni dijabetes )
Praktični deo : a. Felingova proba
Princip :
➢ u prisustvu aldehidne grupe šećera, uz zagrevanje i u baznoj
sredini, dvovalentni Cu iz CuSO4 može da se redukuje do
jednovaletnog bakra u Cu2O
➢ Felingovu probu daju svi redukujući šećeri, tako da ona nije
specifična samo za glukozu
Reagensi :
✔ Feling II
✔ Feling II
✔ Mokraća

Izvođenje :
 Najpre proveravamo ispravnost Felingovog reagensa :
uzimamo po 1-2 ml iz oba reagensa u istu epruvetu,
promešamo i zagrevamo do ključanja. Reagens je ispravan
ukoliko se održala plava boja, zatim u istu epruvetu
dodajemo 2-4 ml mokraće, promešamo je i ponovo zagrevamo

Zaključak :
➔ Ako je u mokraći prisutan šećer, javiće se žuta ili crvena
boja, uz kasnije obrazovanje cigla-crvenkastog taloga od
Cu2O

b. Benediktova proba
Princip :
➢ u baznoj sredini, pod uticajem G i uz zagrevanje dolazi do
redukcije Cu iz CuSO4 do Cu2O

Reagensi :
✔ Benediktov reagensa
✔ Mokraća

Izvođenje :
 U epruvetu sipati 5 ml Benediktovog rastvora i dodati 8 kapi
(0,5 ml) mokraće;
 smešu zagrevati na plamenu 1-2 minuta do ključanja, a zatim
je ostavljamo da se rasphladi.
 U zavisnosti od prisutne G, plava boja reagensa prilikom
zagrevanja prelazi u zelenu/žutu/crvenu, uz obrazovanje
taloga.

Zaključak :
➔ Ako u mokraći ima više od 0.3 % šećera – formira se izrazito
crveni talog, u suprotnom će se dobiti žut/zelen talog.
➔ Benediktova proba je semi kvantitivna proba, jer na osnovu
dobijene boje orijentaciono zaključujemo o količini šećera
koji se nalazi u mokraći.
➔ Ova proba je osetljivija od Felingove, jer se kod nje
redukcija dvovalentnog Cu odigrava samo pod uticajem G.