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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

DATOS DEL ALUMNO


Nombre del alumno IMATA CONDORI JUDITH ROSALUZ

Grupo “C” Turno Calificación : lunes 3:50-5:30 pm

AREQUIPA-PERÚ-2018
NIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE
AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal

AREQUIPA-PERÚ-2018

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PROLOGO

El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es indispensable para el


desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la
agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la


elaboración de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos
productivos con menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía
muchos menores.

Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que


puedan producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos
pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los
nuevos bioprocesos.

El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para su aplicación a


diversas disciplinas del saber humano. La presente Guía de Práctica de Microbiologia
Industrial se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento
sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo de Microorganismos en laboratorio
para estudiantes de Ingeniería Química.

Los Autores

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ÍNDICE

PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................................... 6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................................... 7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ......................................................................................12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS..............17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................................31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................................36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ...............................................................................48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……........................................................................................................................57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ...............................................................................................62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS ..................................................67
PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN
EN PLACA ..................................................................................................................................70
PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia ...............70
PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL.........................................................................................................70
PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium.....................................................................81
PRÁCTICA 14 : OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisae ................................................83
PRÁCTICA 15 : DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION FORMATIVA ..................86

FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES


PRÁCTICAS ............................................................................................................................................. 88
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................................... 102

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Recomendaciones Generales

1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no


se permitirá al acceso al laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla
completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán
ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse sentado
y en su equipo de trabajo.
8. Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a
realizar, si no entiende pregunte al profesor.
10. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica,
es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el
equipo.
11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la
flama del mechero, antes y después de su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con
fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo,
grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para
eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud.
17. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
18. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

6
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS

 Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio


 Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
 Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
 Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de
cada uno de ellas.
 Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD


Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido
corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro del
laboratorio
Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminación de una persona,
evitando la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por
ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados que se
interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por ejemplo guantes no evitan los
accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente

2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR


- Barreras de protección
- Lavado de manos
- Desinfección y esterilización.
- Manejo de objetos punzo cortantes.
- Manejo y eliminación de desechos
- Ventilación e iluminación adecuadas
- Limpieza y desinfección de ambientes

2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN


1. La boca
• Comer, beber y fumar en el laboratorio.
• Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección.
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2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados
(lápices, bolígrafos, etc.).

3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.

4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION


- Lavado de manos (antes y después)
- Guantes
- Mascarilla o barbijo
- Mandil
- Gorro

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD


• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en
el lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer
completamente cerrado.
• Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión
práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón:
– antes de realizar las actividades programadas
– antes de salir del laboratorio
– después de usar materiales contaminantes.
• Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.
• No comer, beber, fumar.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
• Usar mascarillas para casos indicados

2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de
onda de la luz usada.

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales

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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo

2. Parte óptica del Microscopio:


- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el
tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin
fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor
comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan
preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta que haga
“clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el
diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo
hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad
moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede
hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre
entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este
desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó
10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra
bajando el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el
descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el
tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los
mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico
para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo
macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie
de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del
siguiente aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el
tomillo micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe
manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la
lente frontal del objetivo.
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13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado
en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste
sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego,
continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la
gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen
solamente con el tomillo micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo
ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.

2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE


DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del
ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del
campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa.

Diámetro del campo microscópico


Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150

Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y


ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico,
concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir,
la tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga
deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del Microscopio, por lo que
debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando
que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe
desmontarse los objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio
después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol
isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje
óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la
luz.

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.

Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO

1) ¿Señale las partes de un microscopio óptico


2) ¿A qué se denomina campo óptico?
3) ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
4) ¿Qué es el poder de resolución
5) Explique qué tipos de aberraciones se presentan en las lentes del microscopio.
6) Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad.
7) ¿qué entiende por bioseguridad
8) Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
9) ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.
10) ¿Cómo promovería la cultura de bioseguridad?

V. OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

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PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS

1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.


2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES


Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la
atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión
de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y
un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo
interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas,
poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son
protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo
rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o
cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo
(Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza
lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado,
generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.

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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y
observe nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

Grafique la Observación y Resultados


spyrogyra

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diatomeas

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pulga daphnia

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Protozoario
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Alga del mar

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_______________________________________
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Crustacio

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_______________________________________
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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS


1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

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Hay 2 tipos de técnicas:
a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego
cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe
sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más
largo.

2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres
de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos.
EXAMEN EN FRESCO

Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos

Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero
fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.

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Grafique la Observación y Resultados

hongo

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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas
intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teñidas.

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de


metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes

Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar.
Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Grafique la Observación y Resultados

paramecium

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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS

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INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana
plasmática y una pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el
citoplasma. Además carecen de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas membranas llamadas
tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la
energía de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).

OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio óptico

Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)

Procedimiento Experimental

1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.


2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado.
3.Agregar una gota de agua
4.Colocar el cubreobjetos.
5.Observar al microscopio.
6.Dibujar lo observado indicando aumentos.
7.Indicar las diferentes estructuras observadas.

Grafique la Observación y Resultados


Cianobacterias( nostoc)

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