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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN

DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

DATOS DEL ALUMNO


Nombre del alumno IMATA CONDORI JUDITH ROSALUZ

Grupo “C” Turno Calificación : lunes 3:50-5:30 pm

AREQUIPA-PERÚ-2018
NIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE
AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal

AREQUIPA-PERÚ-2018

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PROLOGO

El Campo de la Microbiología en toda su magnitud es indispensable para el


desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura
y para el ilimitado campo de los bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la


elaboración de infinidad de productos útiles al hombre, en la generación de procesos
productivos con menor contaminación del medio ambiente y con consumos de energía
muchos menores.

Los microorganismos son objetos de manipulaciones genéticas para que puedan


producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar
Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos
bioprocesos.

El conocimiento de la microbiología se hace imperioso para su aplicación a


diversas disciplinas del saber humano. La presente Guía de Práctica de Microbiologia
Industrial se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento
sistematizado sobre las técnicas básicas del manejo de Microorganismos en laboratorio
para estudiantes de Ingeniería Química.

Los Autores

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ÍNDICE

PROLOGO
ÍNDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES… ................................................................................................... 6
PRÁCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7
PRÁCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRÁCTICA 3 : PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRÁCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIÓN ............................................................................................ 31
PRÁCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRÁCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRÁCTICA 7 : CARACTERÍSTICAS CULTURALES: MORFOLOGÍA DE
COLONIAS……........................................................................................................ 57
PRÁCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRÁCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CÉLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRÁCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRÁCTICA 11 : OBTENCIÓN DE ÁCIDO ALGÍNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRÁCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS DE
INTERÉS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRÁCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRÁCTICA 14 : OBTENCION DE ALCOHOL POR Sacharomyces cerevisae ................................ 83
PRÁCTICA 15 : DESARROLLO DE TRABAJOS DE INVESTIGACION FORMATIVA .. 86

FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES


PRÁCTICAS ................................................................................................................................ 88
BIBLIOGRAFÍA .........................................................................................................................102

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Recomendaciones Generales

1. La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo, no


se permitirá al acceso al laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla
completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas deberán
ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse sentado y
en su equipo de trabajo.
8. Hablar sólo lo necesario con los compañeros.
9. Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar,
si no entiende pregunte al profesor.
10. Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es
necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá para todo el
equipo.
11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la
flama del mechero, antes y después de su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con fenol
o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo,
grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16. Después de la incubación es necesario la esterilización del material para eliminar
microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud.
17. Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
18. Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

6
PRÁCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS

 Aprender las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio


 Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
 Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
 Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de cada
uno de ellas.
 Dominar el mecanismo de iluminación, la observación de una muestra con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad física, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biológicos físicos, psicológicos y mecánicos.

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD


Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido
corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se está dentro del laboratorio
Precauciones estándar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminación de una persona,
evitando la exposición directa a sangre y otros fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, por
ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilización de materiales adecuados que se
interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras por ejemplo guantes no evitan los
accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente

2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR


- Barreras de protección
- Lavado de manos
- Desinfección y esterilización.
- Manejo de objetos punzo cortantes.
- Manejo y eliminación de desechos
- Ventilación e iluminación adecuadas
- Limpieza y desinfección de ambientes

2.1.3 VÍAS DE CONTAMINACIÓN


1. La boca
• Comer, beber y fumar en el laboratorio.
• Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningún tipo de protección.

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2. La piel
• Cortaduras o rasguños.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos o utensilios contaminados
(lápices, bolígrafos, etc.).

3. Los ojos
• Salpicaduras de materiales infecciosos.
• Transferencia indirecta de microorganismos a través de los dedos contaminados.

4. Los pulmones
• Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION


- Lavado de manos (antes y después)
- Guantes
- Mascarilla o barbijo
- Mandil
- Gorro

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD


• Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el
lugar que se les indique para tal fin.
• Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente
cerrado.
• Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión
práctica.
• Lavar las manos con agua y jabón:
– antes de realizar las actividades programadas
– antes de salir del laboratorio
– después de usar materiales contaminantes.
• Recoger el cabello largo.
• Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable.
• No comer, beber, fumar.
• Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.
• Usar mascarillas para casos indicados

2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolución de un microscopio está en relación inversa a la longitud de onda
de la luz usada.

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecánica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revólver
- Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido
- Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales

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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo

2. Parte óptica del Microscopio:


- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes características:
o Magnificación: Ej. x 25
o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el
tornillo micrométrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga
Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor
comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan
preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta que haga
“clik”.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el
diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo
hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano.
8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad
moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede
hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre
el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento
se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó
10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando
el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el descenso
del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo
macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los
mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico
para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo
macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie
de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente
aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo
micrométrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse
con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la lente frontal
del objetivo.
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13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado
en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector
de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe
girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje
en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo
micrométrico.
Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo
ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol.

2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CÁLCULO APROXIMADO DE


DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del
ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del campo
microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa.

Diámetro del campo microscópico


Diámetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150

Ejemplo: Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y


ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico,
concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga
deteriora el tomillo micrométrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte más delicada del Microscopio, por lo que debe
tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la
lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los
objetivos.
El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio
después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol
isopropílico o metanol.
3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje
óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la
luz.

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.

Observe las diferencias en el campo óptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO

1) ¿Señale las partes de un microscopio óptico


2) ¿A qué se denomina campo óptico?
3) ¿Por qué decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
4) ¿Qué es el poder de resolución
5) Explique qué tipos de aberraciones se presentan en las lentes del microscopio.
6) Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad.
7) ¿qué entiende por bioseguridad
8) Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
9) ¿qué barreras de protección debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.
10) ¿Cómo promovería la cultura de bioseguridad?

V. OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

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PRÁCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS

1) Conocer la morfología de organismos unicelulares.


2) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

II. OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES


Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal.
2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la
atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión de
la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y
un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo
interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas,
poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son
protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo
rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas.
- También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o
cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo
(Protozoario flagelado).
- La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza
lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo.
- También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado,
generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.

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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe
nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

Grafique la Observación y Resultados

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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Hay 2 tipos de técnicas:


a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”.
Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego
cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparación con vaselina alrededor de la excavación.
La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres
de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos.
EXAMEN EN FRESCO

Material
- Microscopio
- Láminas cubreobjetos
- Láminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos

Metodología
- Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero
fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensión y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.

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Grafique la Observación y Resultados

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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas
intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teñidas.

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de


metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes

Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o sólida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Grafique la Observación y Resultados

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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
células eucarióticas. Así, el citoplasma de las procarióticas está rodeado por una membrana
plasmática y una pared celular (como en las células vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, núcleo diferenciado. Las moléculas de ADN están en contacto directo con el
citoplasma. Además carecen de mitocondrias, retículo endoplasmático, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las células procarióticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, sí contienen numerosas membranas llamadas
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tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintéticos que utilizan para captar la energía
de la luz solar y sintetizar azúcares (fotosíntesis).

OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio óptico

Materiales:
Muestra biológicca: Nosstoc (murmunta hidratada)

Procedimiento Experimental

1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.


2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado.
3.Agregar una gota de agua
4.Colocar el cubreobjetos.
5.Observar al microscopio.
6.Dibujar lo observado indicando aumentos.
7.Indicar las diferentes estructuras observadas.

Grafique la Observación y Resultados

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V. CUESTIONARIO

- ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?


- ¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?
- ¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?
- Que tipos de células son las bacterias y cianobacterias.
- Que estructuras comunes presentan las cianobacterias
- Cuál es la importancia ecológica de las cianobacterias
- Que problemas causas la presencia de cianobacterias en plantas de potabilización de agua.
- Por qué los arroceros fomentan el crecimiento de Azolla carolininiana en los cultivos de arroz?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

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PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

I. OBJETIVOS

- Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración.
- Distinguir las características macroscópicas y las estructuras microscópicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las características macroscópicas y microscópicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicación de los géneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.

II. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice
de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en
cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por
otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del
compuesto.

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150  m y 0.500  m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8  m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las
células de cultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida principalmente


por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptídicos.
Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos, polímeros
de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como
la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.

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GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antígeno o somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075  m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS


Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de
muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son:

a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos.


Producto líquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y
seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio sólido. Puede prepararse una suspensión del material en una gota de
solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de
platino.

b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo más próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de
los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran
número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales
de fijación son: por el calor y alcohol en frío.

d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

f. Secado. Se secará la preparación al aire.

CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES


La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos presentes.

a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no
índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o
catiónica.
 Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear
de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
 Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras
citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico.
 Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright,
Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
 Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudán III.

CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología
y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina.

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b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram,
Tinción ácido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto


estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas,
Tinción de corpúsculos metacromáticos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIÓN DE UN FROTIS


BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparación del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente
arriba de la porción azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posición vertical como
sea posible. Déjela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porción de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posición plana
en la superficie del líquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplánese ligeramente en el centro de éste (el
portaobjeto deberá estar numerado).
- Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjeto muévala trazando una espiral del
centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados
del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que esté al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que
se encuentren en ella.

Fijación
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a través de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción.

3.2. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Azul de metileno (solución acuosa al 1%),


Safranina (solución acuosa 1%), Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.

TINCIÓN DE AZUL DE METILENO


Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con él esa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
19
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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TINCIÓN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento
- Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis.
- Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino,
Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión.

TINCIÓN GRAM
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido
a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta,
aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden
la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante
secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han
perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Reactivos
- Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) ó Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)

Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tinción.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos más o menos. También puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar más tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión.

Grafique la Observación y Resultados

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MARCO TEORICO : TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS

Características morfológicas del hongo: tamaño y forma de las cabezas conidiales, Morfología de los
conidióforos, fiàlides y metulas, y en la presencia de células de Hulle y de esclerocios. En la siguiente
figura se muestra las principales estructuras morfológicas del género Aspergillus:

B. APLICACIONES INDUSTRIALES

En la producción de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:


ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente
para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fúngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del páncreas.

En la producción de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.

INVERTASA O SACARASA.
22
Origen y acción'. La hidrólisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azúcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.

La aplicación de enzimas en los detergentes


Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a
bajas temperaturas y períodos más cortos de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actúan sobre los materiales que constituyen
las manchas, facilitando la remoción de estos materiales y de forma más efectiva que los detergentes
convencionales.

• Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lípidos para romperlos por hidrólisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lípidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrólisis sólo
ocurre en la interfase entre la gota lipídica y la fase acuosa, lo que causa que la reacción sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remoción de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinación de búsqueda y manipulación genética
ha conducido a la introducción reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logró producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extracción de


aceite. El uso de algunos preparados celulolíticos en el proceso de extracción ha tenido un efecto
positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimático
producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extracción del aceite de soya. En condiciones
óptimas, el contenido de aceite de soya extraíble (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperación
del aceite de soya (99 %).

El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extracción
de aceite a partir de las semillas de ajonjolí, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extraído fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjolí, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %

Extracción de colorantes. La extracción de colorantes es otra aplicación atribuida a algunos


preparados enzimáticos.
Extracción de antioxidantes con preparados enzimáticos con actividades mixtasmixtas
El preparado enzimático comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente
pectinasa, pero ambién celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no sólo fue efectivo al
aumentar la extracción de los fenoles debido a la degradación de los polisacáridos
(celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que
mejoró también la actividad antioxidante de los extractos fenólicos

2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fíales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.

23
La ramificación es una característica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante. Olor
aromático, especiado o afrutado (a manzanao a pina).

ECOLOGIA
El Penicillium es género grande y difícil encontrado casi por todas partes, y generalmente el género más
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia común de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo doméstico, en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la cola empleada
para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las máximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las áreas urbanas
que en las rurales).

APLICACIONES DEL PENICILLLIUM


Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales
como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son
absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming producía 2 mg de penicilina por cada litro de
cultivo, posteriormente se encontró que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se
eligió a Penicillium chrysogenum como cepa súper productora de este antibiótico. Finalmente, la
selección de sucesivos mutantes súper productores y la mejora en las técnicas de fermentación realizadas
por la industria biotecnológica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea
en la producción de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.

Incluye las siguientes especies:


 Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie.
> Penicillium candida, ídem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistémica emergente que afecta a roedores y
humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.
> Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y
recientemente también gorgonzola

3. RHYZOPUS

Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehículo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rápida. En ciertas especies son patógeno de

24
la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la producción del tempeh, un alimento fermentado
derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son genético idénticos a su padre, los
zygospores se producen después de que dos mycelia se fundan durante la reproducción sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser genético diferentes de sus padres.

EL GÉNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.

EL GÉNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razón por la cual invaden rápidamente los medios de cultivo. En este Género
los esporangióforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.

EL GENERO ABSIDIA
Los esporangióforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.

APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia económica, síntesis de productos industriales: producción de ácidos láctico, cítrico,
succínico, oxálico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe

Mucor racemosus: Se presenta en dos formas según el medio en que se desarrolle. Una forma típica o
filamentosa, en medios sólidos y otra forma atípica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios líquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentación de mostos
azucarados, en cambio, la forma típica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidón posteriormente y posteriormente fermenta los azúcares formados
en la hidrólisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentación alcohólica. Esto es en síntesis
lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma típica se emplea para la fabricación de
amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amilolítico, puede hidrolizar el almidón y producir
etanol, pero en menor proporción que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentación alcohólica, en cambio, en los últimos años se

25
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

A. MATERIAL

 Asa de kolle  Láminas portaobjetos


 Mechero  Láminas cubreobjetos
 Azul de lactofenol  Microscopio

B. MATERIAL BIOLOGICO
 Muestras de alimentos con hongos
 Cultivo de Aspergillus niger
 Cultivo de Penicillium

C. REACTIVOS

C.1. Azul de lactofenol.


Fenol 20 g Glicerol 40 ml
Ácido láctico 20 g Agua destilada 20 ml

Disolver los componentes antes mencionados y después se agrega el colorante.


Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodón 0.05g
Azul de metileno 0.05 g
Azul de cotton de Perrier 0.05 g

2. CULTIVOS

Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.


Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rápido crecimiento, son vellosas o
algodonosas y empujan la tapa de la placa Petri. Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrón o
negro con la madurez a medida que se forman esporas.

2.1. AGAR SABOURAUD

A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a
infecciones dermatológicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que
pueden estar presentes en la muestra.

B. COMPOSICION

C. PREPARACION

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I. RESULTADOS

A. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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 
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B. ASPERGILLUS FUMIGATUS

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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 
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C. ASPEGILLUS FLAVUS

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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..................................................................................... .....................................................................................
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 
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D. PENICILLIUM

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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..................................................................................... .....................................................................................
..................................................................................... .....................................................................................
..................................................................................... .....................................................................................
 
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a. RHYZOPUS

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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........................................................................................................ ........................................................................................................
........................................................................................................ ........................................................................................................
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b. MUCOR

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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........................................................................................................ ........................................................................................................
........................................................................................................ ........................................................................................................
........................................................................................................ ........................................................................................................
c. ABSIDIA

Caracteres Macroscópicos Caracteres Microscópicos


 
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........................................................................................................ ........................................................................................................
........................................................................................................ ........................................................................................................
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V. CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades?

2. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?


3. ¿De qué manera influye el pH en la coloración?
4. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las bacterias?
5. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
6. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
7. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique
la función que cumple cada uno de ellos.
8. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique
la función que cumple cada uno de ellos.
9. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
10. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
11. Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.
12. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos grampositivos, bacilos,
grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

CUESTIONARIO: TINCIÓN Y MORFOLOGÍA DE HONGOS


1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el género Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscópicas y microscópicas)?
4. Cómo diferencia el género Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
7. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
8. Mencione Ud. Cuáles son las características macroscópicas del Penicillium?
9. Cuáles son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
10. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
11. Indique Ud. Cuáles son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una
Absidia?
12. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

30
PRÁCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN

I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y
equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico.

3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los


alimentos.

II. MARCO TEÓRICO


El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el
control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.

2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la


esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio
y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.

En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere


más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.

Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC


durante 1 hora.

31
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.

2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran
húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre
la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de
cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática,
como resultado de activación o liberación de una nucleasa.

El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de


pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y
aparentemente es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el
tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad
de las células expuestas a temperaturas elevadas.

a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.

b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.

c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes


resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:

♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

2.3 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

32
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método
presenta muchas dificultades técnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO


- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri
- Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodón, gasa, tijeras
- Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente
- Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a) Preparación de tubos matraces

- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono
truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparación.

b) Preparación para proteger las pipetas


- En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de
una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos,
en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver
toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal
de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
- Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización.

c) Preparación de las placas Petri


33
- Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro,
se envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta
alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose
con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de
regalo.

4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.

a) Procedimiento para la esterilización en horno


- Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
- Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60
minutos más.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del
horno.
- El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el
color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el
papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado.

4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

a) Procedimiento para la esterilización con autoclave


- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el
agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden
añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen
al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su
surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo
demasiado.
- Abrir la válvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta
que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido
expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del
autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para
conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para
igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los
utensilios estériles.

34
V. CUESTIONARIO

1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?

2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiológico, por qué?

3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.

4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.

5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

35
PRÁCTICA
MEDIOS DE CULTIVO

I. OBJETIVOS

a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO

2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo.

2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS

A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o
disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón.
Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium.
Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran
número de componentes hidrocarbonados diferentes.

B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como proteínas completas, que sería el caso de la gelatina o incluso proteínas
aún más complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o
polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que
están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne.
La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También
es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
36
La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos
gérmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio,
aminoácidos, etc.

2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MICROROGANISMOS

A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.

B. FUENTE DE FÓSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato.

C. IONES METÁLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración
pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.

D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por sí solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo
de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.

E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metabólicos.
Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.

37
Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas
bioquímicas de las bacterias.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:


Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias
Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir
el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las
Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentración de sales biliares y citrato de sodio,
inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.

2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO


Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.
- Unas condiciones físico-químicas apropiadas. De acuerdo con ello, habría que considerar:
A. TEMPERATURA ÓPTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorías siguientes en función de los
rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrófilos crecen bien a 0ºC y tienen una temperatura óptima o inferior, la máxima es de 20ºC.
Se aíslan del Ártico y Antártico. Pueden crecer a 0ºC, aunque su temperatura óptima sea 20 a 30ºC
y la máxima de casi 35ºC. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefacción de alimentos
refrigerados.
- Los Mesófilos, crecen a una temperatura óptima de 20 a 45ºC, siendo la mínima de 15 a 20ºC y la
máxima de casi 45ºC. La mayoría de los microorganismos pertenecen a esta categoría. Las bacterias
patógenas para el hombre suelen crecer a una temperatura óptima de 37ºC.
- Los termófilos, pueden crecer a una temperatura de 55ºC o superiores. La temperatura mínima es
normalmente de 45ºC y la óptima es de 55 a 65ºC. Microorganismos que crecen en fardos de heno,
tuberías de agua caliente, aguas termales.
- Los Hipertermófilos, temperatura óptima de entre 80ºC y casi 113ºC, no crecen por debajo de
55ºC. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO


Temperaturas cardinales (ºC)
Microorganismo
Mínima Óptima Máxima
Bacillus psichrophilus -10 23-24 28-30
Microcococcus cryophilus -4 10 24
Pseudomona fluorescens 4 25-30 40
Staphylococcus aureus 6.5 30-37 46
Enterococcus faecalis 0 37 44
Escherichia coli 10 37 45
Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38
Thermoplasma acidophilum 45 59 62
Bacillus stearthermophilus 30 60-65 75
Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85
Pyrococcus abyssi 67 96 102
Pyrodictium occultum 82 105 110
Pvrolobus fumarii 90 106 113
Candida scotti 0 4-15 15
Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40
Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua.
38
En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier
método de deshidratación, sea un buen medio de conservación.

C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento.
- Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos.
La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras.
El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la
fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la
bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los límites fisiológicos.

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Límite Límite
Microorganismo pH óptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5

D. PRESIÓN OSMÓTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es
debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa.
En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sódico; Ej: Staphylococus.
Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).

Actividad del Agua Ambiente Microorganismo

39
1.00 (agua pura) Sangre Mayoría de Gramnegativos
no halófilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamón Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada

E. CONCENTRACION DE OXÍGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia
y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno.

2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y según criterios se podrían dividir en:

2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA

A. MEDIOS SÓLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y
visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios
específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias.

B. MEDIOS LÍQUIDOS
También denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos
bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos
lácticos, etc.
40
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISÓLIDOS
Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles
para algunas pruebas bioquímicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.

2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN

A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO


Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, según sea
su composición, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de los componentes básicos,
uno o varios elementos, como por ejemplo caseína soja, triptófano, etc., que facilitan el crecimiento
de algún tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo
que buscamos.

A.2. MEDIOS SELECTIVOS


Son medios en cuya composición presentan componentes que impiden el crecimiento de algún tipo
bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composición sales biliares, citrato de sodio y el verde
brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es
decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es más
característico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van
a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y específica, es decir, diferencial; por
ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composición eosina y azul de metileno que
inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento
de la enterobacterias, que según utilicen o no la lactosa darán lugar a una coloración característica
para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con fines de aislamiento e
identificación.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y
Sacarosa, además si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminoácido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única
fuente de carbono.

B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL


Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias.
Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales y agua.
Dentro de los medios generales más empleados tendríamos el caldo común, que está compuesto por
extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sódico y agua.

41
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.

2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN


A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTÉTICOS
C. MEDIOS SINTÉTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS

2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIÓN


A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SÓLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SÓLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LÍQUIDOS EN TUBO

III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.

e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACIÓN
- Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que está indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después
incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al
conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos.

4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121ºC.

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4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la
posición deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
 Agar nutritivo
 Agar Mac Conkey
 Agar EMB
 Agar Sabouraud
o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
 Agar TSI
 Agar LIA
o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
 Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)
 Agar SIM

4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de
conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.

4.5. COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS


UTILIZADOS

AGAR NUTRITIVO
Composición
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparación

Pesar 2,3 gramos de agar nutritivo y enrasar a 1000ml con agua destilada.

AGAR MAC CONKEY


Composición
Peptona de caseína 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.
Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g
Agar – Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
AGAR TSI
Composición
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
43
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml

Preparación

6.5 gramos de TSI y diluir a 25 m.

MEDIO EMB.

Composición
Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml

Preparación

Se pesa 3.6 gramos de EMB y diluir a 100 ml.

OBSERVACIONES

 Pesado de los sustratos:

44
 Dilución de los medios de cultivo:

 Rehidratar ( casi punto de ebullición):

45
 Esterilización:

 Repartición de los medios cultivos preparados:

46
AGAR TSI

AGAR LIA

SIMONS

SIM
47
MC

AN

EM

48
CONCLUSIONES

49
50