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PRACTICA N° 1
(riesgo individual Eficaces y el riesgo de propagación es limitado, se puede
moderado, riego contaminar con microorganismos que producen enfermedades
poblacional reversibles.
bajo)
A.- BIOSEGURIDAD
Es el conjunto de medidas preventivas de uso común, que tienen el objetivo de proteger
la salud frente a diferentes riesgos producidos por bacterias, parásitos, hongos, agentes
físicos mecánicos y químicos. Lo más importante que se debe practicar en el laboratorio
de Microbiología son los siguientes:
LAVADO DE MANOS. Antes de iniciar y terminar los procedimientos y cada vez que se
contaminen con sangre y otros fluidos corporales, lavarse y cepillarse fuertemente las
manos y antebrazos con un cepillo – esponja que no lastime.
USO DE GUANTES DE BIOSEGURIDA. Para todos los procedimientos analíticos se
debe utilizar guantes de bioseguridad y antes de quitarse de las manos debe lavarse
con hipoclorito al 10% por 5 minutos y luego sacarse los guantes, después de quitarse
los guantes debe lavarse las manos nuevamente.
BARBIJO Y PROTECCION OCULAR. Es necesario utilizar el barbijo y lente de
protección ocular, cuando se realice procedimientos con sangre y fluidos biológicos, ya
que los procedimientos pueden generar gotitas de sangre u otros líquidos corporales
para prevenir la exposición de la mucosa, la boca, nariz y ojos se debe utilizar lentes y
barbijo. Es recomendable utilizar barbijo y protección ocular descartable en caso de ser
de tela debe colocarse en una bolsa reja para su incineración.
PREVENIR LESIONES. Debe usarse cuidadosamente elementos cortantes, tanto
cuando se usan como cuando se limpian o descartan. Se recomienda utilizar elementos
descartables, preferible no hacerse heridas.
INSTRUCCIONES PARA EL DESCRATE DE ELMENTOS CORTANTES DE
CUALQUIER TIPO. Deben descartarse en recipientes contenedores rígidos, resistentes
y seguros para su futuro transporte. Una vez llenos los contenedores se tapan
herméticamente y se envían a incinerar.
OBJETIVO.-
Familiarizar, con el conocimiento y aprendizaje de las medidas de bioseguridad para no
contaminarse ni contaminar a los demás.
Como estudiantes de esta disciplina, es importante conocer los principios básicos de
seguridad en el trabajo con microorganismos, considerando los peligros relativos que
implican su manejo. De acuerdo con el potencial que tienen los microorganismos para
infectar al ser humano y los animales, se les ha clasificado en grupos de riesgo, que se
presentan en la Tabla 1
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Microbiología General. - Facultad de ciencias biológicas –UNA Puno
TABLA 1 :
GRUPO DE RIESGO Consecuencias
Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades de
(riesgo individual y poblacional provocar enfermedades en el ser humano o animales.
escaso o nulo)
Grupo de riesgo 2 La exposición en el laboratorio puede provocar una
infección grave, pero existen medidas preventivas y
terapéuticas
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la bioseguridad, de cuantos niveles consta y que características posee cada
uno de estos
niveles?.................................................................................................................................
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2. Mencione las diferencias entre un laboratorio de microbiología y un laboratorio
convencional………………………………………………………………………………………
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3. Mencione los pasos a seguir cuando un cultivo liquido bacteria no se derrama
sobre una
superficie……………………………………………………………………………………………
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4. ¿Cuáles son los riegos y problemáticas en el grupo que se tendrán al no seguir
las indicaciones
recomendadas?...................................................................................................
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OBJETIVOS:
GENERALIDADES
La microbiología como ciencia maneja una gama de materiales, por eso es importante
realizar un reconocimiento del Laboratorio de Microbiología, debido a que maneja
equipos, materiales, reactivos y medios de cultivo especiales que son diferentes a un
laboratorio convencional, áreas que esta ocupa son: recepción de muestras,
preparación de materiales plaqueos, cultivo de microorganismos, microscopia lecturas,
así mismo la ubicación de los equipos como son la incubadora, autoclave, microscopio,
mechero de bunsen, esterilizador al seco o mufla y otros.
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EL MICROSCOPIO
DIBUJE EL MICROSCOPIO Y COLOQUE SUS PARTES:
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EQUIPOS USO
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PRACTICA N°2
PREPARACION DE MATERIALES Y METODOS DE ESTERILIZACION
Objetivos:
1. Que el alumno conozca los principios generales de la preparación y técnicas de
esterilización de diversos materiales y medios de cultivo de uso común de
Microbiología.
INTRODUCCION
La esterilizaciones un método de eliminación total de todo tipo de organismo que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente
o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones,
resultados erróneos o pérdida del material biológico.
La esterilización por el calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor
frecuencia en el laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los
microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de
un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Los procesos con calor húmedo
afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas se aplican para esterilizar
medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos
que se desechan.
El equipo de uso común es el autoclave que se utiliza vapor de agua la presión (15 lb /
presn); con esta presión el material alcanza una temperatura de 121° C y si se mantiene
durante 15 minutos se asegura la inactivación de endosporas, que son las estructuras
bacterianas más resistentes al calor.
Las formas de esterilización, se aplica de acuerdo el tipo de material que se va a
esterilizar los diversos métodos de esterilización se divide en:
1) Métodos físicos, halógenos, detergentes, entre otros.
2) Métodos químicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o bacteriostáticas
como son alcoholes, fenoles, halógenos, detergentes, entre otros.
La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar así
como la finalidad que se persiga. L a esterilización se realiza por tres métodos.
a) Calor Húmedo o vapor
b) Calor Seco
c) Calor Directo, calor, inmediata
a) Calor húmedo.-Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace
por el vapor a presión en una autoclave a 15 lb de presión, 121 °F por 15 minutos.
b) Calor Seco.-La esterilización se hace por medio de un horno denominado
esterilizador o mufla que permite alcanzar temperaturas más elevadas (150-180°C)se
utiliza más para la esterilización de material de vidrio (matraces,pipetas,cajas de
petri,etc) y en los instrumentos. La esterilización se efectúa directamente en la flama
del mechero.
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PRACTICA Nº3
METODOS DE COLORACION Y MORFOLOGIA BACTERIANA
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A. METODOS DE COLORACION
OBJETIVO
1. Preparar y analizar los diferentes métodos de coloración para la visualización de
microorganismos que permitan establecer diferencias morfológicas y estructurales entre
y dentro de los microorganismos.
2. El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación por los métodos de
coloración al microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo y leer.
GENERALIDADES
Las bacterias no tienen coloración, porque no tienen color, pero sin embargo si se
pueden observar con las coloraciones utilizados en microbiología, como son las
coloraciones simples diferenciales y especiales o compuestas. Así tenemos la más
utilizada en microbiología, es la tinción de Gram, en la cual se puede diferenciar en dos
grandes grupos. Según lo implementara en el siglo XVIII el bacteriólogo danés Christian
Gram, los microorganismos Gram positivos se tiñen de violeta, y los bacilos se tiñen de
rojo y se dice que son gramnegativo.
La tinción se fundamenta con el espesor de la pared celular (capas de péptidoglucano),
aunque no existe un componente único de esa pared que puede explicarla. La tinción
de Gram permite así mismo controlar la contaminación, por observación de una
homogeneidad morfológica y tintorial.
Otro método de coloración de bacterias es la coloración de Ziehl-Neelsen algunos
microorganismos son lipofilicos y difíciles de teñir (genero Mycobacterium y
Nocardia), pero una vez teñidos son resistentes a la decoloración, como característica
se tiñen de rojo con carbol fucsina y no se decoloran con alcohol acido, denominándose
bacilos acido alcohol resistente BAAR. La propiedad tintorial se relaciona con la
presencia de ácidos micológicos unidos a la pared celular en la pared intacta. Cuando
se examina bajo la luz del microscopio, las microbacterias aparecen como bacilos rojos
brillantes, contra un azul claro.
En los trabajos bacteriólogos generalmente se usan colorantes básicos o primarios
como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina todos ellos
pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones pueden
ser según el número de colorantes que utilizan:
A) SIMPLES: Cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta
China, Azul de lacto fenol cual se utilizan para visualizar la morfología de los
microorganismos.
B) DIFERENCIALES :Cuando utiliza mas de un colorante como la coloración de
Gram y Neelsen
C) Especiales cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas
estructuras celulares como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (capa
capsula), Wirtz conklin (para espora) etc. Estas técnicas tienen un gran interés
en la identificación y clasificación de las bacterias. La tinción diferencial más
utilizada es la tinción de Gram.
COLORACION CON AZUL DE METILENO
1. Preparar un frotis con la mescla bacteriana y fijar al calor
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2. Cubrir el frotis con una gota de colorante y dejar actuar por 3-5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.
5. Tambien se puede realizar observaciones al directo.
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso.
COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos
2. Agregar una colonia bacteriana diluida.
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjetos.
4. Observar con lente de 1O y 40X
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un
fondo oscuro. Como la capsula de la levadura. Cryptococcus
COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:
1. Colocar una gota del colorante sobre la lámina portaobjetos
2. Colocar una muestra de un cultivo sobre el colorante
3. Cubrir con una laminilla cubreobjetos
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Los microorganismos se observarán en un fondo azul - celeste
B. COLORACIONES DlFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el Segundo
colorante es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la
coloración de Gram v la de Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente.
COLORACION DE GRAM
Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas
y Gram negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram
negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas;
en las Gram positivas la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.Existen
varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff.
MATERIAL
• Muestra con mezcla de bacterias
• Solución fisiológica al 0. 85%
• Láminas portaobjetos
• Asa bacteriológica de Kolle en aro
• Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff
• Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
• Lugol (mordiente)
• Alcohol- acetona (decolorante)
• Fucsina básica (colorante de contraste). Las bacterias de colorean de
color azul a violeta los gram positivos y los gram negativos de rosado
a rojo.
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PROCEDIMlENTO
1. Con el asa bacteriologica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar
un frotis en el centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en zigzag.
2. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la
ayuda de la llama débil d el mechero de Bunsen.
3. Colocar la lámina portaobjetos sobre el puente de coloración.
4. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, durame 3 minutos.
5. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre
el frotis).
6. Cubrir con Lugol durante 1-2 minutos, lavar luego con agua.
7. Decolorar el frotis con una solución de alcohol - acetona (inclinar la lámina y
decolorar hasta que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar
con agua.
8. Cubrir con el colorante de contraste Safranina durante 30 segundos. Luego
lavar con agua.
9. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de
Bunsen.
10. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión
FROTIS BACTERIANO
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COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
Es una coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen
elevado contenido de lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso ) ,
llamados también ácido- alcohol –
resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica
fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es
forzado a penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.
MATERIAL
Láminas con frotices de bacilo tuberculoso.
Set de coloración Ziehl –Neelse
Fucsina fenicada al 5%(colorante primario )
Alcohol ácido ( alcohol etílico con 3% de HCl )
Azul de metileno (colorante de contraste).
Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsia fenicada el frotis realizado en el lamina y calentar la
preparación con el mechero de alcohol hasta aprecias el desprendimiento de
vapores, repetir este procedimiento por tres veces, evitando que hierva el
colorante
2. Lavar con agua corriente
3. Decolorar con alcohol acido gasta que se aprecie una coloración rosada
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto
6. Lavar con agua corriente
7. Secar y observar con lente de inmersión
RESULTADO
Las bacterias acido alcohol resistente se tienen de color rojo y las no acido
alcohol resistentes se tiñe al color azul
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OBJ ETIVOS
o Con esta práctica se pretende que el alumno asimile la importancia de
la morfología bacteriana en el diagnóstico microbiológico. Describir las
diversas formas morfologías bacteriana.
o Discutir la diferencia de la morfología bacteriana en la terapeutica de las
infecciones por estos agentes.
INTRODUCCION
Uno de los elementos básicos para la clasificación o identificación de un
microorganismo lo constituye su morfología ; ya que simplemente con la ayuda de un
microscopio óptico y unos pocos colorantes, observando la morfología bacteriana se
puede hacer un diagnóstico presuntivo del germen o gérmenes , lo cual se hace más
relevante para realizar un diagnostico presuntivo Los parámetros a considerar son :
tamaño, forma, disposición de las bacterias, la reacción aun colorante en particular y
detalles del género o especie .
Microscopio óptico
MATERlAL
Porta objetos
Cubreobjetos
Pipeta Pasteur
Gradilla
1 tubo d e ensayo de 1 3 X l 00 mm
Asa bacteriológica
Frasco gotero con solución de cristal violeta , lugol, alcohol - acetona, safranina
Frasco gotero con solución de fucsina fenicada de alcohol ácido, azul de
rnetileno
Solución sal ina .
Mechero
Asa de siembra
Puente de coloración
Gradilla metálica
CEPAS MICROBIANAS
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Staphylococus aureus
Escherichia coli
PROCEDIMIENTO
A cada grupo de estudiantes se le hará entrega una lámina coloreada para que pueda
obervar las diferentes formas con diferentes coloraciones.
Realizará las observaciones correspondientes, haciendo énfasis en los elementos
diagnósticos o diferenciales de los microorganismos observados, de acuerdo con los
parámetros mencionados y seguidamente dibujará lo observado al microscopio.
Dibuje todas las observaciones SIN CAMBlAR DE COLORES lo observado,
1. ------------------------------------------------------
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2. -------------------------------------------------
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3. ---------------------------------------------------
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4. ---------------------------------------------------------
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5. ------------------------------------------------------
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6.- Frotis de cavidad bucal: flora mixta con predominio de bacilos cortos.
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7.-Describa los obstáculos que tuvo al preparar los reactivos que le toco preparar.
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8.- Describa las recomendaciones para realizar un buen frotis, y en que se fundamenta
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PRACTICA Nº 4
MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA BACTERIANA
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OBJETIVOS
Con esta práctica se pretende aprender las técnicas de preparación de diferentes
medios de cultivo, su estilización y su almacenaje, asi como la importancia de los
diferentes medios de cultivo y su uso Además también se pretende que el alumno
se familiarice con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la
manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad realizar las
diferentes formas de siembra bacteriana .
GENERALIDADES
Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una
fuente de energía exógena y nutriente esencial tales como agua, carbón, nitrógeno,
minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales
apropiadas como son pH, temperatura, presión osmótica y oxigeno atmosfénco.
Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los
medios de cultivo los cuales pueden ser de mu y variados tipos de acuerdo al
microorganismo que se desee estudiar .
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes , factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismo. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de
medio y re disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo
las instrucciones del fabricante ·
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidifican te. Es un polisacárido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos Los más
empleados son la glucosa , la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta. Y otros
4. Peptonas . Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digesti6n química o
enzimática de proteínas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son añadidos a los medios emplea dos para el cultivo de algunos
microorganismos patógenos.
6. Sistemas amortiguadores . Son sales que se añaden al medio para mantener
el pH dentro del rango oprimo del crecimiento bacteriano . Ej. fosfatos bisódicos
o bipotásicos
7. Indicadores de pH Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar
cambios de pH en el medio.
8. Agentes selectivos Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares,
glucosa, dextrosa etc que a determinadas concentraciones en el medio
actúan como agentes selectivos frente a determinados rnicroorgarnismos.
9. Agentes reductores . Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos o
anaerobios." Ej. cisteína y tioglicolato.
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10. Agentes selectivos . Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actúan corno agentes
selectivos frente a determinados microorganismos.
Clasificación de los medios de cultivo por su CONSISTENCIA:
a. Sólidos Son aquellos que contienen un agente solidifícame entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en
slant (tubos con la superficie del medio inclinada) 1 % de agar.
b. Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o Erlenmeyer. Excepto
de agar.
c. Semisólida.- Se observa en su gran mayoría en medios de transporte y contiene
0.5% de agar también denominado semisólido.
Por su COMPOSICIÓN:
a. Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos .(Gram positivos y gramnegativos)
b. Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás.
d. Medios diferenciales. Son aquellos en los que se» pone. de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee, como son las
reacciones bioquímicas.
AJUSTE DEL pH.- Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad
el pH de! medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aun así es
conveniente ajustar el pll lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto
con papel pH 4.0-7.0. Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a
45°-50°C (aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente.
La corrección del pH se efectúa con HC1 o NaOll 1N o 0.1 N tomando una muestra del
medio dé cultivo preparado y. estéril, se mide el pH y si hiera necesario se ayusta en la
muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total
de medio.
ESTERILIZACIÓN - Existen medios que deben ser auto clavados y algunos no ; las
recomendaciones se describe en los insertos de cada medio de cultivo ,cabe mencionar
que los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el
caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para
vaciar una placa (aprox. 20 mi cada uno) o bien matraces para varias placas. Si en las
instrucciones del medio no se índica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en
autoclave a 121C por 1 5 minutos.
MATERIALES
3 Erlenmeyer de 100 mi
6 cajas de Petri
2 tubos de ensayo
1 pipeta de 10 ml
1 probeta
de 100 ml
Espátula
Balanza
PROCEDIMIENTO
Realizar los cálculos respectivos para agar y caldo teniendo en cuenta que para
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Microbiología General. - Facultad de ciencias biológicas –UNA Puno
cada caja deben servir 15-1 8 mi de agar y para cada tubo entre 7-10 mi de
caldo.
Medir el volumen de agua destilada según sus cálculos.
Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, haga la relación de polvo de
agar que debe pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio.
Pese la cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos.
Mezcle el polvo con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, agite y
adicione el restante de agua.
Impedir que haya ebullición.
Esterilizar en el autoclave a 15 Ib de presión a 12Í°G por 15 minutos.
Plaquear de 10-20 mi dependiendo de que tipo de placa o caja Petri maneje.
Cuando se encuentre entre 50-5 5°C,plaquear y dejar que solidifique .
Llevar a control de calidad con guía del Docente,(no todas se llevan ejm As)
Déjelos enfriar y guárdelos en el refrigerador hasta su utilización.
A) Tipos de siembra
Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de
muestra bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda
de un Asa de siembra en aro 20.
Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en
zigzag, hasta la mitad de la superficie del medio de cultivo sólido que se
encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45° y continuar sembrando en
zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-
sólido, con ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical
hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra
bacteriana e introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando
no tocar las paredes.
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RESULTADOS
Describa las recomendaciones que se debe tener al realizar los cultivos bacterianos.
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Dibuje los tipos de siembra que realizo , en los diferentes medios de cultivo (no cambie
colores)
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PRACTICA N°5
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO Y MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS
BACTERIANAS
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RESULTADOS.
Esquematice la curva de crecimiento bacteriano de las placas y tubos con caldo con
crecimiento bacteriano que observo.
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Falta LETRAS
Falta LETRAS
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RESULTADOS
De acuerdo a las observaciones, esquematice las colonias bacterianas y clasifíquelo por
sus diferentes formas:
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PRACTICA N° 6
GENERALIDADES.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos
complejas. Por ello, una técnica esencial en Microbiología es la obtención de cultivos
puros (axénicos), a partir de los cuales son posibles estudios sobre las propiedades del
microorganismo.
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos (una sola
especie). Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento.
Se puede demostrar que prácticamente cada colonia procede de una misma célula o de
un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Como regla
general cada especie forma siempre en el mismo medio colonias semejantes. Los
rasgos de las colonias por tanto son importantes para la identificación primaria de grupos
de bacterias diferentes
PROCEDIMIENTO
1. Seleccionar una cepa que nos interesa aislar en forma pura.
2. Se esteriliza (rojo incandescente) y enfría el asa.
3. Se selecciona un campo para realizar un sembrado por estría simple.
4. Se cierra la caja, se esteriliza y enfría el asa nuevamente.
5. Se lleva a incubación a 37°C.
6. Se debe realizar en condiciones de esterilidad y asepsia, tratando siempre de
aislar solamente la colonia que hemos sembrado. Cuando todas las colonias
presentes en una caja son iguales en tamaño, color, aspecto y demás
características podemos asumir que tenemos un cultivo puro.
RESULTADOS
Dibuje las diferentes sepas bacteriana que se aisló en forma pura.
Descripción: Descripción:
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B.-METABOLIZMO BACTERIANO
OBJETIVOS.
1. Observar las diferentes reacciones químicas producidas por las bacterias como
respuesta de su metabolismo.
2. Reconocer las principales pruebas bioquímicas empleadas en la identificación
de bacterias. Aprender a realizar, leer e interpretar las diferentes pruebas
bioquímicas empleadas en el laboratorio.
3. Aprender la utilidad de los diferentes medios de cultivo selectivo y diferenciales.
4. Aplicar los diferentes métodos de siembra vistos en teoría.
5. Realizar algunas pruebas adicionales para identificación de bacterias.
INTRODUCCION.
Los microorganismos al igual que todo ser vivo necesita de nutrientes para un
buen desarrollo. Si se combinan las fuentes de crecimiento e inhibidores
adecuados y se proporcionan las condiciones favorables se puede lograr la
separación de grupos de microorganismos lo que facilitara su estudio posterior.
El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios
bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que
llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo
enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además
tienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos
microorganismos sus funciones. Los organismos varían de su capacidad para
utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para
algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio, como
son: aerógenas: las que producen gas como hidrogeno y dióxido de carbono
como resultado de la actividad metabólica: anaerógenas: las que no producen
cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica. Cromógenas: las que
producen pigmentos solubles o insolubles. Fotógenas: las que causan
putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias marinas).
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la gelatina nutritiva con extracto de carne, peptona, gelatina y agua destilada. La prueba
se realiza inoculando por picadura agar gelatina nutritiva estéril, se incuba a temperatura
ambiente por 7 días y se determina que patrones de licuefacción presenta. Si
únicamente es para determinar la presencia de la enzima se incuba a 30°C por 24 horas,
se coloca luego a temperatura ambiente por una hora y se observa el tipo de
licuefacción.
Producción de ureasa: Determina la capacidad de un microorganismo de desdoblar la
urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. La ureasa
es una enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos
orgánicos. El medio empleado es el caldo urea con fosfato monopotasico, fosfato de
sodio, extracto de levadura, urea, indicador de rojo de fenol y agua destilada. La prueba
se realiza sembrando con asa redonda una suspensión del microorganismo en el medio
e incubando a 35°C +/- 2°C por 24 – 48 horas y se lee de la siguiente forma: Si el medio
vira a un color Rosado intenso o purpura la prueba es positiva. Si no hay cambio de
color se considera como prueba negativa.
Producción de hemolisinas: las hemolisinas son sustancias que dejan libre la
hemoglobina que contienen os glóbulos rojos sanguíneos. Se producen por varios tipos
de bacterias como: streptococcus sp y staphylococcus sp. Las hemolisinas pueden
producir cambios visibles cuando se cultivan las bacterias en placas con agar de sangre.
Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en agar sangre por el método de
agotamiento con el asa bacteriológica (francés preferiblemente) y luego se incuban las
placas a 35°C +/- 2°C por 24 – 48 horas y posteriormente se hace la lectura así:
- Hemólisis Alfa: presencia de un halo color verde alrededor de la colonia; esta
hemolisis es un tipo de hemólisis incompleta en la cual los glóbulos rojos que
rodean las colonias son parcialmente dañados, pero no lisiados completamente.
El enverdesimiento del medio se produce debido a la salida de la célula de un
derivado del tipo de la meta hemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo
de la biliverdina
- Hemolisis beta: en la cual las colonias del microorganismo aparecen en la placa
de agar sangre rodeadas de una zona clara, incolora en la cual los hematíes han
experimentado lisis y se ha reducido la hemoglobina (halo transparente)
- Hemolisis gamma: o ausencia de hemolisis, en este tipo de hemolisis no hay
daño de la célula, es decir, no hay lisis total o parcial de los glóbulos rojos y por
lo tanto no se producen modificaciones en el medio en contacto con la colonia
de la bacteria.
El tipo de hemolisis producido en agar sangre es útil para una identificación inicial
de los estreptococos. Sin embargo, las reacciones hemolíticas pueden sufrir
variaciones dependiendo del tipo de sangre usado. Estas variaciones son
evidentes con los streptococos del grupo D
- Producción de catalasa: la catalasa es una enzima que esta relacionada con
microorganismos aeróbicos (excluyendo a los estreptococcus) y anaeróbicos
facultativos y ausente en los anaeróbicos estrictos. Esta enzima descompone el
peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno.
La no aparición de burbujas es un indicador negativo
- Citocromo oxidasa: el sistema citocromo oxidasa está constituido por
hemoproteínas capaces de catalizar la oxidación de un citocromo reducido por
el oxigeno molecular. Las bacterias que obtienen su energía por respiración y
utilización de oxigeno molecular como aceptor final de electrones, contienen
diferentes sistemas citocromo oxidasa, en tanto que las bacterias anaerobias
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FUNDAMENTO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio ( citrato de Simmons) incluye
citrato de sodio, un anion como única fuente de carboo y fosfato de amonio como única
fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer
nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio
por conversión del NH3 en hidróxido de amonio(NH4OH) , detectándolo con el indicador
del pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre Ph 6.9(VERDE)
y pH( AZUL).
MATERIALES
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PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobicas y
facultativas anaeróbicas. El peróxido de hidrogeno(H202) es uno de los productos
finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para
el microorganismo.
MATERIALES
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PRUEBA EN LAMINA
a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador esteril, picar el centro de
una colonia bien aislada y transferir el inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade
el reactivo.
d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden en la prueba en lamina no debe invertirse cuando se use
asa de platino, ya que puede resultar falso positivo. el alambre de
nichronr no interfiere en el resultado de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18-24 horas: cultivos
mas viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una
reacción falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acústico por lo que se debe evitar
que toque la piel en caso que ocurra inundar el área afectada con
alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE
AGUA.
INTERPRETACION
prueba cualitativa: la aparición rápida y prolongada de burbujas, de gaso efervescencia
son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutivas durante 20-30,
estas no son catalasas positivas.
CUESTIONARIO:
ESQUEMATICE TODAS LAS OBSERVACIONES SIMPLES DIFERENCIALES Y
OTROS QUE HA OBSERVADO
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positivo . El citrato de sodio es una sal del acido cítrico , compuesto organico
simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs .
FUNDAMENTO
La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un
mdio con citrato con formación de subproductos alcalinos . El medio (citrato de
simoons ) incluye citrato de sodio , un anion com ounica fuente de carbono y
fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno . Las bacterias que pueden
utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio , con
producción de amonio ( NH3) alcalinizando el medio por conversión del NH3 en
hidróxido de amonio (NH4OH) detectándolo con el indicador de pH incorporado
el azul de bromotimol cuyo rango de viraje est entre pH 6.9 (verde ) y pH 7.8
(azul )
MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo
Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien eterilizada , sembrar por la técnica de estria
en cada tubo la cepa citrato positiva y negativa
2. Rotular los tubos e incubar a 37ªC por 18-24 horas
Pruebas de motilidad bacteriana puede observarse directamente en un
microscopio colocando una gota de caldo de cultivo e un portaobjetos de gota
pendiente para bacterias que no creces bien en medios semisólidos . Sin
embargo para las enterobacterias es mas común emplear medios de cultivo
semisólidos Los medios combinados mas empleados son el SIM y el MIO ya
que permiten evaluar mas de una característica a la vez , por ejemplo en SJM
podemos evaluar movilidad , producción de H2S o indol . Dado que este
medio tiene un fondo levemente turbio , la interpretación de resultados de
movilidad se hace un poco complicado , sobre todo si el analista revela la
prueba de indol primero lo cual puede afectar el color del medio
PRUEBA DE LA CATALASA.
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobicas
y facultativas anaeróbicas . El peróxido de hidrogeno ( H2O” ) es un uso de
los productores finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y asi
se acumula es letal para el microorganismo
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MATERIALES
Cepas Control : S aureus , Streptococus o Enterococcus
Solucion de Peroxido de hidrogeno (h2O2) al 3 %
Medio de cultivo :cualquier medio solido no hibrido y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen actividad de catalasa , por lo que su precensia puede dar
resultados falsos positivos
PRUEBA DE LÁMINA
a) Con e asa bacteriológica en punta o un aplicador esteril , picar el centro
de una colonia bien aislada y transferir el inoculo a un portaobjetos limpios
b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forma burbujas o no inmediatamente después que se
añade el reactivo
d) Descartar la lamina en un recipiente con desinfectante
PRECAUCIONES
INTERPRETACIÓN
Prueba cualitativa: la aparición rápida y prolongada de burbujas , de gas o
efervescente son indicativas de catalasa positiva . Algunas bacterias poseen
enzimas diferentes a la catalasa positiva
CUESTIONARIO
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PRACTICA Nº 7
OBSERVACION E IDENTIFICACION DE HONGOS MOHOSOS Y
LEVADURIFORMES
OBJETIVOS
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GENERALIDADES
Los hongos son microorganismos eucariotas y se presentan en la naturaleza en forma
de mohos, levaduras, artrosporas y hongos mucilaginosos; se desarrollan en medio de
cultivo que tienen azucares a diferentes concentraciones. Su identificación se basa en
criterios morfológicos y fisiológicos. Los mohos tienen crecimiento aéreo y tiene los
siguientes órganos de fructificación son por Blastospora, Clamidospora, Pseudohifas.
Materiales
Agar sabouraud
Cepas de: Candida spp. Penicilium spp. Arpergillus spp.
Observaciones a realizar:
1. Observar el aspecto macro y micro morfológico de las columnas de la especie
de hongos contaminados, diferenciando sus órganos de reproducción.
CUESTIONARIO
1. Dibuje las diferentes formas de hongos
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B. OBSERVACIONDE LEVADURAS.
INTRODUCCIÓN.
Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse asexualmente por
gemación o fisión. Algunas especies pueden formar micelio, y la mayoría de ellas
fermentan uno o varios azucares. Su identificación se basa en criterios morfológicos y
fisiológicos. En esta práctica nos centraremos en la identificación de levaduras siguiendo
pruebas morfológicas lo que nos permitirá aproximarnos al género al que pertenecen
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PRACTICA N° 8
OBSERVACION DE PARASITOS Y VIRUS
A. OBSERVACION DE PARASITOS
OBJETIVOS
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Generalidades.
Los parásitos son microorganismos que las podemos observar en sus diferentes fases
como son protozoarios y las fases de larva quiste y parasito propiamente dicho.
Materiales
Material Biológico
Huevos, quistes y parásitos.
Observaciones a realizar:
1. Observar el aspecto de las diferentes fases de los huevos, quiste y parásitos.
CUESTIONARIO.
2. Dibuje las observaciones, colocando sus partes.
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B. OBSERVACIÓN DE VIRUS
OBJETIVOS
Generalidades:
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Los virus son parásitos intracelulares obligados, por lo tanto no se puede observar a
simple vista, pero si las reacciones producidas, y las reacciones se puede observar un
vitro en microcasets.
Complete........................................................................................................................................
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Materiales:
Muestras de suero humano libre de hemolisis.
Micro cubetas para observación de HIV y HBsAg.
Observaciones a realizar:
-Dibuje las diferentes reacciones de micro Elisa.
-Investigue y describa
las formas de observar a
los virus.
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-Esquematice la
replicación viral del
virus inmunodeficiencia
humana.
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PRACTICA Nº9
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Generalidades.
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PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los
diferentes antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos
debe ser de 20 mm.
4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
LECTUR
a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano
alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco.
b) Compartir con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenida y determinar si
el microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero
puede responder a dosis altas del antibiótico.
La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración de su
capacidad de difusión en el Agar.
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y
someter al calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador.
Si el medio es acido agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino
agregar gota a gota solución de HCI hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar a
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la autoclave a 121°C por 15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37°C por r24
horas. Luego dejar en refrigeración hasta su utilización.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 10 ml de agua destilada tibia,
luego agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de
NaOH o HCl. Luego envasar y esterilizar a 121°C por 15 Minutos y controlar la esterilizad
por incubación a 37°C por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.
II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego
dejar enfriar hasta una temperatura de 45°C y adicionar 5ml de sangre citratada o
desfibrinada. Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado
y distribuir en Placas Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de
esterilidad. Mantenerlo en refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio
debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura
de 80°C hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y
realizar control de esterilidad y dejarlo después en refrigeración.
III. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml de agua destilada, someter
al calor hasta su completa disolución. Repartir luego en Placas estériles. No necesita
auto clavar.
Medios de cultivo selectivos. Este es un medio nutritivo al que se le añaden productos
que actúan como agentes inhibitorios, de tal manera que solo permiten el crecimiento
de cierto grupo de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e
inhibir el crecimiento de los no deseados.
Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los
microorganismos Gram positivos, además de la lactosa y como indicador rojo de fenol
para distinguir las bacterias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.
Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los
organismos Gram positivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar MacConkey, permite
diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.
El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7,5%) inhibe a las bacterias que
no lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la
fermentación del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciación del genero
Staphylococcus.
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azucares); disolver el medio en 100 ml de agua
destilada, hervir hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y
esterilizar en autoclave a 121°C por 15 Minutos. Luego de autoclave colocar los tubos
en plano inlinado. El medio final tendrá un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá
un color verde.
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3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa
disolución y autoclavar. Después adicionar 5ml de Solución de Urea al 40%esterilizara
por filtración.
4. Para el Cldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos
de 13x10mm y autoclavar a 121°C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver en agua destilada por calor hasta su completa disolución
y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121°C por 15 minutos, y dejar
enfriar los tubos en plano inclinado.
RESULTADOS
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EXAMEN I:
ASISTENCIA:
PRACTICA Nº7 PRACTICA Nº8
PROMEDIO FINAL:
ASISTENCIA:
ASISTENCIA DE PRÁCTICAS
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Recomendaciones:
Los informes a prácticas son válidas siempre que el alumno haya asistido a
las practicas
Las prácticas son evaluadas en forma permanente y de forma sumatoria
según la escala del formato de evaluación
Los informes deberán ser entregados al ingresar a las evaluaciones
prácticas, no hay justificación alguna que se pueda excepcionar salvo
enfermedad o sepelio, previa documentación.
BIBLIOGRAFIA
Diaz, C. Gamazo I. López-Goñi. Manual práctico de microbiología. 2ª edición.
MASSON. Barcelona (España). 1999.215 pg.
Brook Th. 1999. Biología de los Microorganismos. 8ª. Mac Graw Hill.
Ortega G. V., Galvis C. G. Manual de Microbiología. UIS. 1985.
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Rotger Anglada.- (1998) Microbiología Sanitaria. Edit. Síntesis. España.
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ISO/IEC 17025 (ES) Norma internacional
Norma internacional NORMA INTERNACIONAL ISO 6999-1:1999 Microbiología
de alimentos y forraje animal método horizontal para la numeración de
Staphylococos coagualasa positiva (staphylococos aureus y otras especies)
parte 1 Usando la técnica del medio Agar Baird Parker
Mendo Rubio M. (1995). Medios de cultivo en Microbiología. Cuarta Edición
Ediciones laborales Avda Petituars 1377 Lima Perú
Gonzales a. (2014) Microbiología genera, Edit Titicaca, UNA-PUNO
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