PRÁCTICA

EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN

I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos
más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico.

3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los alimentos.

II. MARCO TEÓRICO

El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control
microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.

2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con
vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que
sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido
a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos.

En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más
energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.

Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC durante 1
hora.

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe,
espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los
microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza el
material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material
de vidrio.
 2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas
como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del
recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre la presión
atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el
ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la
introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o
liberación de una nucleasa.

El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas
moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es
resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor.
Existe también degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a
temperaturas elevadas.

a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos.

b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza
para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-20
minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden
esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.

c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes resistentes,
puede ser horizontal o vertical; consta de:

♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN

Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas que
retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante
puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

2.3 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método presenta
muchas dificultades técnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO

 Material de vidrio: pipetas, palcas Petri
 Erlenmeyer, tubos de ensayo
 Papel craff, algodón, gasa, tijeras
 Mechero de Bunsen
 Horno Pasteur de aire caliente
 Autoclave
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a) Preparación de tubos matraces

 Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni
cortos, preparados según el método siguiente:
 De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de fibra,
extendida, rectangular
 Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
 Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
 Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono truncado,
con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la
mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar
la hilacha miento.

Tubos de Ensayo
 Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos,
en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces
 Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo
pabilo.
 Colocar el nombre del medio de cultivo
 Rotular la fecha de preparación.

b) Preparación para proteger las pipetas

 En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de una
aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
  Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una
de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud
de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata
con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante.
 Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización.

c) Preparación de las placas Petri

 Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas.
 Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro, se
envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de
ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles
hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de regalo.

4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal.

a) Procedimiento para la esterilización en horno

 Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno.
 Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
 Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60
minutos más.
 Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno.
 El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el color del
papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha
ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

a) Procedimiento para la esterilización con autoclave

 Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no
toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
 Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir
indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la
temperatura adecuada.
 Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco.
Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
 Abrir la válvula de salida del aire.
 Inicie el calentamiento de la autoclave.
 Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el
chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la
autoclave.
 Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del
autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.

 Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y
esperar por 15 minutos.
 Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
 Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las
presione dentro y fuera del autoclave.
 Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los utensilios
estériles.
 V. CUESTIONARIO
1, ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?

El calor produce una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas moléculas
y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y es resultado de la degradación de
los ribosomas por ribo nucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN
ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Deshidrata las bacterias, virus, etc. y facilita la coagulación o desnaturalización de las proteínas. Se requieren
mayores temperaturas para producir daño irreversible (muerte). Se acepta que el calor seco actúe oxidando
los constituyentes intracelulares. En el proceso de esterilización son prioritarios los procesos oxidativos y de
fusión de membranas por sobre la desnaturalización. Resulta lento por la menor eficacia del calor seco y por
la lentitud del transporte del calor (convección y radiación). Para ello se introducen los artículos a esterilizar
en un horno. Generalmente, hace falta una temperatura de alrededor de 170 °C durante aproximadamente
2 horas para asegurar la esterilización. No son recomendables temperaturas más altas pues a los 180 °C el
papel envolvente tiende a carbonizarse. Requiere un periodo de exposición mayor y temperaturas más altas
que los métodos de calor húmedo. Sin embargo, el aire caliente es un método efectivo para esterilizar tanto
polvos secos y sustancias aceitosas libres de agua como para cualquier tipo de cristalería,
como pipetas, frascos y jeringas. Así mismo, el calor seco no erosiona la superficie de vidrio de las jeringas
no desechables y no corroe el filo del material punzocortante como lo hace el vapor.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares. El método más
sencillo, económico y práctico para esterilizar. El calor húmedo se produce en los aparatos comúnmente
llamados autoclave, estos funcionan a presión conseguida con vapor.
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas
como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del
recipiente de esterilización, debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre la presión atmosférica para
obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el ADN, y la pérdida
de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de estas
rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de unas
nucleasas.

VAPOR DE AGUA CON PRESIÓN. Se realiza en una autoclave a 15 PSI y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea
para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se
puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.

AUTOCLAVE: Una autoclave es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre
hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una
esterilización con vapor de agua. Permite que resista la presión y temperatura desarrollada en su
interiores.

 Caldero de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
 Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
 Orificios superiores para purga de gases de combustión.
 Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
 Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2, ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiológico, por qué?

Si es importante, ya que la limpieza, desinfección y esterilización son tareas fundamentales para reducir los
riesgos en entornos donde se presenta una alta carga micro bacteriana, principalmente aquellos asociados
con la contaminación. Por tanto, como parte de los programas de limpieza en la industria farmacéutica,
alimenticia, bioquímica y en entornos de servicios sanitarios, se deben implementar procesos que garanticen
que tal limpieza, desinfección y esterilización se realicen de manera correcta. Para comenzar se debe realizar
un lavado de instrumental y material para laboratorio. Una vez hecho esto, se puede proceder a su
desinfección y su esterilización.

La esterilización es la muerte y/ o eliminación de todo microorganismo. No existen grados de esterilidad, un

objeto es estéril o no lo es. La dinámica de la esterilización dice que la proporción de microorganismos
muertos en iguales periodos de tiempo es constante. A mayor temperatura, mayor acción y menos tiempo
necesario para esterilizar. Esto es válido para cualquier procedimiento químico o físico excepto filtración.

La Esterilización permite el control de microorganismos en el laboratorio dado que la escogencia del método
a utilizar y del material a procesar definen la eficacia del proceso de eliminación microbiana y por ende
garantizan la no contaminación de muestras o cultivos, hechos fundamentales en la validez de un resultado
en el laboratorio. Es imprescindible entonces, que los estudiantes que ingresan al laboratorio de
esterilización deben saber y manejar en forma disciplinada las medidas de Bioseguridad y de protección para
disminuir y evitar infecciones.

3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento
el autoclave.

PROCEDIMIENTO PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDA – VAPOR DE AGUA CON PRESIÓN –AUTOCLAVE

 Primero se tiene que tener los instrumentos preparados para la esterilización (si son tubos de ensayo,
como los que se tienen en el laboratorio, estos no deben estar con su tapa del todo cerrada,
limpiados con alcohol isopropilico y envueltos en doble capa de papel craft)
 Llevarlos a la autoclave donde previamente:
 Pondremos unos 400 ml de agua o lo necesario para que llene el fondo de la autoclave (hasta el
soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta ya que causaría un desborde.
Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
 Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir
indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la
temperatura adecuada de ese modo sabremos si nuestro procedimiento fue exitoso.
 Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco.
Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza, pero sin apretarlo demasiado
 Abrir la válvula de salida del aire para indicarnos el momento que estará hirviendo el agua.
 Inicie el calentamiento de la autoclave.
 Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde de 3 a 4 minutos hasta que
el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la
autoclave.
 Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave
y reduzca la temperatura ligeramente.
 Cuando se obtenga la temperatura adecuada 121ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y
esperar por 15 minutos incluso puede ser 20.
 Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
 Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las
presione dentro y fuera de la autoclave.
  Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los utensilios
estériles, a veces no es necesario usar guantes pero si el material fuese de porcelana.

4. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.

La esterilización por filtración se logra por el paso de un líquido o un gas a través de un material capaz de
retener los microorganismos presentes. La esterilización por filtración se emplea para materiales sensibles al
calor, tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones de antibióticos y otros medicamentos, etc.

Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que más se usan son los filtros de profundidad y los filtros de
superficie o filtros de membrana.

 Filtros de profundidad Estos filtros están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de
vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vías tortuosas donde
pueden quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes. Entre sus ventajas se encuentran
su alta capacidad de retención de partículas sobre su superficie y a través de toda su estructura y que
permiten filtrar grandes volúmenes. Sin embargo, tienen como desventajas que no presentan un tamaño
de poro uniforme y existe la posibilidad de liberación, hacia el material filtrado, de partículas y
microorganismos que hayan crecido dentro del filtro.

 Filtros de superficie Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y
contienen poros de tamaño uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente
el tamaño de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los
microorganismos presentes en una solución. Sin embargo, se saturan rápidamente y la velocidad de
filtración a través de ellos es lenta. Para la filtración esterilizante se pueden usar combinaciones de un
filtro de profundidad con un filtro de superficie que tenga un tamaño de poro de 0.22 µm. La mayor parte
de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan asépticamente al
ensamblar el equipo.

Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso
al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos
están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para
emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas,
soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos
celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

 Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño
de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz del filtro
debido a efectos electrostáticos.