Prostate Int . 2017 jun; 5 (2): 47-52.

Publicado en línea 2017 Ene 17. doi: 10.1016 / j.prnil.2017.01.005

Efecto protector del extracto de Chuquiraga spinosa sobre el

cáncer de próstata inducido por N -metil-nitrosourea (NMU) en
ratas
Jorge Arroyo-Acevedo , a, b Oscar Herrera-Calderón , c, * Roberto Chávez-Asmat , b, dAndrea Anampa-Guzmán , d Víctor
Chumpitaz-Cerrate , e y Edwin Enciso-Roca f

Abstracto

Fondo
El objetivo principal fue evaluar el posible efecto protector del extracto de Chuquiraga spinosa sobre el cáncer de
próstata inducido por N- metil nitrosourea (NMU) en ratas y la línea celular DU-145.

materiales y métodos
La carcinogénesis prostática se indujo en 30 ratas macho Holtzman proporcionando acetato de ciproterona,
testosterona y NMU. Los tumores se controlaron y se registraron los parámetros hematológicos y bioquímicos y la
frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados. La línea celular se evaluó mediante un ensayo de
citotoxicidad.

Resultados
La carcinogénesis prostática se indujo en 30 ratas macho Holtzman proporcionando acetato de ciproterona,
testosterona y NMU. Los tumores se controlaron y se registraron los parámetros hematológicos y bioquímicos y la
frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados. La línea celular se evaluó mediante un ensayo de
citotoxicidad.

Conclusiones
Teniendo en cuenta sus efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antigenotóxicos, y variaciones importantes
en los parámetros bioquímicos y hematológicos, incluido el antígeno específico de próstata del extracto de C.
spinosa , concluimos que tiene un efecto protector sobre el cáncer de próstata inducido por NMU en ratas y la
citotoxicidad en la línea celular DU-145.
Palabras clave: Antigenotoxicidad, Antiinflamatorio, Antioxidante, Chuquiraga spinosa , Citotoxicidad

1. Introducción
El cáncer de próstata es la neoplasia maligna más frecuentemente diagnosticada y la segunda causa más común
de muerte relacionada con el cáncer en hombres mayores en los Estados Unidos. 1 La inflamación crónica es
un mediador potencial en el desarrollo de muchos cánceres, incluido el cáncer de próstata. 2 Los pacientes
con cáncer usan plantas medicinales porque piensan que las plantas tienen menos efectos secundarios y son
menos propensas a causar dependencia. 3 Es necesario evaluar la eficacia y la seguridad de las plantas
medicinales utilizadas por los pacientes con cáncer con los estudios de farmacovigilancia. 4 Chuquiraga
spinosa se usa tradicionalmente para tratar las enfermedades de la próstata en el norte de Perú. 5 Bussman
afirma que, a pesar de otras plantas, C. spinosa tiene efectos comprobados en la salud. Su efecto antibiótico
también ha sido probado. 6 Casado et al 7 demostraron que el extracto acuoso y metanólico de las partes aéreas
de C. spinosa exhiben una alta actividad antioxidante.Además, el extracto metanólico administrado por vía
oral redujo significativamente el edema subplantar y de la oreja inducido en ratas. Los extractos acuosos y de
metanol tenían actividad contra Candida albicans y el extracto acuoso mostró actividad antifúngica
contra Candida cucumerinum . 8 El potencial citotóxico del heliantriol B2, un triterpeno pentacíclico aislado
de Chuquiraga erinacea, ha mostrado un efecto antitumoral en líneas celulares de leucemia
humana. 9 Considerando el uso tradicional de C. spinosa, sus propiedades antioxidantes y su relación con C.
erinacea , nuestro objetivo fue demostrar el efecto antitumoral del extracto de etanol de las partes aéreas de C.
spinosa (llamado Huamanpinta) en el cáncer de próstata inducido por N- metilo -N-nitrosourea (NMU) en
ratas y línea celular DU-145.

2. Materiales y métodos

2.1. Productos químicos

NMU se adquirió de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás productos
químicos y disolventes utilizados fueron de grado analítico y de la más alta pureza.

2.2. Preparación del extracto de C. spinosa

Las hojas de C. spinosa fueron recolectadas en El Tambo, Huancayo, Perú. La identificación taxonómica se
realizó en el Herbario Nacional de la Universidad Nacional de San Marcos, Lima, Perú. Se depositó el
espécimen de comprobante de las hojas (303-USM-2013). El material en polvo se remojó exhaustivamente
con etanol al 96% con agitación intermitente todos los días durante 7 días. A continuación, el extracto se filtró
y se concentró para obtener el residuo sólido, se observó su peso final y se mantuvo refrigerado hasta su uso
posterior.

2.3. Evaluación fitoquímica cualitativa

Los extractos obtenidos se cribaron para determinar la presencia de constituyentes fitoquímicos, como
alcaloides, terpenoides, quinonas, flavonoides, taninos, saponinas, esteroides y compuestos fenólicos, con
los métodos fitoquímicos cualitativos estándar descritos.10

2.4. Evaluación de la actividad antioxidante

El ensayo de 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito
por Mensor et al. 11 Extracto etanólico (1,900 μL) a diferentes concentraciones (1,0 μg / mL, 10,0 μg / mL y
50,0 μg / mL) y controles (trolox y vitamina C) se dejaron reaccionar con 100 μL de DPPH 0,4 mM en etanol
y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Todas las pruebas fueron
realizadas por triplicado. La absorbancia de cada muestra se midió a 517 nm usando un espectrofotómetro UV
/ Visible (UNICO, UV-2100 United Products and Instruments Inc., Dayton, NJ, EE. UU.).

2.5. Animales
Treinta ratas macho Holtzman que pesaban 250 ± 20 g fueron obtenidas del Instituto Nacional de Salud, Lima,
Perú. Los animales fueron alojados en jaulas espaciosas y bien ventiladas en el bioterio de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional de San Marcos. Los animales recibieron una dieta equilibrada de
alimento para ratas de pellets disponible en el mercado y agua a voluntad . Las ratas se mantuvieron en un
ciclo de luz / oscuridad de 12 horas y una temperatura de 21 ± 2 ° C. El experimento comenzó con un período
de preacondicionamiento de 7 días.

2.6. Inducción tumoral

En todos los grupos, excepto P80, la inducción tumoral se llevó a cabo siguiendo el método de Bosland y
Prinsen. 12 Después de la liberación de la cuarentena, 36 ratas recibieron diariamente acetato de ciproterona
(50 mg / kg de peso corporal en aceite de sésamo) mediante inyección intraperitoneal durante 18 días
consecutivos. Un día después de la dosis final de acetato de ciproterona, las ratas recibieron inyecciones
subcutáneas diarias de propionato de testosterona (100 mg / kg de peso corporal en aceite de sésamo) durante
3 días. El día después de la administración de propionato de testosterona, cada rata recibió una única inyección
intravenosa de NMU (50 mg / kg de peso corporal en solución salina estéril, pH 5,0). Los grupos se nombraron
de acuerdo con el tratamiento y se dosificaron en mg / kg. P80 se refiere a polisorbato 80 y ChS se refiere a
extracto etanólico de C. spinosa . El grupo de control negativo, P80, recibió polisorbato 80 al 1% (50 mg / kg
de peso corporal) por vía oral durante 23 semanas. El Grupo Inductor recibió solo los tratamientos de acetato
de ciproterona, propionato de testosterona y NMU. Los grupos ChS50, ChS250 y ChS500 recibieron un
extracto etanólico oral de 50 mg / kg, 250 mg / kg y 500 mg / kg de peso corporal, respectivamente, durante
23 semanas después de la inducción del tumor. Al final del período experimental, las ratas fueron pesadas. Se
obtuvieron muestras de sangre para evaluar los indicadores bioquímicos y hematológicos. Los animales se
sacrificaron mediante anestesia con pentobarbital (100 mg / kg).

2.7. Parámetros hematológicos

El contenido de hemoglobina se determinó espectrofotométricamente (B-Hemoglobina, Hemocue, Estocolmo,
Suecia). El recuento total de leucocitos se realizó en una cámara de Neubauer. La glucosa en sangre se
cuantificó usando un kit enzimático comercial (Wiener Lab, Santa Fe, Argentina) obtenido de ratas en
ayunas. El colesterol total se estimó mediante el método modificado de Roeschlau et al 13 . El nivel de
lipoproteína-colesterol de alta densidad se determinó según el método de Trinder. 14 Los triglicéridos se
estimaron mediante el método enzimático de GPO-PAP, según lo descrito por Annoni et al. 15 La alanina
aminotransferasa se determinó usando el método de Reitman y Frankel 16 . La actividad de la fosfatasa
alcalina se evaluó de acuerdo con King y Armstrong. 17 La determinación de la urea se basó en la división de
urea con ureasa (reacción de Berthelot) según Fawcett y Scott. 18

2.8. Parámetros bioquímicos

La superóxido dismutasa (SOD) se ensayó según lo descrito por Beauchamp y Fridovich 19 basándose en la
reducción de nitroblue tetrazolium a formazan azul insoluble en agua. La peroxidación lipídica se detectó
mediante la determinación de la producción de malondialdehído (MDA) determinada por el método de Begue
y Aust. 20 Se realizó un ensayo de eliminación de NO utilizando el método de reactivo de Griess. 21 Los
niveles de proteína C reactiva (CRP) se determinaron utilizando Bioquímica VITROS y sistema integrado
VITROS 5600 (Ortho Clinical Diagnostics Inc., 100 Indigo Creek Drive, Rochester, Nueva York, EE.
UU.). La cantidad de antígeno prostático específico (PSA) en suero de ratón se cuantificó usando un kit ELISA
disponible en el mercado (Diagnostics Biochem, Dorchester, ON, Canadá) frente a una curva estándar (0,2-
50 ng / ml de PSA).

2.9. Prueba de micronúcleos

La prueba de micronúcleos se llevó a cabo siguiendo el método de Schmid. 22 La sangre periférica se obtuvo
por punción cardíaca para preparar una película sanguínea. Los portaobjetos se fijaron con metanol absoluto
y se tiñeron con Giemsa al 3%. Se registró la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados
(MNPCE) basados en la observación de 1,000 PCE por animal.

2.10. Ensayo de citotoxicidad en línea celular DU-145

Las líneas celulares DU-145 (carcinoma de próstata) y 3T3 (fibroblastos embrionarios de ratón) se adquirieron
de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Se cultivaron a 37 ° C en una
atmósfera con 5% de CO2. La línea celular DU-145 se cultivó en un medio esencial mínimo en presencia de
10% de suero bovino fetal y 50 μg / ml de gentamicina. La línea celular 3T3 se cultivó en medio de Eagle
modificado por Dulbecco. Las líneas celulares cultivadas se lavaron en 3 x 4 ml de solución salina equilibrada
de Hank. Luego, se añadió 1 ml de tripsina / EDTA y 10 minutos más tarde, se eliminó. Los cultivos se
incubaron durante 8 minutos a 37 ° C y cada cultivo se resuspendió en medio de 2 ml. Luego, las células se
contaron usando un hemocitómetro. Cada pocillo de una placa de 96 pocillos recibió 160 μL de medio.
Para el ensayo de citotoxicidad, hubo dos placas, 0 (control) y 1 (experimental). A cada línea se le asignaron
cuatro pocillos y cada pozo recibió 160 ml de medio de cultivo. Se incubaron a 37 ° C en una atmósfera
humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire durante 24 horas. Se añadió ácido tricloroacético (TCA) a la Placa
0, para fijar las células y luego cuantificar a tiempo cero. Se añadieron diferentes diluciones del extracto y 5-
fluorouracilo (5-FU) a la Placa 1. Para diluir el extracto, se mezclaron 5 mg de extracto y 1 ml de
dimetilsulfóxido y se centrifugaron a 13.500 g durante 10 minutos. El sobrenadante era el stock de 5 mg / ml,
y 8,5 ml de este se diluyeron en 340 ml de medio; con diluciones sucesivas de 1: 4. La concentración inicial
utilizada fue de 2.5 mg / ml para 5-FU y 250 mg / ml para los extractos. La placa 1 se incubó durante 48 horas
adicionales. Para evaluar la actividad antitumoral, se realizó el método de bioensayo de citotoxicidad con
sulforodamina B (SRB) según lo descrito por Skehan et al. 23 La prueba se detuvo agregando TCA a las
placas. Las células se fijaron con TCA y se tiñeron durante 20 minutos con una solución de 0,4% de SRB en
ácido acético al 1%. La proteína SRB no unida se eliminó mediante lavado con ácido acético al 1%. Después
de secar las placas, la SRB unida a proteína se solubilizó con una solución de base Tris 10 mM [Tris
(hidroximetil) aminometano; (pH 10.5) y la absorbancia a 450 nm se leyó en un lector de microplacas.La
concentración inhibitoria del 50% (IC50) se encontró por análisis de regresión lineal. El índice de selectividad
del extracto se definió como la relación de citotoxicidad entre células normales y cancerosas: IC50 (línea
celular 3T3) / IC50 (línea celular tumoral), que era> 1 cuando la citotoxicidad para las células tumorales era
mayor que en las células normales.

2.11. Análisis histológico

Las próstatas se recogieron de ratas sacrificadas. Fueron pesados y se determinó su volumen. Las próstatas se
fijaron en la solución de Bouin, se procesaron y se incluyeron en bloques de parafina. Las secciones se cortaron
a un grosor de 5 μm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos se examinaron con un
microscopio óptico (BX51; Olympus, Tokio, Japón) para observar los cambios estructurales y las células
inflamatorias y malignas, y fueron confirmados por un experto en histopatología.

2.12. Análisis estadístico

Las variables numéricas se describieron con medidas de tendencia central y dispersión, y media y desviación
estándar. La normalidad y la homogeneidad de la varianza se evaluaron utilizando las pruebas de Shapiro-
Wilk y Barlett, respectivamente. Posteriormente, se utilizó el análisis de varianza con la prueba de Tukey post
hoc con variables que mostraron diferencias significativas (P <0.05) entre los grupos. Todos los análisis
estadísticos se realizaron con el software SPSS (Chicago, IL, EE. UU.) Versión 18.0.

2.13. Consideraciones éticas

Durante todo el proceso experimental, se respetaron los principios éticos internacionales para la investigación
con animales de laboratorio. Las ratas se mataron por inyección intravenosa de pentobarbital (100 mg /
kg). Este método condujo a una muerte rápida y pacífica, que era aceptable para las ratas según las
recomendaciones para la eutanasia de animales de experimentación. El protocolo fue aprobado por el Instituto
de Ética en Salud de la Universidad Nacional de San Marcos (01414-R-12-UNMSM).

3. Resultados
El extracto de etanol de C. spinosa estaba compuesto predominantemente por compuestos fenólicos y
flavonoides. Las saponinas y los alcaloides también se encontraban en gran cantidad ( Tabla 1 ). El porcentaje
de captación de radical DPPH fue dependiente de la dosis, produciendo una dosis de 1 μg / ml (40,5%) y 50
μg / ml (90,3%, Fig. 1 ). Los parámetros hematológicos de las ratas no mostraron diferencias entre los grupos
( Tabla 2 ). Los parámetros bioquímicos mostraron niveles significativamente disminuidos de SOD, MDA,
NO, CRP y PSA en todos los grupos que recibieron ChS en comparación con el grupo de inductores
(todos P <0,01; Tabla 3).
Los efectos del extracto de C. spinosa sobre la frecuencia de MNPCEs en la sangre periférica de ratas
después del experimento se muestran en la Fig. 3 . El examen del perfil de antimutagenicidad reveló una
disminución significativa en la frecuencia de MNPCE en todos los grupos en comparación con el grupo de
NMU. Todos los grupos tenían un P <0.01.

El peso y el volumen de la glándula prostática fueron más bajos en los grupos que recibieron C. spinosa
en comparación con el grupo inductor. El volumen se redujo significativamente mediante la administración
de extracto de C. spinosa a una dosis de 250 mg / kg ( P <0,05; Fig. 2 ).
Las secciones de glándula prostática teñidas con hematoxilina y eosina del grupo P80 mostraron una
estructura normal. Los tumores del Inductor Group tenían una arquitectura celular alterada, con hipertrofia
celular, hiperplasia glandular y displasia. Se observó que el grupo ChS50 tenía una reducción de las
glándulas, con fibrosis circundante. En el grupo ChS250, hubo coloides y poca hipertrofia. El grupo ChS500
mostró hiperplasia glandular, con células de diferentes tamaños y cápsulas engrosadas ( Fig. 4 ). En el
estudio de citotoxicidad, el extracto etanólico de C. spinosa presentó un índice de selectividad de 17.24
comparado con 0.0037 con 5-FU ( Tabla 4 ).
4. Discusión
NMU, testosterona y ciproterona son agentes inductores del cáncer de próstata. En nuestro estudio, los
animales recibieron ciproterona intraperitoneal, que es un antagonista de la liberación de la hormona
luteinizante. Inhibe los andrógenos testiculares y causa la atrofia de las células epiteliales prostáticas. La
administración subcutánea de propionato de testosterona estimula al máximo la proliferación de células
epiteliales prostáticas, y la NMU ayuda a aumentar el volumen epitelial. 24 La displasia está más relacionada
biológicamente con la transformación maligna de la próstata, y en este estudio, todos los animales que
recibieron los agentes inductores de tumores mostraron una gran cantidad de displasia, especialmente en
grupos que no habían recibido tratamiento. La edad posiblemente influyó en la aparición de displasia como
patrón predominante. 25 En nuestro estudio, las ratas tenían 4 meses (adultos jóvenes), lo que permitió que
sus tejidos respondieran de forma menos agresiva. El patrón histológico encontrado en las ratas a las que se
les dio extracto de etanol de C. spinosamostró hiperplasia discreta con áreas fibróticas y engrosamiento
capsular. La causa subyacente de la fibrosis tisular es típicamente una respuesta inflamatoria
crónica.Recientemente, se aceptó generalmente que la fibrosis ocurre en un espacio confinado, afectando
únicamente el área que rodea inmediatamente el sitio de la lesión. 26 El extracto podría haber generado
fibrosis de acuerdo con estudios histológicos, y esta condición también se ve después de la radioterapia o la
quimioterapia, que ha tenido éxito en el tratamiento de tumores. 27 Administración de NMU con fibrosis
generada por testosterona y modificaciones morfológicas en la próstata. Sin embargo, el extracto podría haber
evitado la progresión del cáncer de próstata, con respecto a su efecto antioxidante y antiinflamatorio
determinado en este estudio.
Los parámetros hematológicos mostraron una tendencia al aumento del nivel de lipoproteínas de alta densidad
y la disminución del nivel de colesterol total en el grupo ChS500 en comparación con los grupos que recibieron
el extracto en dosis más bajas. El efecto hipolipemiante podría influir directamente en el desarrollo del cáncer
porque, en estudios preclínicos, las estatinas mostraron resultados prometedores en el cáncer de páncreas,
hígado, colorrectal y gástrico. Las estatinas afectan la división celular en el cáncer y se expresan en la
inhibición de la proliferación, la inducción de la apoptosis, la autofagia y los efectos antiinvasivos y
antimigratorios. 28 Los grupos que recibieron el extracto mostraron valores significativamente menores de
CRP y NO. La relación entre la inflamación crónica y el desarrollo de tumores fue estudiada por Casado et
al, 7 y mostró una estrecha relación entre la respuesta inflamatoria y la mayor prevalencia de cáncer.
El efecto del extracto de etanol de C. spinosa en la reducción de los niveles de CRP y NO podría deberse a la
presencia de flavonoides, que tienen la propiedad de reducir los mediadores inflamatorios, lo que reduce
significativamente las probabilidades de desarrollar cáncer. 29 Los niveles de MDA y SOD fueron
significativamente más bajos en los grupos tratados en comparación con el grupo inductor. La MDA está
relacionada con el estrés oxidativo y la degeneración oxidativa, que está estrechamente relacionada con la
génesis de las neoplasias y la displasia. Joshy et al 30 encontraron que las especies de oxígeno reactivo son
importantes en la patogénesis del cáncer y las células cancerígenas tienen muchas especies reactivas de
oxígeno que inducen fenotipos malignos, niveles elevados de factor de crecimiento endotelial vascular,
angiotensina-2, interleucina-6, factor de necrosis tumoral α, y disminución de la actividad de SOD y glutatión
peroxidasa. 30
El PSA es un factor determinante del cáncer de próstata y se usa para detectar la progresión de la enfermedad
y monitorear la respuesta al tratamiento. 31 C. spinosaredujo significativamente los niveles de PSA en los
grupos tratados con respecto al grupo de inducción. Esto podría afectar la progresión del cáncer de próstata. El
nivel de MNPCE en sangre periférica fue significativamente menor en los grupos tratados con C. spinosa . La
presencia de fitocompuestos como terpenos, esteroides y flavonoides puede explicar los resultados de acuerdo
con los hallazgos de Casado et al. 7
C. spinosa mostró actividad citotóxica contra la línea celular DU-145, excediendo la actividad de 5-FU. Sin
embargo, la citotoxicidad para la línea celular 3T3 fue menor.También mostró un buen perfil de seguridad al
tener tasas de selectividad por encima de la unidad. De manera similar, el grado de relación dosis-efecto fue
significativo en todas las líneas celulares. El extracto etanólico de C. spinosa presentó un índice de
selectividad de 17.24 comparado con 0.0037 con 5-FU. Los estudios con silimarina mostraron que las
alteraciones en la progresión del ciclo celular podrían ser responsables de su efecto anticancerígeno sobre las
células de carcinoma de próstata DU145. 32 El resveratrol, un polifenol, inhibe el crecimiento del cáncer de
próstata y altera la mitogénesis. Logró una inhibición significativa de la proliferación de células DU-145 y
PC-3. 33
Los grupos tratados con C. spinosa tienen menores volúmenes y pesos debido a que los flavonoides en la
planta producen una mayor actividad de las caspasas 3 y 7 y estos tienen actividad apoptótica.
El efecto preventivo del extracto etanólico de C. spinosa podría estar relacionado con metabolitos secundarios
como taninos, compuestos fenólicos, flavonoides y alcaloides ( Tabla 1 ). Estos metabolitos tienen un efecto
citoprotector. 32 La prueba de capacidad antioxidante in vitro se comparó con trolox y vitamina C, el extracto
de etanol inhibió 90,3% de radical DPPH por 50 μg / ml. Demuestra que la actividad antioxidante in vitro( Fig.
1 ) va junto con el modelo in vivo . Esto puede deberse a que el extracto contiene compuestos fenólicos de
naturaleza flavonoide y ha demostrado su propiedad de secuestrantes de radicales libres mediante la donación
de electrones, reduce la formación de peroxidación lipídica al neutralizar la reacción en cadena en la formación
de especies reactivas de oxígeno. 34
Es importante mencionar que no se encontró un efecto dependiente de la dosis. ChS250 tuvo mejores
resultados en la morfología de la próstata en comparación con ChS50 y ChS500. Este último tiene una mayor
concentración de taninos, lo que podría tener un efecto antinutricional. Forman complejos con componentes
dietéticos y alteran las enzimas digestivas, impidiendo la absorción de otros componentes beneficiosos. 35
Las limitaciones de este estudio incluyeron la falta de determinación de los metabolitos presentes en el extracto
de C. spinosa . Además, su mecanismo exacto del extracto no está claro. Este modelo animal para el cáncer
de próstata se desarrolló en poco tiempo en comparación con otros modelos experimentales in vivo , que
necesitaron hasta un año para mostrar la displasia.
Los datos indican el potencial quimiopreventivo en cáncer de próstata con un alto índice terapéutico de
extracto de Chuquiraga spinosa. Sin embargo, se desconocen los mecanismos completos en los que se basan
estos efectos. Se necesitan más estudios para identificar con mayor precisión las moléculas activas
involucradas en el efecto protector descrito. Teniendo en cuenta las propiedades antiinflamatorias,
antioxidantes, citotóxicas y antigenotóxicas del extracto de C. spinosa , concluimos que tiene un efecto
protector sobre el cáncer de próstata inducido por NMU en ratas.