細胞培養

鄭旗志
細胞培養之醫學應用

Immuno-therapy

Gene therapy

Transfusion medicine

Regenerative medicine
Selection of antitumor medicine
The characteristics of various cells
一.來源區分
( 1).Cell lines (2).Primary cells

二.生長情形區分
1.貼附性 2.懸浮性
( adhesion ) ( suspension )

A549 HL-60
細胞培養室之基本配備

1. 無菌操作台 (Laminar Flow)

2. 5%CO2 培養箱
3. 光學顯微鏡
4. 4℃ 冰箱
5. 37℃ 水浴槽
6. 離心機
7. 液態氮桶
Cell culture incubator
Laminar flow
Microscope Refrigerator

Centrifuger
Water bath
 細胞培養之基本概念:

1、 培養細胞相關資訊之蒐集及閱讀
2、 選用適當之培養基
3、 無菌操作步驟
4、 解凍細胞及細胞之繼代培養
5、 冷凍細胞及細胞之長途運送
6、 細胞培養室之維護
Bioresources Collection and Research Center (BCRC)
American Type Culture Collection (ATCC)
Japanese Collection of Research Bioresources (JCBR)
Culture medium
 RPMI1640
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(DMEM)
 培養基的成分
● Inorganic salts
● Amino acid

● Vitamins

● Others

*Glucose
*Nucleotide
*Pyruvate
*Indicators-phenol red
*pH buffer
 The role of sodium bicarbonate
in culture medium

(1). H2O+CO2 H2CO3 H+ + HCO3-

+
(2). NaHCO3 Na + HCO3-
 List of amino acid
Essential amino acid Nonessential amino acid

Histidine Alanine
Isoleucine Arginine
Leucine Cysteine
Lysine Glutamate
Methionine Glutamine
Phenylalanine Glycine
Threonine Proline
Tryptophan Serine
Valine Tyrosine
Asparagine
Selenocysteine
 Preparation of culture medium
Dissolve medium powder (add sodium bicarbonate)

Adjust pH

Add water to a fixed volume

Filter medium

Prepared medium (basal medium)

+ Serum (heat inactivation)
+ penicillin/streptomycin
Cell culture medium
Cell culture serum

Complete medium
血清的成分
*Protein
*Polypeptides
*Hormones
*Metabolites
*Nutrients
*Minerals
*Inhibitors
*Unknown materials
 血清的功能

*提供必須營養素
*含有許多生長因子和激素
*幫助細胞貼附
*維持培養環境的穩定
 細胞培養之基本概念:

1、 培養細胞相關資訊之蒐集及閱讀
2、 選用適當之培養基
3、 無菌操作步驟
4、 解凍細胞及細胞之繼代培養
5、 冷凍細胞及細胞之長途運送
6、 細胞培養室之維護
1. 無菌操作基本技術，實驗進行前，無菌室及
無菌操作台 (Laminar Flow)以紫外燈照射30-
60分鐘滅菌，以75% ethanol擦拭無菌操作台
面，並開啟無菌操作台風扇運轉數分鐘後，
才開始實驗操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要
物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等
可以暫時放置，其他實驗用品用完即應移出，
以利於氣流之流通。實驗用品以75% ethanol
擦拭後才帶入無菌操作台內。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。
例如勿碰觸吸管尖頭部份或是容器瓶口。
 細胞培養之基本概念:

1、 培養細胞相關資訊之蒐集及閱讀
2、 選用適當之培養基
3、 無菌操作步驟
4、 解凍細胞及細胞之繼代培養
5、 冷凍細胞及細胞之長途運送
6、 細胞培養室之維護
Cell numbers (cells/ml) = counting cell numbers/well * 10-4*dilution
Dead cell

Live cell
Petridish and flask

Plate flask
dish
 細胞培養之基本概念:

1、 培養細胞相關資訊之蒐集及閱讀
2、 選用適當之培養基
3、 無菌操作步驟
4、 解凍細胞及細胞之繼代培養
5、 冷凍細胞及細胞之長途運送
6、 細胞培養室之維護

凍液調配比例 ：
Dewar Cryotube
 細胞培養之基本概念:

1、 培養細胞相關資訊之蒐集及閱讀
2、 選用適當之培養基
3、 無菌操作步驟
4、 解凍細胞及細胞之繼代培養
5、 冷凍細胞及細胞之長途運送
6、 細胞培養室之維護
定期檢測項目:
a. CO2鋼瓶之CO2壓力
b. CO2培養箱之CO2濃度、溫度及水盤
有無污染
c. 濾網定期更換
Primary cell culture
Liver
 肝臟包含幾種細胞群
(1)肝細胞:執行肝臟代謝解毒的功能

(2)Stellate cell:儲存維他命A

(3)竇狀隙內皮細胞(sinusoidal endothelial cells)

:連結循環血液與肝細胞

(4)kupffer cell :肝臟組織中的巨噬細胞

 CELL TYPES & ARRANGEMENT OF LIVER
Fenestrated Endothelial cells

SINUSOID Kupffer cell

Stellate cell
Hepatocytes in plates

Bile canaliculus
SPACE OF DISSE
Microvilli

HEPATOCYTE ENDOTHELIAL CELL KUPFFER CELL STELLATE CELL

 Perfusion

Liver
Cut and fragment the liver tissue into beaker

Digest

Filtered and add equivalent medium to discontinue digest

Centrifuge

Collect the pellet and mix gently then poured into plate

The cells will incubate at incubator

 細胞培養常見問題
(1). 冷凍管應如何解凍?

(2).細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO?

(3).可否使用與原先培養條件不同之培養基或血清？

(4).何謂FBS, FCS, CS, HS?

(5).細胞培養時應使用多少濃度的CO2?

(6).何時需更換培養基？

(7).培養基中是否需添加抗生素？
(8).如何繼代附著性的細胞及懸浮性的細胞？

(9).冷凍保存細胞的方法。

(10).冷凍保存細胞時，冷凍管內需有多少細胞濃度？

(11).如何避免細胞污染？

(12).培養過程中造成微生物污染的種類與處理方式

(13).如何判別細菌污染？

(14).如何判別真菌（黴菌）污染？

(15).黴漿菌污染的細胞是否能用肉眼看出異狀？
(16).黴漿菌污染會對細胞培養有何影響？

(17).偵測出有黴漿菌污染時應如何處理？

(18).細胞培養箱之水盤該如何清理？

(19).為何培養基保存於冰箱中，顏色會偏暗紅，
pH值會越來越高？

(20).不同品牌的培養盤對細胞培養是否有差異？

(21).冷凍管解凍後，細胞數偏少的原因。

(22).冷凍管解凍後，細胞死亡率高，存活率不佳的原因。
細胞培養常見之問題與回答(一)
細胞培養常見之問題與回答(二)
細胞培養常見之問題與回答(三)
細胞培養常見之問題與回答(四)
 教教學研究部細胞培養共同實驗室使用申請表
申請日期： 年 月 日
單位
申請者姓名
職稱
單位主管簽章
研究內容
使用期限 自民國 年 月 日至 年 月 日
**使用期限以一年為上限，續借得重新申請**
實驗室借用者同意：
1. 在實驗室使用日誌上簽名
2. 遵守儀器使用規則，以維持儀器正常運作。
3. 除非經過管理者(徐士蘭，分機4037/ 謝淑鐘, 分機4037)同意，不任意移動實驗室儀器。
4. 管理者得應實驗需要同意移入相關儀器。移入實驗室之儀器，一律視為公用。
5. 儀器若有損壞，立即告知管理者。
6. 維持儀器與實驗室整潔。
7. 不惡意佔用儀器與空間
8. 若有違反以上條例經查屬實，教研部依情節輕重，可隨時取消實驗室使用權

實驗室使用者簽名______________________ 年 月 日
實驗室負責主管簽章____________________ 年 月 日
教學研究部主任簽章____________________ 年 月 日
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