El Staphylococcus aureus es una bacteria anaerobia, grampositiva, que es capaz

de producir coagulasa y catalasa. Esta bacteria puede provocar una amplia gama
de enfermedades que van desde infecciones cutáneas hasta enfermedades de
riesgo vital.
El Staphylococcus aureus (también conocido como estafilococo áureo o
estafilococo dorado) es una bacteria anaerobia (no utiliza oxígeno en su
metabolismo), grampositiva, que es capaz de producir coagulasa y catalasa.
Esta bacteria está ampliamente distribuida por todo el mundo y puede producir una
amplia gama de enfermedades que van desde infecciones cutáneas y de las
mucosas a otras como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis. En algunos casos
pueden llegar a producir enfermedades de riesgo vital como celulitis, abscesos
profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.
Las infecciones cutáneas provocadas por Staphylococcus aureus se caracterizan
por la aparición de una zona roja, hinchada y dolorosa en la piel. Dicha lesión
cutánea puede llegar a drenar pus y otros líquidos además de lucir como un
forúnculo. Estos síntomas tienen mayor probabilidad de ocurrir cuando la piel ha
sido cortada o frotada.

La infección por Staphylococcus aureus en centros hospitalarios se caracteriza por

ser más grave ya que el patógeno puede llegar al torrente sanguíneo, el corazón,
los pulmones u otros órganos, la orina o a un área donde se haya realizado una
cirugía reciente
Los seres humanos son un reservorio natural de S. aureus. Entre el 30 y el 50% de
los adultos sanos están colonizados, y entre el 10 y el 20% se mantienen
colonizados persistentemente. Esta bacteria forma parte de la microbiota normal del
ser humano y tiene colonización selectiva de narinas (20-40%, en adultos), pliegues
intertriginosos, perineo, axilas y vagina, no obstante, las personas colonizadas
tienen un riesgo mayor de sufrir infecciones.
La importancia está en el mejoramiento del ambiente intrahospitalario, que abarca
la mejora de la salud para todo el centro hospitalario.
Abstracto
En un esfuerzo para frustrar los patógenos bacterianos, anfitriones a menudo limitan
la disponibilidad de nutrientes en el sitio de la infección. Esta limitación puede alterar
las abundancias de metabolitos clave a los que factores reguladores responden,
ajustando el metabolismo celular.
 En los últimos años, un número de proteínas y ARN han surgido como importantes
reguladores de la expresión del gen de virulencia. Por ejemplo, la proteína CodY
responde a niveles de aminoácidos de cadena ramificada y GTP y es ampliamente
conservada en bajo de G + C bacterias Gram-positivas. Como un regulador global
en Staphylococcus aureus, Cody controla la expresión de la virulencia y de genes
metabólicos decenas. Se postula que el S. aureus utiliza Cody, en parte, para alterar
su estado metabólico en un esfuerzo para adaptarse a las condiciones de nutrientes
limitantes potencialmente encontradas en el entorno de acogida.
Este manuscrito describe un método para la extracción y el análisis de metabolitos
a partir de S. aureus utilizando cromatografía líquida acoplada con espectrometría
de masastrometry, un protocolo que fue desarrollado para probar esta hipótesis.
El método también destaca las mejores prácticas que garanticen el rigor y la
reproducibilidad, tales como mantener el estado de equilibrio biológico y aireación
constante y sin el uso de cultivos continuos quimiostato.
Con relación a la USA200 susceptibles a la meticilina de S. aureus aislar UAMS-1
cepa parental, la isogénica mutante Cody exhibió incrementos significativos en
aminoácidos derivados de aspartato (por ejemplo, treonina e isoleucina) y
disminuye en sus precursores (por ejemplo, aspartato y O -acetilhomoserina ).
Estos hallazgos se correlacionan bien con los datos de la transcripción obtenidos
con el análisis de RNA-seq: genes en estas vías fueron reguladas entre 10 y 800
veces en el mutante nulo Cody.
El acoplamiento de los análisis globales del transcriptoma y el metaboloma puede
revelar cómo las bacterias alteran su metabolismo cuando se enfrentan a estrés
ambiental o nutricional, proporcionando una visión potencial en los Physcambios
IOLÓGICA asociados con el agotamiento de nutrientes experimentaron durante la
infección.
Tales descubrimientos pueden allanar el camino para el desarrollo de nuevos
agentes antiinfecciosos y la terapéutica.

Protocolo

1. Preparación de tampón Soluciones

1. Prepare la solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) mediante la dilución de
una solución madre de 10x PBS a una concentración final de 1x con ultrapura (destilada y
desionizada) agua.
2. Preparar la solución de temple mediante la combinación de 2 ml de acetonitrilo, 2 ml de
metanol, 1 ml de ultrapura H 2 O, y 19! L (0,1 mM concentración final) de ácido fórmico.
3. Prepare LC-MS disolvente A mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de
concentración final) a agua ultrapura.
4. Preparar LC-MS disolvente B mediante la adición de ácido fórmico (0,2% [v / v] de
concentración final) a acetonitrilo.
NOTA: Todas las soluciones deben prepararse usando los reactivos de la más alta pureza
disponible (generalmente de alto rendimiento de grado de cromatografía líquida). Las
soluciones deben prepararse fresco antes de cada experimento y se almacenan en hielo
antes de su uso.

2. Establecimiento de Crecimiento S. aureus en estado estacionario

1. Nodriza de S. aureus cepas de interés para el aislamiento en agar tríptico de soja (TSA)
de un stock de glicerol congelado. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h.
2. Inocular 4 ml de caldo de soja tríptico (TSB) u otro medio adecuado en tubos de
incubación de vidrio estériles con colonias individuales de cada cepa. Incubar inclinada (~
70 ° de ángulo) con rotación a 60 revoluciones por min (rpm) a 37 ° C durante 16-20 h.
NOTA: cultivos de una noche son propensos a gradientes de oxígeno cuando se usan
métodos estándar, incluyendo los descritos en el paso 2.2, que afectan a la fisiología
celular. Por lo tanto, emplear una estrategia de back-dilución múltiple para asegurar el
estado de equilibrio biológico (véanse los pasos 2.4-3.2, a continuación).
3. Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica de los cultivos de la etapa 2.2 a
600 nm (OD 600).Usar medio estéril como una referencia óptica (en blanco). Diluir estas
células a un OD 600 de 0,05 en 50 ml de medio TSB estéril (previamente calentada a 37 °
C) en separada, matraces de 250 mL DeLong.
4. Incubate los cultivos a 37 ° C en un baño de agua con agitación a 280 rpm.
5. Cada 30 min, tomar OD 600 mediciones; a medida que aumentan las densidades ópticas,
puede ser necesario diluir los cultivos con TSB para que permanezcan dentro del rango
de absorbancia lineal del espectrofotómetro.
6. Cuando los cultivos de la etapa 2.5 a alcanzar un OD 600 de ~ 0,8-1,0, subcultivo ellos en
50 ml de 37 ° C TSB a un OD 600 de 0,01-0,05 y repita los pasos 2.4 y 2.5.

3. Configuración de la muestra Colección

1. Preparar un lecho de hielo seco triturado en un recipiente apropiado (por ejemplo, el plato
de cristal, cubo de hielo, o más fría).
2. A medida que las densidades ópticas de los cultivos se aproximan al punto de cosecha se
desea, añadir 1 ml de solución a un 35 mm sin tratar placa de Petri y pre-enfriar en hielo
seco temple para ≥5 min.
NOTA: El "punto de cosecha deseada" variará en función de los objetivos experimentales.
Por ejemplo, si uno fuera a examinar metabolites durante el crecimiento aeróbico,
indicadores clave de este estado incluyen la excreción de etilo y re-asimilación del acetato
durante la fase de crecimiento post-exponencial 32, 33. En general, este punto debe estar
dentro de una etapa de crecimiento específico (por ejemplo, fase exponencial). Los
 específicos OD 600 valores asociados con esta fase pueden variar entre las diferentes
cepas bacterianas y medios de cultivo.
3. Coloque una frita de filtro de acero inoxidable (enfriado previamente a -20 ° C) en un
tapón de goma y colocarlo encima de un frasco de vacío unido a un vacío de la casa o
bomba de vacío.
4. Aplicar el vacío y colocar una membrana de éster de celulosa mixto (0,22 tamaño micras
de poro) en la parte superior.
NOTA: Es crítico utilizar un filtro con un diámetro igual a la de la frita y para centrar
correctamente este filtro para asegurar que la muestra se extrae a través del filtro en lugar
de sobre el borde. La humectación de la membrana con enfriado con hielo, H 2 O estéril
puede ayudarCon el posicionamiento de la membrana.

4. La muestra de la cosecha

1. A una OD 600 de ~ 0,4-0,5, utilizar una pipeta serológica para eliminar 13 ml de cultivo del
matraz y para aplicar la muestra al filtro.
2. Después de toda la muestra se ha filtrado, lavar inmediatamente el filtro con ≥5 ml de PBS
enfriado en hielo para lavar metabolitos asociados medianas.
3. Desconectar el vacío y el uso de un par de pinzas estériles para quitar el filtro de la frita.
Invertir el filtro (-células hacia abajo) en la solución de enfriamiento rápido pre-enfriada.
Nota: Es importante realizar los pasos anteriores rápidamente (es decir, en cuestión de
segundos) y tan pronto como el líquido se ha eliminado para asegurar el enfriamiento
rápido de las células, la detención de la actividad metabólica.
4. Incubar el filtro en una solución de enfriamiento rápido en hielo seco durante ≥20 min.
5. Utilizando pinzas estériles, invertir el filtro (lado celular up) en la placa de Petri y el uso de
una micropipeta para enjuagar las células fuera de tél membrana en la solución de
enfriamiento rápido.
6. Resuspenden las células en solución de enfriamiento rápido y luego transferir la
suspensión celular a un tubo de 2 ml resistente a los impactos estéril que contiene ~ 100!
L de perlas de sílice 0,1 mm. Almacenar esta en hielo seco o a -80 ° C.

5. Extracción de metabolitos

1. Descongelar las muestras en hielo húmedo y romper las células en un homogeneizador

con cuatro 30 s ráfagas a 6.000 rpm, con 2 min periodos de enfriamiento en hielo seco
entre ciclos.
2. Aclarar los lisados durante 15 minutos en un pre-refrigerado, de microcentrífuga
refrigerada a la velocidad máxima (es decir, 18.213 xg en ≤4 ° C).
3. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
4. Usando una micropipeta, transferir una pequeña porción de la muestra a un tubo de
microcentrífuga para la cuantificación del contenido de péptido residual en el paso 6;
almacenar el resto a -80 ° C.
NOTA: El volumen de muestra reservado varía, dependiendo del ensayo BCA utilizado en
la etapa 6.1. Estamuestra debe ser almacenado en hielo húmedo para su análisis
inmediato o se congeló a -80 ° C.
 6. del ácido bicinconínico (BCA) Ensayo

1. Realizar un ensayo de BCA como se recomienda por el fabricante del kit, usando
muestras procedentes de la etapa 5.4 para determinar la concentración de péptido
residual para cada muestra.

7. LC-MS

1. Mezclar 75 l de extracto de S. aureus con 75 l de LC-MS disolvente B, preparado en la

etapa 1.4.
2. Vórtice para mezclar y centrifugado a 13.000 xg durante 5 min.
3. Coloque 100 l de sobrenadante en un vial de cromatografía líquida (LC) y la tapa él.
Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en la muestra.
4. Cargar los viales en el inyector automático LC-MS y LC editar la lista actualizada en
el software "Desconectado lista de trabajo Editor".
1. Rellene la "Nombre de ejemplo" (por ejemplo, de tipo salvaje-1), "Posición de
ejemplo" (por ejemplo, P1-A1), "método" (por ejemplo, fórmico Acid-Negativo Método),
y (por ejemplo, de tipo salvaje-1) columnas "del archivo de datos". Haga clic en el botón
en el botón "Guardar lista de trabajo". Abra el software de "Espectrometría de Masas de
adquisición de datos de estaciones de trabajo" y la entrada de la lista de trabajo
previamente guardado. Haga clic en el botón "Inicio Lista de trabajo Ejecutar" para iniciar
la medición continua de LC-MS.
5. Separar las muestras en una columna, la columna vincular a un tiempo de vuelo
espectrómetro (TOF), y acoplar el espectrómetro de TOF con el sistema LC. Utilice un
gradiente de fase móvil de la siguiente manera: 0-2 min, 85% de disolvente B; 3-5 min,
80% de disolvente B; 6-7 min, 75% de disolvente B; 8-9 min, 70% de disolvente B; 10-
11.1 min, 50% de disolvente B; 11,1 a 14 min, 20% de disolvente B; y 14,1 a 24 min, 5%
de disolvente B; terminar con un período de re-equilibrado de 10 min a 85% de disolvente
B y un caudal de 0,4 ml min -1.
6. El uso de una bomba isocrática, infundir una solución masa de referencia con la
carrera para permitir la calibración del eje masa simultánea.
NOTA: Este pasose basa en el manual de espectrómetro de TOF estándar.
1. Usar la mezcla de ácido acético y D4 hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxi) fosfazina
como la solución masa de referencia para realizar la calibración en tiempo real. Utilice la
bomba isocrática con la velocidad de flujo de 2,5 ml min-1 durante la infusión.

8. lotes Corrección de Counts Ion

1. Designe a cualquier muestra para servir como una muestra de referencia para la
corrección por lotes (por ejemplo, de tipo salvaje, replicar 1).
2. Calcular la suma de los recuentos de iones para todos los metabolitos dentro de la
muestra de referencia. Repetir este cálculo para todas las muestras.
3. Divida el recuento de iones total de cada muestra por el recuento total de iones de la
muestra de referencia para generar una relación.
4. Divida el recuento de iones para cada metabolito dentro de una muestra por la relación de
muestra / referencia para obtener un recuento de iones lote corregido para cada
metabolito.

9. Péptido Normalización
reivide los valores de recuento de iones de lote corregido para cada muestra obtenida en la
etapa 8 por la concentración de péptido determinado con el ensayo de BCA en el paso 6
para producir un valor normalizado para cada metabolito.
NOTA: Los recuentos de iones, corregido por lotes por lotes normalizados para cada
metabolito obtenido en la etapa 9.1 se puede comparar directamente entre cepas y se
sometió a análisis estadístico (por ejemplo,una U de Mann-Whitney-test). Alternativamente,
un metabolito conocido de ser sin cambios, ya sea por el tratamiento o fondo genético puede
ser utilizado como un normalizador para detectar cambios debidos a la metabolito
descomposición. La inclusión de una cantidad conocida de L-norvalina o ácido gluraric en
el tampón de extracción se puede utilizar para corregir la pérdida durante el procesamiento
de la muestra

Resultados

Hemos analizado piscinas de metabolitos intracelulares en S. aureus durante el

crecimiento in vitro en un medio rico y complejo. Como prueba de principio, se
compararon los perfiles de metabolitos entre el S. osteomielitis aureus sensible a la
meticilina aíslan UAMS-1 (de tipo salvaje [WT]) y una cepa isogénica que carece
del regulador global transcripcional CodY (Δ Cody).

El estado de equilibrio, se establecieron cultivos exponenciales de las cepas WT

y Cody en medio TSB, como se describe en el paso 2 del protocolo.

El comportamiento de crecimiento de la de tipo salvaje y mutantes culturas Cody -

null fueron similares, con sólo diferencias leves en el rendimiento de crecimiento y
la tasa (Figura 1).

Utilizando la tecnología de microarray RNA-Seq y, nosotros y otros reveló que varios

genes que codifican para enzimas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos
derivados de aspartato se de-reprimidos en el Cody -null mutante compared para
células WT durante el crecimiento in vitro en TSB (Figura 2).

Por otra parte, brnQ1 y brnQ2, que codifican para permeasas de aminoácidos de
cadena ramificada, se sobreexpresa en el mutante nulo codY.

Para determinar el grado en que el estado estacionario abundancias intracelulares

de metabolitos asociados con esta vía se alteran en el mutante nulo, se realizó
metabolito de perfiles basada en LC-MS. Células mutantes nulos WT y codY- se
hicieron crecer hasta el estado de equilibrio biológico y se tomaron muestras como
se describe en el paso 4 del protocolo.
Se determinó la abundancia de metabolitos mediante la integración del área del pico
de iones de intensidad para cada metabolito cromatográficamente resuelto usando
un paquete de software de análisis (ver Lista de Materiales). Hemos corregido para
ver diferenciaserences en la biomasa por la normalización de las abundancias de
metabolitos a la concentración de péptido residual de cada muestra. Hemos
corregido aún más estos valores para posibles efectos de lote entre las muestras
mediante el cálculo del recuento medio de iones para todos los metabolitos dentro
de cada muestra y mediante el uso de la muestra de tipo salvaje como el valor de
referencia.

Este enfoque permitió las comparaciones entre la muestra de la abundancia de

metabolitos a través de condiciones. Comparaciones Inter-metabolitos dentro de
una muestra dada de manera similar se puede lograr mediante la conversión
primero abundancias de metabolitos normalizados de los recuentos de iones a
molar cantidades utilizando el método de adición estándar.

Hemos comparado los niveles de intermedios clave en la vía de aspartato en UAMS-

1 y su mutante nulo codY-.Como se ve en la Figura 3, los productos finales de esta
vía (por ejemplo, treonina y (iso) -leucina) son más abundantes en las células
mutantes Cody -null, mientras que los precursores (por ejemplo,aspartato y O -
acetil homoserina) son más abundantes en las células WT.

La regulación por incremento combinado de BrnQ permeasas 36 y la ruta biosintética

ILV probable conduce a aumentos en la isoleucina y leucina 30. Aunque las
diferencias son relativamente pequeñas (<4 veces), LC-MS-basado cuantificación y
corrección lote revelan cambios robustos y estadísticamente significativas que son
consistentes con alteraciones transcripcionales mediadas por Cody.