DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

I. OBJETIVO:
- Determinar l actividad enzimática de una amilasa extraída de trigo
germinado, usando almidón residual
- Determinar la actividad específica de la amilasa vegetal.

II. MARCO TEORICO:

Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la energía de
activación de las reacciones metabólicas, por lo que aumentan la velocidad,
y permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que
normalmente no tendrían lugar. En una curva de saturación de una reacción
enzimática, al inicio, la velocidad permanece constante denominándose
velocidad inicial (Vo), la cual va disminuyendo hasta llegar a un plateau que
da a conocer una saturación de la enzima por el sustrato.
AMILASA:
Cataliza la hidrólisis al azar los enlaces -1,4 glucosidicos de la región central
de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las moléculas
cercanas a la ramificación, obteniendo como resultado maltosa y
oligosacáridos de varios tamaños. La actividad de la enzima se determina
cualitativamente mediante la disminución de la capacidad de la solución de
almidón para formar el color azul característicos con el yodo o midiendo la
disminución de la viscosidad de la suspensión de almidón.
La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la
ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores
(endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce
como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,
acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa.

ALMIDON DE CEBADA:
El almidón es un polímero semicristalino de glucosa de gran abundancia en
la naturaleza. La cantidad de almidón contenido en el grano de cereal varia,
pero generalmente oscila entre el 60 y 75 % del peso del grano. El almidón
presente en los granos es el más importante de los carbohidratos para fines
industriales resultando preciso degradarlo enzimáticamente con una 1
gelatinización previa por acción de calor o sometiéndolo a un intenso
trabajo mecánico. El almidón consta de dos fracciones: amilosa y
amilopectina.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General
 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

III. MATERIALES:

Equipos:

- Estufa
- Espectrofotómetro

Materiales y reactivo:

- Germinados: trigo y cebada

- Solución de almidón 0.1%
- Ácido clorhídrico 0.5N
- Lugol
- Reactivo de Biuret
- Tubos de ensayo
- Embudos
- Mortero
- Pipetas de 1,5,10 ml

IV. PROCEDIMIENTO:
- Extracción de la amilasa:

1 2

Germinar 50 semillas de trigo Triturar las semillas,

y cebada por 3 dias. adicionando 10 ml de buffer
2
+ cloruro de calcio

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

Filtrar en gasa o algodón.

- Demostración de la actividad enzimática: armar el siguiente sistema.

ALMIDON
ALMIDON RESIDUAL
TUBOS (ml) INICIAL
I II III IV
SUSTRATO 1.0 1.0 1.0 1.0
Incubar: 30°C – 5 min.
EXTRACTO DE ENZIMA --- 0.1 0.2 0.3
Incubar: 30°C – 15 min.
ACIDO CLORHIDRICO 0.5N 1.0 1.0 1.0 1.0
Reposar: T. ambiente – 5 min.
AGUA DESTILADA 9.9 9.8 9.7 9.6
LUGOL 0.5 0.5 0.5 0.5

Medir las absorbancias después de 5 min a 6.20nm

- Determinación de la actividad específica:

Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el
reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema:

TUBO (ml) I II III IV

Preparado enzimático --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0
3

Mezclar e incubar por 30 min a 37°C.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

V. CALCULOS Y RESULTADOS:
- Determinación de la actividad enzimática:

ABSORVANCIA
N° TUBO
TRIGO CEBADA
I 0.872 0.063
II 0.526 1.197
III 1.860 1.587
IV 3.054 2.792

CALCULO: Determinar la concentración del almidón (mg/ml) multiplicando

la absorbancia por el factor de calibración. Obtener el promedio

Concentración (mg/ml)
N° TUBO
TRIGO CEBADA
I 8.72 0.63
II 5.26 11.97
III 18.60 15.87
IV 30.54 27.92
Promedio 18.13 18.59

CALCULO: Calcular Las Unidades De Enzima (U) De La Siguiente Forma.

N° TUBO Unidad enzimática (mg/min)

TRIGO CEBADA
I 0.5810 0.0420
II 0.3507 0.7980
III 1.2400 1.0580
IV 2.0360 1.8613
PROMEDIO 1.2089 1.2391

CALCULO: Determinar mg de proteína /ml = absorbancia x factor

N° TUBO Proteína (mg/ml)

TRIGO CEBADA
I 8.72 0.63
II 5.26 11.97
4
III 18.60 15.87
IV 30.54 27.92
Promedio 18.13 18.59

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

CALCULO: determinar la actividad específica de la siguiente manera.

𝒖𝒏𝒊𝒅𝒂𝒅𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒆𝒏𝒛𝒊𝒎𝒂
𝑨𝑬 =
𝒎𝒈 𝒅𝒆 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂

ACTIVIDAD ENZIMATICA
N° TUBO
TRIGO CEBADA
I 0.06662844 0.06666667
II 0.066673 0.06666667
III 0.06666667 0.06666667
IV 0.06666667 0.06666547

- ELABORA UN DIAGRAMA DE FLUJO DE LA OBTENCION DE LA AMILASA

50 Semillas de trigo TRIRUTAR (Mortero)

Buffer: 10 ml
Cloruro de Calcio AGREGAR

Buffer: 10 ml
Cloruro de Calcio FILTRAR (Embudo + gasa)

AMILASA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

VI. DISCUSION:

(Almonte, 2010) La alfa-Amilasa se encuentra ampliamente distribuida en el

reino vegetal, particularmente en las semillas con reservas de hidratos de
carbono como el trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en forma
pura. Su peso molecular es alrededor de 60.000, esta se secreta al
endospermo amiláceo de las semillas de cereales por dos tejidos, el
cotiledón y la capa de aleurona, degradando las macromoléculas de amilosa
y amilopectina en pequeños fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa.

(Barbado, 2001) La amilosa se colorea de azul en presencia de yodo, debido

a la absorción o fijación del yodo en la superficie de la molécula de amilosa,
lo cual solo ocurre en frio. Es conveniente aclarar que este proceso no es
una reacción química, ya que no se producen sustancias nuevas, como
reactivo para identificar el almidón se usa una solución denominad lugol.

(Lopez, 2006) La prueba del Lugol se realiza para identificar la presencia de

polisacáridos, si después de añadir los digeridos a los tubos de lugol se
observa que tiene un color azul, eso significa que hay presencia de almidón
por lo tanto la reacción no tuvo lugar, por otro lado, si la reacción da un
color amarillo intenso, eso quiere decir que no hay presencia de almidón,
por lo tanto, hay si tuvo lugar la actividad de la enzima.

(Foster,1998)La amilasa es una de las enzimas más estudiadas debido a su

rol de degradación del almidón, ya que permite una germinación de las
semillas, el cual es degradado por los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa)
en diferentes dextrinas, que debido a su disminución en tamaño puede ser
hidrolizada por la B-amilasa, sin embargo la α-amilasa es una enzima que se
encuentra regulada tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la
temperatura y el pH, además posee un peso molecular de 50 Kda
aproximadamente .La germinación se lleva con la hidratación y posterior
liberación de giberelinas, las cuales inducen la síntesis de las enzimas
hidrolíticas, que hidrolizan el almidón que se encuentra el endosperma, 6
produciendo glucosa que es transportada por difusión, para generar energía.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

VII. CONCLUSIONES:

Logramos determinar la actividad

enzimática en las dos experiencias
realizadas con semillas germinadas de trigo
y cebada, en los cuatro tubos pudimos
notar la formación de anillos y también la
formación de precipitado en pequeñas y
grandes cantidades.

Identificamos y obtuvimos de los índices de absorbancia con la ayuda del

espectrofotómetro en el caso del trigo fueron de 0.872; 1.860 entre otros y en
el caso de la cebada fueron de 0.063; 1.587, estos datos nos indican un
comportamiento similar de la actividad enzimática en ambas semillas.

Logramos determinar la actividad específica del preparado enzimático del trigo,

y esto lo pudimos notarlo por la formación de anillos de color anaranjado
oscuro y de color azul fuerte que se presento en el primer tubo.

Aprendimos el procedimiento que se debe utilizar para extraer la amilasa de

vegetales, en nuestro caso fue con las semillas de trigo y cebada, donde
utilizamos las raíces de las semillas adicionadas con reactivos que permitieron
obtener el preparado enzimático para trabajar.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

VIII. CUESTIONARIO:

CUESTIONARIO
1.- En la síntesis de arginina a partir de acido glutámico se observaron las
siguientes reacciones

1 2 3 4
Glu ------ N ac. Glu ------ Orn ------ Cit ------ Arg

Siendo 1, 2, 3,4 enzimas

Indica cuales son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

2.-Por que se sometieron las raicillas del cereal a un proceso físico y químico en el
proceso de extracción?

El proceso de extracción se basa en la

obtención de amilasa, por lo que es
necesario que las raicillas de los cereales
sufran un proceso físico donde se van a
fragmentar en pedazos más pequeños con
la ayuda de un mortero pero aun así siguen
conservando su naturaleza, luego se da el
proceso químico donde se va a filtrar la
parte liquida que seria la amilasa de las
semillas con la ayuda de una gasa ,luego a este extracto se le van agregando una
seria de reactivos lo cual permitirán transformarla en un preparado enzimático
para posteriormente utilizarla en diferentes pruebas.

3.- Si se te da una solución que supuestamente contiene una enzima, ¿Cómo

determinarías en la solución la presencia de una enzima que cataliza la hidrolisis
de almidón?

Para determinar la presencia de una enzima en una solución y a la vez observar

que cataliza la hidrolisis de almidón solo se podría lograr a través de una vía ,la cual
consiste en agregar reactivos que permitan evidenciar tal presencia como es el
caso del lugol , además porque mientras el
color de la mezcla sea mas intenso significa
que la actividad enzimática que ejerce la
amilasa sobre el almidón será un poco mas
baja , además también la podemos notar ya
que en la solución se va a observar la
formación de anillos en la parte superior de
dicho liquido o sustancia.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

4.- Represente mediante un flujograma el proceso de extracción de una amilasa de una

fuente diferente a la utilizada en práctica.

Agua LAVADO Cascarilla

RALLADO

Agua TAMIZADO Afrecho

SEDIMENTACION Mancha de agua

FERMENTACION

SECADO SECADO

Almidón nativo Almidón agrio 10

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General

 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

5.- Como se puede incrementar la actividad específica de una enzima?

La actividad específica de las enzimas se calcula dividiendo la actividad enzimática (por

ejemplo; U/mL) entre la concentración de proteínas (mg/mL). El resultado final indica la
cantidad de enzima por milígramos de proteínas presente. Se supone que si purificas la
enzima normalmente la actividad específica de la misma debe aumentar, ya que la
proporción de enzima del total de las proteínas presentes debe también irse
incrementando. A veces esto no ocurre. En ese caso debe revisar el procedimiento otra
vez ya que algo puede estar saliendo mal. Por ejemplo, que se desnaturalice la enzima en
el proceso de purificación por empleo de algún solvente o pH o fuerza iónica inadecuada.
También debe tener en cuenta si la proteína en milimétrica, ya que la pérdida de una
subunidad puede reducir significativamente su actividad.

IX. BIBLIOGRAFIA:
 Foster, N; Burchett, L and Paulsen, Bioquimica,Editorial Reverte,
Espana,G. 1998.
 Benech-Arnold, R. and Sanchez,Biologia de las Plantas,Primera
Edicion,Editorial Bermejo . 2004.
 Almonte.Carlos,Manual de Quimica Organica,Quinta Edicion, 2010.
 Barabado.Oscar,Microbiologia Alimentaria,Tercera Edicion,2001.

11

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA | Laboratorio de Bioquímica General