LABORATORIO DE BIOQUÍMICA HIDROLISIS ENZIMATICA DE LAS PROTEINAS

LABORATORY OF BIOCHEMISTRY ENZYMATIC HYDROLYSIS OF PROTEINS

Giovanny Gomajoa Ruiz Cod: 100200412018; Keren López Romero Cod: 100200342018; Walter Fabián Muchavisoy
Cod: 100200042018

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

FACULTDAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA N° 4
MEDICINA PRIMER SEMESTRE
13 DE JUNIO DE 2018

Objetivos:
- Simular la digestión de proteínas en el intestino
- Comprobar la acción enzimática de la pancreatina sobre una proteína
- Calcular la actividad de la enzima
- Identificar cualitativamente los productos de la hidrólisis de las proteínas

Marco Teórico:
La mayoría de los aminoácidos ingeridos en la dieta, se hallan principalmente en
forma de proteínas. Los aminoácidos sólo pueden incorporarse a las rutas
metabólicas en forma libre por ello, las proteínas y péptidos ingeridos en la dieta,
son hidrolizados primeramente por enzimas proteolíticas en el tracto intestinal.
Estas enzimas son secretadas por el estómago, páncreas e intestino delgado.
La digestión de proteínas comienza en el estómago. La entrada de proteínas al
estómago estimula la secreción de gastrina, la cual a su vez estimula la formación
de HCl; esta acidez actúa como un antiséptico y mata a la mayoría de los entes
patógenos que ingresan al tracto intestinal. Las proteínas globulares se
desnaturalizan a pHs ácidos, lo cual ocasiona que la hidrólisis de proteína sea más
accesible.
En el estómago, la pepsina de una sola cadena, es secretada en forma de su
zimógeno, el pepsinógeno (MW 40kD) por las células de la mucosa gástrica. El
pepsinógeno se convierte en pepsina por el corte (catalizado por la misma enzima)
de 42 residuos del extremo amino-terminal, proceso que es favorecido por el pH
ácido del jugo gástrico. La pepsina no es muy específica, hidroliza los enlaces en
los que intervienen aminoácidos aromáticos, aunque también lo hace donde hay
Met y Leu. Los productos de la catálisis de esta enzima son péptidos de tamaño
variable y algunos aminoácidos libres. A este tipo de proteasa, se le denomina
endopeptidasa para diferenciarla de las enzimas que cortan desde cualquiera de los
extremos de la cadena que se denominan exopeptidasas.
}
A medida que los contenidos ácidos del estómago pasan al intestino delgado, se
dispara la síntesis de la hormona secretina a la sangre. Esta enzima estimula al
páncreas para secretar bicarbonato en el intestino delgado para neutralizar el pH
alrededor de 7.0. La entrada de los aminoácidos en la parte superior del intestino
(duodeno) se libera la hormona colecistocinina, que estimula la liberación de
muchas enzimas pancreáticas cuya actividad catalítica se realiza entre 7 y 8
unidades de pH. El jugo pancreático secretado al intestino delgado aporta los
zimógenos de tripsina, quimotripsina, tripsinógeno, carboxipeptidasas A y B y
elastasa.

Materiales:

Nota: Los estudiantes deben comprar pancreatina-simeticona (se consigue en

las droguerías). Es suficiente con una tira (10 pastillas) para todos los grupos.

-Solución de proteínas (gelatina al 5%)

-Solución de pancreatina (0.5% en buffer de borato pH 8.4)
-Solución de formaldehido
-Solución de NaOH 0.05N
-Fenolftaleína
-Ninhidrina
-Tubos de ensayo
-Buretas
-Erlenmeyers de 125 ml 2 por grupo
-Ppeta aforada de 5 ml
-probetas
-Baño de María uno para cada grupo
-Mechero para cada grupo
-Beaker de 500 ml por grupo

Procedimiento:

a. Tomar 1 ml de la solución de gelatina y adicionarle 0.5 ml del reactivo de

ninhidrina. Colocarlo durante 5 minutos al baño de María y observar.

b. Medir 30 ml de solución de proteína y colocarla en un erlenmeyer de 125 ml.

Adicionar 5 ml de pancreatina (tomar este tiempo como tiempo cero t0) colocarlo en
un baño de maría a 37°C.

c. Transferir 5 ml de la solución (b) y calentarla hasta ebullición. Esperar 2 minutos

y enfriarla.

d. Agregar 7.5 ml de solución de formaldehido y adicionar 3 gotas de fenolftaleína.

e. Titular con la solución de NaOH 0.05N hasta obtener una coloración rosa pálido
permanente. Anotar los ml de NaOH utilizados.

f. A partir del tiempo t0 contar 15, 30, 45 y 60 minutos. Tomar en cada intervalo 5 ml
de mezcla original y repetir el procedimiento descrito en los numerales (c), (d) y (e).
g. A 2 ml de la solución de gelatina sobrante adicionarle 1 ml del reactivo de
Ninhidrina y colocarlo en el baño de María. Observar y anotar los resultados.

PREGUNTAS

1. Grafique los equivalentes gramo de NaOH utilizados y el tiempo. Determine la

actividad enzimática con la pendiente de esta gráfica que corresponde a la actividad
en equivalentes de aminoácidos hidrolizados por minuto y por ml de enzima. Analice
los resultados.

Escriba la reacción general que describe el proceso de hidrólisis de las proteínas.

NaOH Tiempo
utilizados (mL) (minutos)
1.2 5
1.2 15
1.3 30
1.4 45
1.5 60

Pendiente: m= y2 -y1/x2- x 1
m= 1.3- 1.2 / 30-15
m= 0,01
2. ¿Cuál es la composición de la pancreatina? ¿En qué casos se utiliza?
 Composición Pancreatina Simeticona MK®
Cada Tableta Cubierta de PANCREATINA SIMETICONA MK® contiene 170
mg de Pancreatina (correspondiente a 6.500 unidades FIP de actividad
lipasa, 5.500 unidades FIP de actividad amilasa, 400 unidades FIP de
actividad proteasa), 80 mg de Simeticona; excipientes c.s.
PANCREATINA SIMETICONA MK® ofrece un rápido alivio de los síntomas
de indigestión, llenura y pesadez estomacal producidos por los estados de
hiperacidez estomacal, logrando un efecto astringente, debido a su gran
capacidad de neutralizar ácidos en el organismo. Se ha adicionado
simeticona para lograr un mayor alivio de la sintomatología asociada al
disminuir la cantidad de gas en el estómago y el intestino.
 Mecanismo de acción Pancreatina Simeticona MK®
La Simeticona es una mezcla de dimeticonas liquidas insolubles en el
organismo, que disminuyen la tensión superficial del gas presente en el tracto
digestivo convirtiéndolo en burbujas finas que se terminan dispersando. Las
enzimas pancreáticas contenidas en la Pancreatina, (Lipasa, Proteasa,
Amilasa) hidrolizan la grasa de la dieta en ácidos grasos y glicerol; convierten
las proteínas en péptidos, y la dextrina en maltosa. Esta función es realizada
en el duodeno y el yeyuno superior, facilitando la digestión y absorción de los
alimentos.

3. ¿Para qué se utilizó la pancreatina en el laboratorio? ¿Cuáles son los

productos de hidrólisis de las proteínas? ¿Cómo se determinó la presencia de
estos en la solución? Escriba la reacción respectiva.

La pancreatina es un inhibidor de los estados de hiperacidez estomacal, en la

práctica realizada en el laboratorio se utilizó para neutralizar, la acides de la
sustancia que antes se había formado a partir de gelatina y de la Ninhidrina.

Reacción con la ninhidrina

El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la
ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es
primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene
un grupo amino en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos
alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.
La hidrólisis de proteínas es un proceso en el cual se produce la ruptura de la
estructura primaria, es decir la ruptura de la secuencia normal de una proteína; lo
cual termina por fragmentar las proteínas para convertirlas en aminoácidos.
La fenolftaleína es una marcador de ph, que en sustancias básicas se torna de color
rosa y en las acidas es incolora, por eso se agregan tres gotas antes de titular con
NaOH 0.05N.
4. Describa la composición de la proteína utilizada en la práctica. ¿Cuál es la
fuente de obtención de esta? ¿Cuál es su valor nutricional?
Composición

La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto de

aminoácidos; pero sin los principales aminoácidos esenciales en la nutrición
humana como valina, tirosina y triptófano 1 (por eso se considera de bajo valor
nutricional). Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la
naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus
propiedades generales.
Al tener una gran cantidad de proteína, ésa es su mayor propiedad nutritiva: proteína
(98-99 %), sales minerales (1-2 %) y agua dependiendo de cómo se hidrate su
precursor. La gelatina se utiliza en la fabricación de alimentos para el
enriquecimiento proteínico, para la reducción de hidratos de carbono y como
sustancia portadora de vitaminas.
La gelatina está compuesta por entre un 98 % y un 99 % de proteína proveniente
del colágeno y entre un 1 % y un 2 % de sales minerales, sin contar el agua que al
ser un tipo de gel es su mayor parte. El porcentaje de agua depende de cómo se
haga la receta
Obtención
La gelatina es una mezcla de péptidos y proteínas producida por hidrólisis parcial
del colágeno extraído de la piel, el hueso hervido y molido, las pezuñas, huesos,
tendones, órganos y vísceras de ganado vacuno, porcino, equino y avícola.
El paso de colágeno insoluble a gelatina soluble constituye la transformación
esencial de su elaboración industrial. El proceso puede dar diferentes gelatinas
dependiendo de las rupturas en las uniones intramoleculares.
La materia prima se obtiene de las curtiembres y mataderos, y se le realizan
diferentes pretratamientos:
● Los cueros se tratan con sales para preservarlos.
● Las pieles se congelan para almacenamiento y transporte.
● Los huesos de ganado vacuno se desgrasan y se trituran antes del transporte
y el procesamiento.
● Todos los días se recogen huesos frescos que deberán procesarse dentro
de las 24 horas desde el sacrificio del animal.
● Los huesos se tratan en una solución ácida para extraerles los minerales
(fosfato de calcio) sin afectarles los contenidos orgánicos. Después de un
lavado, el producto resultante llamado oseína se vuelve flexible. Los fosfatos
se separan por precipitación con cal, obteniéndose como producto
secundario fosfato de calcio.
● La oseína y las pieles se procesan con ácidos para su hidrólisis a temperatura
ambiente por un tiempo relativamente corto; se ponen en contacto con una
solución de cal durante 5 a 10 semanas a temperatura ambiente; y luego se
ajusta el pH requerido para la extracción de gelatina propiamente dicha.
● La extracción es un proceso discontinuo, por lotes, que produce un licor del
6% al 10% de gelatina. Luego se filtra y concentra de forma continua en un
evaporador al vacío. La solución se esteriliza a 145 °C (293 °F) y se enfría
rápidamente para gelificar la solución. Este gel se extruye en forma de granos
y se seca con aire filtrado y aséptico.
Finalmente se muelen los granos hasta obtener el tamaño de partícula necesario.
Deben almacenarse en condiciones adecuadas, ya que son fácilmente alterables
en solución o humedad. Se pueden adquirir también en forma de hojas o láminas
que suelen ser rectangulares, amorfas, delgadas, flexibles, de fractura neta,
transparentes o ligeramente amarillentas, inodoras y con sabor especial muy tenue.
Esta última forma es ya poco comercializada puesto que la presentación en
granulado es más fácil de disolver (aunque se utiliza todavía en algunas partes de
Europa y Sudamérica).

Valor Nutricional
Podríamos decir que la gelatina es pura proteína, dado que el colágeno con la que
se elabora originariamente comprende una cadena de proteínas de alrededor de
1050 aminoácidos.
Es más, como veremos, dos de esos aminoácidos -la hidroxiprolina y la hidroxilisina-
lo encontramos sólo en la proteína del colágeno, que contiene todos los
aminoácidos esenciales, a excepción del triptófano.
En lo que se refiere precisamente a ese valor nutritivo, la gelatina principalmente
contiene colágeno (entre un 85 y un 90%), sales minerales, agua y azúcares.
Dicho sea de paso, debemos indicar que la proteína, su componente principal, está
formada por eslabones llamados aminoácidos (que ya conocemos), y que 18 de los
20 existentes se encuentran presentes en la estructura de colágeno, por lo que
forman parte de la composición de la gelatina.
No obstante, debemos indicar que la gelatina a pesar de ser un alimento proteico,
el colágeno no contiene todos los aminoácidos esenciales, motivo por el cual no
supone un aporte proteínico ciertamente complejo.
La gelatina es un postre ciertamente adecuado en caso de determinadas afecciones
y trastornos digestivos. Y, de hecho, ayuda a la digestión al contener glicina, un
aminoácido capaz de estimular el ácido clorhídrico de nuestro estómago.

5. Explique el proceso de digestión de las proteínas en el intestino y

establezca diferencias y semejanzas con el proceso que se realizó en el
laboratorio.

La digestión de proteínas comienza en el estómago. La entrada de proteínas al

estómago estimula la secreción de gastrina, la cual a su vez estimula la formación
de HCl; esta acidez actúa como un antiséptico y mata a la mayoría de los entes
patógenos que ingresan al tracto intestinal. Las proteínas globulares se
desnaturalizan a pHs ácidos, lo cual ocasiona que la hidrólisis de proteína sea más
accesible.

En el estómago, la pepsina, de una sola cadena, es secretada en forma de su

zimógeno, el pepsinógeno por las células de la mucosa gástrica. El pepsinógeno se
convierte en pepsina por el corte (catalizado por la misma enzima) de 42 residuos
del extremo amino-terminal, proceso que es favorecido por el pH ácido del jugo
gástrico. La pepsina no es muy específica, hidroliza los enlaces en los que
intervienen aminoácidos aromáticos, aunque también lo hace donde hay Met y Leu.
La pepsina es producida por las células principales de las glándulas gástricas como
una proenzima, el pepsinógeno, quien por efecto del pH ácido se hidroliza y
adquiere su capacidad enzimática. Actúa principalmente sobre enlaces peptídicos
de naturaleza hidrófoba, preferentemente aromáticos. La pepsina es más activa con
un pH de entre 2 y 3. Se desactiva permanentemente con un pH superior a 5.
Interactúa con las uniones Phe-Phe y Phe-Tyr.

En el momento en el que ponemos en contacto la proteína (en este caso gelatina)

con la pancreatina, que contiene diferentes enzimas como la amilasa, la lipasa y la
proteasa, las cuales se encargan de hidrolizar las proteínas en oligopeptidos, los
almidones en oligosacáridos y los triglicéridos en ácidos grasos y glicéridos, por lo
tanto cuando estas dos sustancias entran en contacto en el tubo de ensayo, la
proteína empieza a hidrolizarse simulando el proceso que se realiza en el tubo
digestivo.

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por

cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Por lo tanto, en el procedimiento
del laboratorio lo que se logra con el aumento de la temperatura en los tubos de
ensayo que contienen las soluciones de proteínas y pancreatina es aumentar la
velocidad de reacción de la enzima, por lo que en los tubos de ensayo que se
dejaron más tiempo sumergidos en el baño maría, debe de encontrarse menos
cantidad de proteína sin hidrolizar.

Los grupos aminos primarios tiene la cualidad de reaccionar favorablemente con el

formaldehído, lo cual generaría un compuesto ácido, que puede ser analizado
volumétricamente, teniendo en cuenta que para lograrlo debe utilizarse un indicador
adecuado (fenolftaleína); procediendo de la misma manera que si se estuviera
analizando un ácido ordinario.

BIBLIOGRAFIA

1. Hidrolisis de proteínas, [Internet], disponible en,

http://deproteinas.com/hidrolisis-de-proteinas
2. Vademecum MK, [Internet], disponible en,
https://www.tqfarma.com/productos/vademecum-mk/tracto-alimentario-y-
metabolismo/pancreatina-simeticona-mk
3. Titulación de ácido base.pdf, [Internet], disponible en,
http://www2.vernier.com/sample_labs/CMV-16-titulacion_acido_base.pdf
4. GUÍA No 9: ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS de
la universidad Jorge Tadeo Lozano, [Internet], disponible en,
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/orga
nica/guia_9_aminoacidos.pdf