TELAAH JURNAL/ JOURNAL READING

* Kepaniteraan Klinik Senior / G1A217037/ Juni 2018

** Pembimbing

Sox2 Signaling In Prosensory Domain Specification And Subsequent Hair

Cell Differentiation In The Developing Cochlea

Yaumil Khalida Putri, S.Ked*dr. Ismelia Fadlan, Sp. THT-KL

PROGRAM STUDI PROFESI DOKTER

BAGIAN ILMU THT-KL RSUD RADEN MATTAHER JAMBI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS JAMBI
 LEMBAR PENGESAHAN
Clinical Science Session

Sox2 Signaling In Prosensory Domain Specification And Subsequent Hair

Cell Differentiation In The Developing Cochlea

Oleh :
Yaumil Khalida Putri, S. Ked
GIA217037

Laporan ini telah diterima dan dipresentasikan

Pada Juni 2018
Pembimbing:

dr. Ismelia Fadlan, Sp. THT-KL

 Sox2 Signaling Dalam Spesifikasi Domain Prosensori Dan Diferensiasi Sel
Rambut Dalam Pengembangan Koklea

Alain Dabdouba,1,2,3, Chandrakala Puligillaa,1,3, Jennifer M. Jonesa, Bernd Fritzschb,

Kathryn S. E. Cheahc,Larysa H. Pevnyd, and Matthew W. Kelleya
a b
Section on Developmental Neuroscience, NIDCD, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892; Department of
c
Biological Sciences, University of Iowa, Iowa City, IA 52242; Department of Biochemistry and Centre for Reproduction,
d
Development and Growth, University of Hong Kong, Hong Kong; and Department of Genetics, University of North Carolina,
Chapel Hill, NC 27599
Edited by Gail R. Martin, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, and approved October 2, 2008 (received
for review August 18, 2008)

Sox2 adalah faktor transkripsi mobilitas tinggi yang merupakan salah satu
penanda paling awal perkembangan domain prosensori telinga bagian dalam. Pada
manusia, mutasi pada SOX2 menyebabkan gangguan pendengaran sensorineural
dan hilangnya studi fungsi pada tikus menunjukkan bahwa Sox2 diperlukan untuk
pembentukan prosensori di koklea.Namun, peran spesifik Sox2 belum ditentukan.
Di sini kami mengilustrasikan peran dinamis Sox2 sebagai faktor permisif awal
dalam pembentukan domain prosensori diikuti oleh hubungan antagonis dengan
Atoh1, protein bHLH yang diperlukan untuk pengembangan sel rambut.Kami
mendemonstrasikan bahwa penurunan kadar Sox2 menghasilkan diferensiasi sel
rambut sebelum waktunya dan produksi sel-sel rambut dalam yang berlebihan dan
bahwa efek ini kemungkinan dimediasi melalui interaksi antagonis antara Sox2
dan molekul bHLH Atoh1. Dengan menggunakan eksperimen gain dan loss-of-
function, kami menyediakan bukti untuk jalur molekuler yang bertanggung jawab
untuk pembentukan domain prosity koklea. Ekspresi Sox2 dipromosikan oleh
Notch signaling dan Prox1, faktor transkripsi homeobox, adalah target hilir Sox2.
Hasil ini menunjukkan peran penting dan beragam untuk Sox2 dalam
pengembangan, spesifikasi, dan pemeliharaan sel sensorik dalam koklea.

Epitelium sensoris dari koklea mamalia (organ Corti) berkembang dari

kumpulan sel prosensori yang berasal dari daerah ventral dari otocyst.
Pengembangan koklea yang tepat membutuhkan transisi sel progenitor koklea
melalui keadaan kompetensi perkembangan, siklus sel keluar terkoordinasi, dan
spesifikasi dan diferensiasi sel induk untuk menghasilkan populasi sel yang
ditakdirkan secara jelas di dalam mosaik yang sangat teratur dari organ Corti (1).
Jalur transduksi sinyal yang mengoordinasikan spesifikasi prosleori koklea baru
saja mulai diidentifikasi. Lebih dari itu, karena jalur transduksi sinyal ini tidak
mungkin menjadi kaskade linear, itu juga akan diperlukan untuk menentukan
bagaimana jalur yang berbeda diorganisasikan ke jaringan signaling kompleks
yang akhirnya menghasilkan dan tanggapan unik dalam sel-sel prosus koklea
individu.
 Sox (SRY terkait HMG kotak) protein adalah sekelompok faktor
transkripsi yang mengatur beragam proses perkembangan; misalnya, Sox2 adalah
penanda universal sel induk dan juga dinyatakan dalam sel progenitor saraf pada
berbagai tahap perkembangan sistem saraf pusat. Sox2, bersama dengan Sox1 dan
Sox3, terdiri dari grup SoxB1. Anggota kelompok ini diperkirakan untuk menjaga
sel prekursor saraf dalam keadaan progenitor dengan menghambat diferensiasi
neuron bhLH-mediated (2). Dengan timbal balik, protein bHLH harus menekan
ekspresi dan aktivitas protein SoxB1 untuk menginduksi diferensiasi seluler.
Sebuah studi kehilangan-fungsi baru-baru ini menunjukkan bahwa Sox2
diperlukan untuk pengembangan epitel sensorik, termasuk organ Corti, di dalam
telinga bagian dalam (3). Namun, meskipun kebutuhan mutlak untuk
pembentukan epitel indera telinga bagian dalam, peran spesifik Sox2 tetap
sebagian besar tidak diketahui.

Dalam studi ini, kami memaparkan peran pengembangan Sox2 melalui

studi fungsi gain-and-loss selain identifikasi regulator hulu dan target hilir. Hasil
dari eksperimen ini memungkinkan kami untuk membuat kaskade pensinyalan
Sox2 yang mencakup jalur pensinyalan takik di hulu Sox2 dan faktor transkripsi
Prox1 sebagai target hilir Sox2 di koklea. Selain itu, kami menyajikan bukti in
vitro yang konsisten dengan hubungan antagonis timbal balik antara Sox2 dan
Atoh1, protein bHLH, di mana ekspresi Sox2 merepresi pembentukan sel rambut
yang diinduksi Atoh1 sementara ekspresi Atoh1 mengarah ke down-regulation
Sox2. Kesimpulan ini didukung oleh demonstrasi sel-sel rambut ektopik dalam
koklea dari Sox2 tikus hipomorfik, menunjukkan bahwa tingkat Sox2
menentukan, setidaknya sebagian, jumlah sel yang berkembang sebagai sel-sel
rambut bagian dalam. Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi Sox2
diperlukan untuk spesifikasi sel-sel prosensori tetapi bahwa down-regulation
berikutnya dari Sox2 juga diperlukan untuk subset dari sel-sel tersebut untuk
membedakannya sebagai sel-sel rambut.

Hasil

Sox2 Diekpresikan di Daerah Prosensori koklea. Sebagai langkah awal

untuk memahami peran Sox2, kami memeriksa ekspresinya di koklea yang
berkembang. Dalam duktus koklea di E12.5, Sox2 diekspresikan dalam sebuah
band sel yang terletak di separuh medial duktus yang tampak berhubungan dengan
domain prosensori, populasi sel yang akan menimbulkan organ Corti (Gambar.
1A). Ini dikonfirmasi dengan membandingkan ekspresi Sox2 dengan p27kip1,
penanda domain prosensori yang dikenal. (4) pada E14 (informasi pendukung (SI)
Gambar. S1). Pada E16, pita ekspresi Sox2 dalam duktus koklea berkorelasi
dengan posisi perkembangan organ Corti (Gambar 1B). Selain itu, Sox2
diekspresikan dalam sel di organ Kolliker (KO) yang terletak bersebelahan
dengan tepi medial epitel sensoris yang sedang berkembang. Dalam organ Corti,
ekspresi Sox2 mulai down regulation dalam sel yang akan berdiferensiasi sebagai
sel-sel rambut sementara itu dipertahankan dalam sel yang akan berkembang
sebagai sel pendukung — sel-sel phalangeal dalam, sel-sel pilar dalam, sel pilar
luar, sel Deiters , dan sel-sel Hensens (Gambar 1B).

Untuk mengkonfirmasi bahwa down-regulasi Sox2 berkorelasi dengan

diferensiasi sel rambut, ekspresi Sox2, dan faktor transkripsi bHLH, Atoh1
dibandingkan pada E16.5. Sox2 (coklat) di sel rambut positif Atoh1 (biru)
mengalami down-regulasi (Gambar 1C). Pada P0, ekspresi Sox2 dibatasi untuk
mendukung sel dan sekelompok sel dalam KO (Gambar 1D) (5).

Gambar 1. Sox2 diekspresikan dalam domain prosensori dan menghambat pembentukan

sel rambut. (A-D) Imunohistokimia menggunakan anti-Sox2 (merah dalam A, B, dan D dan coklat
di C) dan aktin (hijau dalam A, B, dan D) pada mid-modiolar cross-sections dari WT cochleae
menunjukkan ekspresi Sox2 di E12.5, E16, dan P0. Sox2 secara luas diungkapkan dalam sel-sel
prosensori di E12.5 (A); Namun, oleh tingkat E16 Sox2 menurunkan regulasi dalam sel yang
kemudian akan memperoleh nasib sel rambut (B, panah). (C) Ko-lokalisasi Sox2 (coklat) dan
Atoh1 (pewarnaan-biru dengan warna biru) di organ Corti dari Atoh1 tikus di E16.5 menunjukkan
downregulation dari Sox2 di Sel-sel rambut atoh1-positif. (D) Dengan P0 ekspresi Sox2 dibatasi
untuk mendukung sel-sel (Inset: organ Corti) dengan ekspresi lemah dalam subset sel-sel dalam
KO. Overekspresi Sox2 menghambat pembentukan sel rambut. (E) Gambar konfigurasi
pembesaran rendah dari kultur eksplan koklea yang ditransfeksikan dengan Sox2.nucEGFP.
Eksplan terdiri dari tiga wilayah, KO, SE, dan LER, lihat Prosedur Eksperimental untuk
rinciannya. Sel Transfected biasanya hadir di ketiga wilayah (panah)di KO dan LER, dan panah di
SE). (F) Gambar konfigurasi pembesaran tinggi dari sel proksori koklea yang ditransfeksikan
dengan Sox2.nucEGFP (kepala panah). Itu sel transfected negatif untuk marker sel rambut Myo6
(merah); (Inset) Z-stack confocal cross-section dari sel yang diilustrasikan dalam F. Meskipun sel
terletak di lapisan sel rambut, itu negatif untuk Myo6. KO, organ Kolliker; LER, punggung epitel
yang lebih rendah; SE, epitel sensorik; OC, organ Corti; IHC, sel rambut bagian dalam; O1-
O3,sel-sel rambut luar; IPh, sel phalangeal dalam; IP, sel pilar dalam; OP, sel pilar luar; D1-D3,
sel Deiters; HeC, sel Hensens. (Batang skala, A, B, D, 20𝜇m; C, 10𝜇m; E, 50𝜇m; F, 10 𝜇m.)

Ekspresi Paksa Sox2 Menghambat Formasi Sel Rambut. Hasil

sebelumnya telah menunjukkan bahwa ekspresi Sox2 diperlukan untuk
pengembangan semua jenis sel dalam organ Corti, termasuk sel rambut
mechanosensory dan sel pendukung non-sensori (3) Untuk menentukan apakah
regulasi turun yang diamati dari Sox2 diperlukan untuk pembentukan sel rambut,
sel-sel prosensori ditransfeksikan dengan Sox2.nucEGFP di E13 yang
mengakibatkan pemeliharaan ekspresi Sox2. Vektor ekspresi juga mengandung
urutan internal entri ribosom (IRES) yang menghasilkan generasi transkrip
independen untuk protein fluorescent hijau yang dilokalisasi-nuklir (EGFP nuklir)
di bawah kendali promotor yang sama. Eksplan koklea dipertahankan selama 6
hari in vitro dan sel-sel yang mempertahankan ekspresi Sox2 di epitel sensorik
dianalisis menggunakan ekspresi Myosin6 (Myo6) sebagai penanda untuk
perkembangan sel rambut. Sementara Myo6 diekspres dalam sejumlah jaringan
yang berbeda di seluruh tubuh, di dalam telinga bagian dalam, itu dinyatakan
dalam semua sel-sel rambut dan tidak ada jenis sel lain (6). Kuantifikasi sel
transfected menunjukkan bahwa 99,4% sel yang ditransfeksikan dengan Sox2
dalam epitel sensori dihambat dari berkembang sebagai sel-sel rambut (Gambar 1
E dan F dan Tabel S1) menunjukkan bahwa pemeliharaan tingkat tinggi ekspresi
Sox2 menghambat pembentukan sel rambut. Sebaliknya, 50,1% sel prosensori
ditransfeksikan dengan vektor kontrol yang menyatakan hanya EGFP nuklir yang
dikembangkan sebagai sel rambut (Tabel S1). Overexpression of Sox2 tidak
berpengaruh pada nasib sel dukungan (data tidak ditampilkan) menunjukkan
penghambatan spesifik nasib sel rambut oleh Sox2.

Hubungan Antagonistik Antara Sox2 dan Atoh1. Setelah periode co-

ekspresi dengan Atoh1, Sox2 menjadi down-regulated dalam progenitor sel-sel
yang akan berkembang sebagai sel-sel rambut. Waktu penurunan regulasi Sox2
berkorelasi dengan peningkatan ekspresi Atoh1 dalam sel yang sama. Pola
ekspresi ini, bersama dengan keberadaan hubungan antagonis antara SoxB1 dan
bHLH dalam CNS (2), mendorong kita untuk menyelidiki apakah ada hubungan
yang serupa antara Sox2 dan Atoh1. Sebagai langkah pertama, sel karsinoma
embrio P19, yang mengekspresikan Sox2 secara endogen (Gambar 2 A dan B),
ditransfeksikan dengan Atoh1.EGFP yang mengandung sekuens IRES (Gambar
2C) dan diuji untuk ekspresi Sox2 setelah 24 jam. Sel-sel yang dipindahkan secara
konsisten Sox2-negatif menunjukkan bahwa Atoh1 bertentangan dengan ekspresi
Sox2 (97% sel-sel yang di-transfeksi atoh1 negatif untuk ekspresi Sox2; n 4, t 63)
(Gbr. 2 A-D).
 Untuk memeriksa apakah Sox2 antagonis efek dari Atoh1, sel-sel dalam
KO atau punggungan epitel yang lebih rendah (LER, terletak lateral epithelium
sensorik) yang ditransfeksikan dengan baik Atoh1 saja atau kombinasi dari Atoh1
dan Sox2. Transfeksi Atoh1.EGFP menghasilkan ekspresi marker sel rambut
Myo6 di 97,2% sel transfected (Gambar 2 E dan F dan Tabel S1) (7, 8) sementara
sel yang ditransfeksikan dengan Sox2.nucEFGP tidak mengekspresikan marker
sel rambut ( Gambar 2G dan Tabel S1). Untuk mengkonfirmasi bahwa transfeksi
dengan hasil Atoh1.EGFP dalam induksi nasib sel rambut, sel transfected juga
diuji untuk ekspresi penanda sel rambut kedua, Myosin7a (6) dan untuk kehadiran
bundel stereociliary. Hampir semua sel Atoh1.EGFP-transfected mengekspresikan
Myosin7a dan memiliki bundel stereociliary (Gambar. S2). Sebaliknya, hanya
50,1% sel yang ditransfusi bersama dengan Atoh1.EGFP dan Sox2.nucEGFP
berkembang sebagai sel rambut dibandingkan dengan 97,2% ketika Atoh1 dirubah
secara tunggal (Gbr. 2 H-J dan Tabel S1). Hasil ini menunjukkan bahwa meskipun
Sox2 diperlukan untuk ekspresi semua atau sebagian besar aspek domain
prosensory, Sox2 juga bertindak sebagai antagonis dengan menghambat
kemampuan Atoh1 untuk menginduksi pembentukan sel rambut. Jika ini
kasusnya, kemudian mengurangi, tetapi tidak menghilangkan, aktivitas Sox2
dapat menyebabkan pembentukan prematur dan produksi sel rambut berlebihan
karena penurunan efek antagonis pada fungsi Atoh1. Untuk menguji hipotesis ini,
kami memeriksa cochleae dari tikus Sox2EGFP / LP hipomorfik yang
mengekspresikan Sox2 pada sekitar 30% dari tingkat normal (9). Pada E15.5,
cochleae tipe liar hanya berisi satu baris sel-sel rambut asli Myo6 (Gbr. 2K). Satu
baris sel rambut dalam ini memanjang di sepanjang setengah basal duktus koklea.
Pola ini konsisten dengan gradien basal-ke-apikal yang diketahui dari diferensiasi
sel rambut. Sebaliknya, dalam cochleae dari E15.5 Sox2EGFP / LP littermates,
satu baris sel-sel rambut dalam dan dua baris sel-sel rambut luar yang jelas terlihat
di setengah basal duktus koklea (Gambar 2L). Selain itu, oleh E18 peningkatan
yang signifikan dalam jumlah sel-sel rambut bagian dalam diamati sepanjang
seluruh panjang sumbu basal-ke-apikal dari koklea di Sox2EGFP / LP tikus (P
0,001) (Gambar 2 M-O). Peningkatan jumlah sel rambut bagian dalam tidak
mengorbankan sel-sel pendukung seperti yang ditandai Prox1 atau Sox2 saya
(data tidak ditampilkan). Tidak ada perubahan signifikan yang diamati pada
panjang epitel sensoris atau dalam jumlah sel-sel rambut luar. Selain itu, epitel
terus menerus sepanjang keseluruhannya. Perbandingan antara koklea dari hewan
dengan berbagai tingkat aktivitas Sox2 yang menurun menunjukkan efek
tergantung dosis pada jumlah sel-sel rambut dalam tambahan (Gbr. 2 O).
Gambar. 2. Hubungan antagonis antara Sox2
dan Atoh1. (A-D) P19 sel, diberi label dengan
DAPI (biru dalam A), mengekspresikan Sox2
secara endogen (merah dalam B). Namun, sel
transfeksi dengan Atoh1.EGFP (asterisk di A-
D) negatif untuk ekspresi Sox2 (B-D). Sox2
antagonis Atoh1 secara in vitro. (E-G) Sel
dalam KO atau LER trans-fected dengan
Atoh1.EGFP saja positif untuk Myo6 (merah)
menunjukkan perkembangan sebagai sel-sel
rambut (E-F) sementara sel Sox2-transfected
tidak pernah berkembang menjadi sel-sel
rambut (G). (H-J) Sel dalam LER yang
ditransfeksikan bersama dengan
Sox2.nucEGFP dan Atoh1.EGFP. Satu sel
positif untuk Myo6 (merah), sementara yang
lainnya tidak, menggambarkan interaksi
antagonis antara Sox2 dan Atoh1. Awal
diferensiasi sel-sel dan pembentukan sel-sel
rambut ekstra di Sox2 hypomorphic cochlea.
(K-O) Penampang silang dari pergantian basal
koklea dari Sox2 / dan Sox2EGFP / LP pada
E15.5. (K) Pelabelan Anti-Myo6 menunjukkan
adanya satu sel rambut dalam di Sox2 / cochlea
(kepala panah). (L) Sebaliknya, Sox2EGFP /
LP cochlea mengandung sel rambut dalam
(kepala panah) dan dua sel rambut luar (panah).
(M dan N) Analisis sel rambut (diberi label
dengan anti-Myo6) di cochleae dari E18
littermates.
 Sox2 Menginduksi Ekspresi Prox1 di Cochlea. Onset awal dan pola
ekspresi untuk Sox2 bertepatan dengan, tetapi mendahului dan sedikit lebih besar
daripada, bahwa Prox1, faktor transkripsi homeodomain yang dinyatakan dalam
epitel sensorik berkembang dan juga menjadi terbatas untuk mendukung inti sel
oleh P0 (10, 11 ) (Gbr. 3 A dan A '). Karena ekspresi Prox1 tumpang tindih
dengan Sox2 di wilayah lateral duktus koklea (Gambar 3B), kami berspekulasi
bahwa Sox2 mungkin diperlukan untuk ekspresi Prox1. Untuk menguji hipotesis
ini, ekspresi Prox1 ditentukan dalam cochleae dari Sox2Lcc / Lcc (light coat dan
circling) tikus (3). Konsisten dengan hipotesis ini, ekspresi Prox1 tidak ada pada
cochleae dari Sox2Lcc / Lcc pada kedua E15.5, titik waktu tepat setelah onset
normal ekspresi Prox1 (Gambar 3 C dan D), dan P0 (Gambar. S3). Untuk
menentukan apakah Sox2 menginduksi ekspresi Prox1, Sox2 secara ektopik
diekspresikan dalam sel-sel dalam eksplan koklea. Ekspresi paksa Sox2.nucEGFP
menginduksi ekspresi Prox1 di 100% sel transfected (n 4, t 103) terletak di
seluruh koklea termasuk KO (Gambar 3 E-G) dan LER (Gambar 3 H-J). Selain
itu, sel-sel yang ditransfeksikan dengan Sox2.nucEGFP dalam epitel sensorik
yang berkembang menunjukkan peningkatan yang nyata dalam ekspresi Prox1
(Gambar. S4). Sebaliknya, sel-sel yang ditransfeksi dengan nuc.EGFP saja tidak
mengekspresikan Prox1 (data tidak ditampilkan). Untuk memastikan apakah
down-regulasi Prox1 diperlukan untuk pembentukan sel rambut, sel-sel proslear
koklea ditransfeksikan dengan Prox1.nucEGFP; 95,5% sel yang mempertahankan
ekspresi Prox1 terhambat dari berkembang sebagai sel-sel rambut seperti yang
diuji oleh Myo6 (Gambar 3 K dan L dan Tabel S1), menunjukkan bahwa efek
penghambatan Sox2 dapat dimediasi, setidaknya sebagian, oleh Prox1 . Untuk
menguji hipotesis ini secara langsung, sel non-prosensori yang terletak di KO atau
LER adalah co-transfected dengan Atoh1.EGFP dan Prox1.nucEGFP seperti yang
dijelaskan sebelumnya. Hanya 4,5% sel co-transfected yang dikembangkan
sebagai sel rambut (Gambar 3M dan Tabel S1), sangat mendukung hipotesis
bahwa Prox1 memainkan peran penting dalam efek antagonis Sox2.

Notch Signaling Mengatur Ekspresi Sox2. Aktivasi Jagged1-mediated

dari jalur Notch telah terbukti diperlukan untuk spesifikasi domain prosensori
telinga bagian dalam paling dalam (12). Untuk menentukan kapan ekspresi Sox2
tergantung pada sinyal Notch, aktivasi jalur Notch dihambat dalam eksplan koklea
yang dimulai pada E13 dengan paparan inhibitor g-secretase DAPT (N- [N- (3,5-)
dif luorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester), yang memblokir
sinyal Notch. Pengobatan DAPT pada eksplan koklea menyebabkan penurunan
ekspresi Sox2 (Gambar 4 A dan B) dan akibatnya Prox1 (Gambar 4 C dan D),
menunjukkan bahwa pensinyalan Notch diperlukan untuk mempertahankan
ekspresi Sox2 dan Prox1 dalam sel prosensori. . Namun pengobatan DAPT juga
menghasilkan peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel-sel rambut seperti
yang dilaporkan sebelumnya (13) (Gambar 4 E dan F) menunjukkan bahwa
hilangnya Sox2 dan Prox1 bisa menjadi hasil dari perubahan sel daripada efek
langsung dari jalur Notch pada ekspresi Sox2 / Prox1 dalam sel prosensori. Oleh
karena itu, untuk menentukan apakah aktivasi Notch cukup untuk menginduksi
ekspresi Sox2 dan / atau Prox1, domain intraseluler Notch1 (NICD) dinyatakan
ektopik dalam sel-sel dalam KO atau LER. Rata-rata 96,4% sel NICD.EGFP-
transfected positif untuk ekspresi Sox2 (Gbr. 4G; n 3, t 51). Tidak satu pun sel
yang ditransfeksikan dengan vektor kontrol yang mengekspresikan EGFP saja
positif untuk Sox2 (n 3, t 47; data tidak ditampilkan). Namun, tidak ada sel
NICD.EGFP-transfected yang disajikan untuk mengekspresikan Prox1 (data tidak
ditampilkan). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi jalur pesinyalan Notch
bertindak untuk menginduksi ekspresi ektopik Sox2, tetapi itu faktor tambahan
diperlukan untuk aktivasi berikutnya dari Prox1 dalam sel yang sama. Hasil ini
juga konsisten dengan pengamatan bahwa Prox1 hanya diekspresikan dalam
subset sel prosensori. Lebih jauh lagi, ekspresi berlebihan NICD di epitel sensori
adalah penghambatan pembentukan sel rambut (n 5, t 35; data tidak ditampilkan)
mirip dengan hasil yang diperoleh untuk Sox2 overexpression. Untuk
mengkonfirmasi bahwa Notch signaling bertindak di hulu Sox2, kami memeriksa
ekspresi Notch1 pada Sox2Lcc / Lcc pada E15.5. Seperti yang diharapkan, ekspresi
Notch1 hadir dalam mutan-mutan ini (Gambar 4H). Secara bersama-sama, data
kami menunjukkan bahwa sementara jalur sinyal Notch adalah independen dan
hulu Sox2, itu memainkan peran dalam pengaturan ekspresi Sox2. Namun, hasil
kami tidak mengecualikan peran tambahan untuk Notch signaling hilir Sox2.
Gambar. 3. Sox2 mengatur ekspresi Prox1. (A dan A ’) Pelabelan Prox1 (merah) dan
aktin (hijau) pada penampang pertengahan modiolar dari WT koklea di P0 menunjukkan
ekspresi Prox1 dalam subset inti sel pendukung; IP, OP, dan D1-D3. (B) Double-
immunolabeling menggunakan anti-Prox1 (merah) dan anti-Sox2 (hijau) menunjukkan
ekspresi tumpang tindih Prox1 dan Sox2 di wilayah lateral termasuk PC dan inti DC. (C
dan D) Prox1 tidak ada dalam koklea dari Sox2Lcc / Lcc tikus. (C) Anti-Prox1 (merah)
menodai label inti sel-sel prosensori (lingkaran) di E15.5. (D) Berbeda dengan WT,
pewarnaan Prox1 tidak ada dalam Sox2Lcc / Lcc mutan koklea di E15.5. DAPI (biru)
pewarnaan di C dan D menunjukkan inti sel. Sox2 menginduksi ekspresi ektopik dari
Prox1. (E-J) Sox2.nucEGFP ditransfisikan dalam sel dalam KO (E-G), atau LER (H-J)
positif untuk Prox1 (merah). (K dan L) Paksa ekspresi Prox1 menghambat pembentukan
sel rambut. Sel-sel proseleri koklear ditransfeksikan dengan Prox1.nucEGFP. (K)
Pandangan pembesaran rendah dari gambar konfiguratif dari eksplan yang
menggambarkan Transfeksi Prox1.nucEGFP (hijau) dalam KO dan SE (panah-kepala).
(L) Pandangan pembesaran tinggi SE menunjukkan bahwa Prox1.nucEGFP
mengekspresikan sel (panah) negatif untuk penanda sel rambut Myo6 (merah). (M) Co-
transfeksi dengan Prox1.nucEGFP dan Atoh1.EGFP menghasilkan penghambatan Atoh1.
Meskipun ekspresi Atoh1, sel negatif untuk Myo6 (merah). IHC, sel rambut bagian
dalam; IP, sel pilar dalam; OP, sel pilar luar; D1-D3, sel Deiters; O1-O3, sel-sel rambut
luar; IPh, sel phalangeal dalam; HeC, sel Hensens; KO, organ Kolliker; LER, punggung
epitel yang lebih rendah; SE, epitel sensorik. (Scale bars, A, 20 mm; A’-B, 10 mm; C-K,
20 mm, L, 10 mm, M, 20 mm.)
Gambar. 4. pesinyalan notch diperlukan untuk ekspresi Sox2. (A-F) Penghambatan sinyal
Notch menggunakan inhibitor g-secretase, DAPT pada kultur eksplan koklea yang
dimulai pada E13 menghasilkan pengurangan ekspresi Sox2 (A dan B) dan Prox1 (C dan
D). (E dan F) Sebaliknya, pelabelan Myo6 menunjukkan peningkatan jumlah sel rambut
dalam dan luar dalam kultur eksplan yang ditangani DAPT. (G) Ekspresi Paksa
NICD.EGFP dalam sel-sel di dalam LER menginduksi Sox2 (inti merah kekuningan). (H)
ekspresi Notch1 (coklat) hadir dalam E15.5 Sox2Lcc / Lcc mutan cochleae. (Scale bars, 20
mm.)

Gambar. 5. Domain prosensori ada dalam mutan Atoh1. Sox2, Jagged1, dan Prox1
digunakan sebagai penanda untuk domain prosensori. Immunolabeling dilakukan pada
bagian koklea apikal di E16.5. (A dan B) Sox2 immunolabeling (coklat) di Atoh1LacZ / dan
Atoh1LacZ / LacZ (mutan) cochleae menunjukkan tidak ada perubahan dalam ekspresi Sox2.
Pewarnaan X-gal (biru) mengilustrasikan aktivitas reporter untuk Atoh1. (C-F) Ekspresi
Jagged1 (merah dalam C dan D) dan Prox1 (merah pada E dan F) juga ada pada mutan
Atoh1. OC, organ Corti; SG, ganglion spiral. (scale bar, 20 mm.)

Spesifikasi Domain Prosensori Adalah Independen dari Atoh1. Hasil

yang dijelaskan di atas menunjukkan kaskade sinyal molekuler yang menentukan
sel-sel prosensori dalam organ Corti. Karena telah dilaporkan bahwa sel-sel
rambut dan sel pendukung tidak ada di Atoh1 / cochlea (7, 14), kami ingin
memeriksa apakah pembentukan domain prosensori dipengaruhi oleh mutan-
mutan ini. Penanda prosensori Sox2 diekspresikan pada E16.5 di Atoh1 / cochlea
(Gambar 5 A dan B) (3). Karena kita menunjukkan bahwa Notch signaling
merupakan hulu dari Sox2, kami menguji ekspresi ligan Notch, Jagged1 di Atoh1
/ tikus. Jagged1 diekspresikan dalam area yang secara topografi setara dengan
organ Corti (Gambar 5 C dan D), menunjukkan bahwa setidaknya fase awal
pensinyalan Notch tidak terpengaruh pada mutan ini. Akhirnya, karena kami
memberikan bukti bahwa Sox2 adalah hulu dari Prox1 kami memeriksa ekspresi
Prox1. Prox1 diekspresikan dalam Atoh1 / cochlea pada E16.5 mirip dengan
ekspresinya di Atoh1 / cochlea (Gambar 5 E dan F). Bahkan, pola ekspresi Prox1
pada E16.5 di Atoh1 / cochlea mirip dengan ekspresinya dalam epitel indera yang
tidak berbeda pada E14.5 dari WT cochleae (10). Data-data ini menunjukkan
bahwa domain prosensori di koklea ditentukan independen dari kaskade signaling
Notch-Sox2-Prox1 utuh di mutan Atoh1.

Diskusi

Sox2 adalah salah satu faktor transkripsi paling awal yang diekspresikan
dalam domain prosensori dari otocyst. Mutasi pada SOX2 menyebabkan tuli
sensorineural pada manusia (15) dan ketulian dan ketiadaan struktur sensorik di
telinga bagian dalam tikus (3). Kami tunjukkan di sini bahwa peran Sox2 adalah
kompleks dan mencakup efek induktif dan antagonis. Hasil kami menunjukkan
bahwa ekspresi awal Sox2 memainkan peran langsung dalam membangun domain
prosensori dalam koklea dan bahwa Sox2 adalah permisif untuk pengembangan
sel-sel rambut. Ketidakmampuan Sox2, atau anggota lain dari kaskade signaling
(Notch signaling, dan Prox1), untuk menginduksi ekspresi Atoh1 menunjukkan
bahwa fungsi Sox2 baik dalam jalur terpisah dari Atoh1 dan faktor yang tidak
diketahui mengatur inisiasi ekspresi Atoh1 atau faktor tambahan diperlukan
bersama dengan Sox2 untuk menginduksi ekspresi Atoh1. Namun, setelah onset
ekspresi Atoh1, data kami menunjukkan bahwa tingkat Sox2 menjadi down-
regulasi dalam membedakan sel-sel rambut dan bahwa interaksi antagonis antara
Sox2 dan Atoh1 berperan dalam hal ini down-regulasi. Efek serupa telah diamati
di CNS di mana gen SoxB1 umumnya menjadi down-regulasi pada diferensiasi
(2) dan ekspresi konstitutif gen SoxB1 menghambat diferensiasi (2, 16). Selain
itu, data kami menunjukkan bahwa Sox2 menghambat pembentukan sel rambut
bagian dalam dengan cara tergantung dosis, menunjukkan bahwa rasio relatif
Sox2 ke Atoh1 penting untuk pengaturan nasib sel rambut bagian dalam, dan
mungkin di luar.

Konsisten dengan hipotesis ini adalah demonstrasi diferensiasi sel rambut

prama-ture dan pembentukan sel-sel rambut ekstra dalam cochleae dari Sox2 tikus
hipomorfik, menunjukkan bahwa dalam keadaan ini, sementara Sox2 yang cukup
diekspresikan untuk pembentukan domain prosensori, jumlah Sox2 tidak
mencukupi untuk peran selanjutnya sebagai antagonis Atoh1. Selain itu,
sementara ekspresi paksa dari Atoh1 saja menghasilkan induksi kuat ekspresi
penanda sel rambut Myosin6 dan Myosin7a dan pengembangan bundel
stereociliary pada sel non-sensori, ekspresi-bersama Sox2 bersama dengan Atoh1
secara signifikan mengurangi jumlah transfected sel yang mengekspresikan
penanda sel rambut. Data ini menunjukkan bahwa kapasitas endogen Atoh1 untuk
mengarahkan komitmen sel-sel rambut dari sel prosensori tampaknya didasarkan,
setidaknya sebagian, pada kemampuannya untuk menekan Sox2.

Selanjutnya, kami menunjukkan bahwa Prox1 adalah target hilir Sox2 dan
ekspresi paksa Prox1 menghasilkan penghambatan pengembangan sel rambut.
Demikian pula, co-transfeksi Prox1 dan Atoh1 mengakibatkan penghambatan
kemampuan Atoh1 untuk menginduksi ekspresi marker sel rambut Myo6 di sel
non-sensori yang menunjukkan bahwa aksi penghambatan Sox2 dimediasi melalui
kemampuannya untuk menginduksi ekspresi Prox1. Namun, ekspresi Prox1
endogen pada koklea terbatas pada domain lateral epitel sensoris — wilayah sel
rambut luar (10, 11) —sementara data dari tikus hipomorfik Sox2EGFP / LP
menunjukkan bahwa sel rambut bagian dalam (Prox1-negatif) wilayah paling
terpengaruh. Hasil ini menunjukkan bahwa ketika Sox2 bertindak untuk
menghambat Atoh1 melalui Prox1 di wilayah sel rambut luar, ia juga bertindak,
baik secara langsung atau melalui target perantara yang tidak teridentifikasi, untuk
menghambat Atoh1 di wilayah sel rambut bagian dalam.

Sementara faktor-faktor yang menentukan jumlah sel spesifik yang akan

berkembang sebagai sel-sel rambut tidak diketahui, jumlah sel rambut yang relatif
invarian di dalam koklea mamalia sangat menunjukkan mekanisme pengaturan
yang sangat spesifik. Salah satu faktor yang mungkin bisa menjadi ekspresi gen Id
(Inhibitor diferensiasi) yang telah ditunjukkan untuk memusuhi fungsi bHLH dan
secara khusus down-regulasi sebagai sel mulai berkembang sebagai sel-sel rambut
(8). Data ini menunjukkan bahwa down-regulation ekspresi Id dalam subset sel
progenitor dapat memungkinkan aktivitas Atoh1 meningkat cukup efektif untuk
memusuhi dan menurunkan regulasi Sox2, yang mengarah ke induksi
pembentukan sel rambut.

Definisi kerja domain proselit koklea adalah populasi sel dengan

kemampuan unik untuk berkembang baik sebagai sel rambut atau sel pendukung.
Namun, faktor-faktor yang menentukan domain ini belum ditentukan. Di sini
kami menunjukkan bahwa domain prosensori, ditandai dengan derajat yang
berbeda oleh Jagged1, Sox2, dan Prox1, terbentuk secara normal tanpa kehadiran
Atoh1. Hasil ini konsisten dengan saran bahwa Atoh1 bertindak sebagai pro sel
rambut daripada gen prosensori (7). Sebaliknya, baik Jagged1 dan Sox2
diekspresikan dalam pola yang konsisten dengan spesifikasi prosensori dan
gangguan baik menghasilkan tidak adanya sebagian besar atau semua sel
prosensori (3, 12). Selain itu, ekspresi Sox2 menurunkan regulasi dalam koklea
Jagged1 mutan kondisional (12), sementara ekspresi Jagged1 tetap ada pada tikus
Sox2Lcc / Lcc (A. Pelling dan K.S.E.C., data yang tidak dipublikasikan),
menunjukkan bahwa Jagged1 bertindak di hulu Sox2. Kesimpulan ini didukung
oleh hasil kami menunjukkan bahwa Notch signaling adalah hulu dari Sox2. Hasil
ini, bersama dengan hasil ekspresi paksa Notch-ICD di telinga dalam (17),
menunjukkan bahwa aktivasi salah satu reseptor Notch bertindak untuk
menginduksi identitas prosensori. Di sini kami menunjukkan bahwa ini mungkin
terjadi melalui induksi Sox2. Hal ini berbeda dengan mata dan neokorteks, di
mana telah ditunjukkan bahwa Sox2 tampaknya bertindak di hulu dari sinyal
Notch (9, 18). Namun, demonstrasi bahwa penghambatan Notch signaling dalam
domain prosensori yang ada mengarah ke down-regulation ekspresi Sox2
menunjukkan bahwa peran Notch dalam ekspresi Sox2 melampaui periode
induksi Sox2. Selain itu, kami berhipotesis bahwa sel-sel rambut ekstra yang
diamati dalam Notch1 conditional mutan cochleae (19) mungkin terjadi,
setidaknya sebagian, karena hilangnya Notch1 mengarah ke penurunan tingkat
Sox2 dalam domain prosensori yang ada. Sejak Sox2 bertindak untuk memusuhi
Atoh1, hilangnya Sox2 dapat mengakibatkan peningkatan aktivitas Atoh1 dan,
sebagai hasilnya, peningkatan jumlah sel yang berkembang sebagai sel-sel
rambut, mirip dengan fenotipe pada tikus Sox2 hypomorphic.

Eksperimen gain-of-function kami menggunakan KO dan LER sebagai

populasi sel model untuk memeriksa jalur pensinyalan yang menentukan nasib sel
prosensori dalam otocyst menunjukkan sinyal kaskade di mana Sox2
diekspresikan sebagai respons terhadap aktivasi Notch yang diperantarai Jagged1,
dan bahwa Sox2 pada gilirannya menginduksi ekspresi Prox1. Namun, penting
untuk dicatat bahwa sementara ekspresi paksa baik NICD atau Sox2 mengarah ke
induksi Sox2 atau Prox1 masing-masing, data pada pola ekspresi endogen dari
Notch actin-vated, Sox2, dan Prox1 (1) yang tidak persis tumpang tindih,
menyarankan bahwa pengubah tidak teridentifikasi tambahan bertindak untuk
memodulasi ekspresi dari setiap target.

Singkatnya, hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa Sox2 terletak

di pusat dalam pengembangan telinga bagian dalam berfungsi sebagai node,
menerima sinyal dari beberapa input, termasuk sinyal Notch, dan sebagai
persimpangan, mengarahkan sinyal ke efektor yang berbeda yang tampaknya
memainkan peran yang unik. dalam perkembangan sensorik. Pekerjaan tambahan
untuk mengidentifikasi komponen molekul lain dari jalur Sox2 harus
mengidentifikasi faktor-faktor penting (20, 21) yang menentukan efek molekuler
Sox2 yang berbeda dalam sel yang berbeda dan pada titik waktu perkembangan
yang berbeda selama perkembangan telinga bagian dalam. Sebagai tambahan
untuk pensinyalan Notch hulu yang kami jelaskan, akan menarik untuk
menyelidiki apakah Wnt dan / atau pensinyalan FGF, keduanya dikenal untuk
memainkan peran awal dalam perkembangan telinga bagian dalam (22-24), juga
berkumpul untuk mengaktifkan ekspresi Sox2 seperti yang mereka lakukan dalam
mengembangkan plat saraf (25).

Prosedur Eksperimental

Organotipik Eksplan Budaya Koklea. Kultur koklear dari embrio E13 didirikan
seperti yang dijelaskan sebelumnya (26) (lihat Metode SI untuk lebih jelasnya).
Untuk menghambat pensinyalan notch, penghambat g-secretase N - [(3,5-
Difluorophenyl) asetil] -L-alanyl-2-fenil] glisin-1,1-dimethylethyl ester (DAPT)
ditambahkan ke eksplan pada konsentrasi 50 mM dan diisi ulang setiap hari
selama enam hari. Pada akhir setiap percobaan, eksplan diperbaiki dalam 4%
paraformaldehyde selama 30 menit dan dianalisis dengan imunohistokimia.

Kultur Sel. Transfeksi pada sel P19 dilakukan menggunakan reagen

Lipofectamine2000 (Invitrogen) sesuai dengan instruksi pabrik. Sel-sel diperbaiki
dalam 4% PFA selama 20 menit dan dianalisis dengan imunohistokimia
menggunakan antibodi yang ditunjukkan. Nukleus sel counterstained dengan
Noda nuklir DAPI (Molecular Probe, 1: 5000).

Imunohistokimia. Immunocytochemistry dilakukan pada budaya eksplan koklea

dan koklea seperti yang dijelaskan sebelumnya (7, 8) (lihat Metode SI untuk lebih
jelasnya).

Konstruksi Ekspresi. Lihat Metode SI untuk detailnya.

Elektroporasi. Sel-sel individu pada eksplan koklea ditransfeksikan

menggunakan elektroporasi gelombang persegi seperti yang dijelaskan
sebelumnya (8) (Lihat Metode SI untuk lebih jelasnya).

Kuantifikasi Perubahan fate Sel. Lihat Metode SI untuk detailnya.

Daftar Pustaka

1. Kelley MW (2006) Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner
ear. Nat Rev Neurosci 7:837– 849.
2. Bylund M, Andersson E, Novitch BG, Muhr J (2003) Vertebrate neurogenesis
is counter-acted by Sox1–3 activity. Nat Neurosci 6:1162–1168.
3. Kiernan AE, et al. (2005) Sox2 is required for sensory organ development in
the mammalian inner ear. Nature 434:1031–1035.
4. Chen P, Segil N (1999) p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in
the developing organ of Corti. Development 126:1581–1590.
5. Hume CR, Bratt DL, Oesterle EC (2007) Expression of LHX3 and SOX2
during mouse inner ear development. Gene Expr Patterns 7:798 – 807.
6. Avraham KB, et al. (1995) The mouse Snell’s waltzer deafness gene encodes
an uncon-ventional myosin required for structural integrity of inner hair cells.
Nat Genet 11:369 –375.
7. Woods C, Montcouquiol M, Kelley MW (2004) Math1 regulates development
of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci 7:1310 –
1318.
8. Jones JM, Montcouquiol M, Dabdoub A, Woods C, Kelley MW (2006)
Inhibitors of differ-entiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair
cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci 26:550
–558.
9. Taranova OV, et al. (2006) SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal
neural progenitor competence. Genes Dev 20:1187–1202.
10. Bermingham-McDonogh O, et al. (2006) Expression of Prox1 during
mouse cochlear development. J Comp Neurol 496:172–186.
11. Puligilla C, et al. (2007) Disruption of fibroblast growth factor receptor 3
signaling results in defects in cellular differentiation, neuronal patterning, and
hearing impairment. Dev Dyn 236:1905–1917.
12. Kiernan AE, Xu J, Gridley T (2006) The Notch ligand JAG1 is required
for sensory progenitor development in the mammalian inner ear. PloS Genet
2:27–38.
13. Takebayashi S, et al. (2007) Multiple roles of Notch signaling in cochlear
development. Dev Biol 307:165–178.
14. Bermingham NA, et al. (1999) Math1: An essential gene for the
generation of inner ear hair cells. Science 284:1837–1841.
15. Hagstrom SA, et al. (2005) SOX2 mutation causes anophthalmia, hearing
loss, and brain anomalies. Am J Med Genet A 138:95–98.
16. Graham V, Khudyakov J, Ellis P, Pevny L (2003) SOX2 functions to
maintain neural pro-genitor identity. Neuron 39:749 –765.
17. Daudet N, Lewis J (2005) Two contrasting roles for Notch activity in
chick inner ear development: Specification of prosensory patches and lateral
inhibition of hair-cell dif-ferentiation. Development 132:541–551.
18. Bani-Yaghoub M, et al. (2006) Role of Sox2 in the development of the
mouse neocortex. Dev Biol 295:52– 66.
19. Kiernan AE, Cordes R, Kopan R, Gossler A, Gridley T (2005) The Notch
ligands DLL1 and JAG2 act synergistically to regulate hair cell development in
the mammalian inner ear. Development 132:4353– 4362.
20. Ambrosetti DC, Scholer HR, Dailey L, Basilico C (2000) Modulation of
the activity of multiple transcriptional activation domains by the DNA binding
domains mediates the synergistic action of Sox2 and Oct-3 on the fibroblast
growth factor-4 enhancer. J Biol Chem 275:23387–23397.
21. Dailey L, Basilico C (2001) Coevolution of HMG domains and
homeodomains and the generation of transcriptional regulation by Sox/POU
complexes. J Cell Physiol 186:315–328.
22. Riccomagno MM, Takada S, Epstein DJ (2005) Wnt-dependent regulation
of inner ear morphogenesis is balanced by the opposing and supporting roles of
Shh. Genes Dev 19:1612–1623.
23. Ohyama T, Mohamed OA, Taketo MM, Dufort D, Groves AK (2006) Wnt
signals mediate a fate decision between otic placode and epidermis.
Development 133:865– 875.
24. Schimmang T (2007) Expression and functions of FGF ligands during
early otic develop-ment. Int J Dev Biol 51:473– 481.
25. Takemoto T, Uchikawa M, Kamachi Y, Kondoh H (2006) Convergence of
Wnt and FGF-signals in the genesis of posterior neural plate through activation
of the Sox2 enhancer N-1. Development 133:297–306.
26. Dabdoub A, et al. (2003) Wnt signaling mediates reorientation of outer
hair cell stereo-ciliary bundles in the mammalian cochlea. Development
130:2375–2384.