Cap.

12

Vacunas

La vacunación protege a un receptor de los agentes patógenos mediante el establecimiento de

una resistencia inmunológica a la infección. Una vacuna inyectada u oral induce al huésped a
generar anticuerpos contra el organismo que causa la enfermedad; por lo tanto, durante
exposiciones futuras, el agente infeccioso se inactiva (neutraliza o mata), se previene su
proliferación y no se establece el estado de la enfermedad. Hace más de 200 años, en 1796,
Edward Jenner probó experimentalmente la noción basada en el folclore de que la infección
humana con una enfermedad leve del ganado llamada viruela vacuna protegería a las personas
infectadas contra la viruela de la enfermedad humana. La viruela es una enfermedad
extremadamente virulenta con una alta tasa de mortalidad. Si uno sobrevive, la desfiguración
permanente, el trastorno mental y la ceguera a menudo siguen. Jenner inoculó a James Phipps, un
niño de 8 años, con exudado de una pústula de la viruela bovina. En dos ensayos separados
después de la vacunación inicial, el niño estaba completamente protegido contra la viruela
humana. Este médico de campo había descubierto el principio de la vacunación. Las enfermedades
transmisibles como la tuberculosis, la viruela, el cólera, el tifus, la peste bubónica y la poliomielitis
han sido en el pasado un flagelo para la humanidad. Con el advenimiento de la vacunación, los
antibióticos y las medidas efectivas de salud pública, estas enfermedades epidémicas, en su mayor
parte, han sido controladas (Tabla 12.1). Ocasionalmente, sin embargo, las medidas de protección
se vuelven ineficaces y ocurren nuevos brotes devastadores. En 1991, una epidemia de cólera
golpeó al Perú y produjo, en los siguientes 3 años, aproximadamente 1 millón de infecciones y
varios miles de muertes. Además, para muchas enfermedades humanas y animales actuales, no
hay vacunas. En la actualidad, más de 2.000 millones de seres humanos padecen enfermedades
que, teóricamente, podrían verse limitadas por la vacunación. Además, continúan surgiendo
nuevas enfermedades para las que las vacunas podrían ser útiles. En los últimos años, en algunos
países desarrollados, una minoría pequeña pero vocal de personas se ha negado a vacunar a sus
hijos. Estos individuos argumentan que muchas de las enfermedades previamente comunes han
sido vencidas, y temen los posibles efectos secundarios de las vacunas más que la enfermedad
misma. Además, muchas de estas personas cuestionan la medicina moderna y prefieren confiar en
los llamados tratamientos tradicionales o terapias naturales De hecho, el pequeño número de
individuos que no están vacunados se beneficia del hecho de que la gran mayoría de las demás
personas en la sociedad han sido inmunizadas, lo que dificulta que muchas enfermedades se
propaguen a través de una comunidad. Sin embargo, en las comunidades donde los niveles de
vacunación disminuyen por debajo de cierto nivel, existe un peligro real de que regresen algunas
enfermedades tradicionales. Las vacunas modernas típicamente consisten en una forma muerta
(inactivada) o viva, no virulenta (atenuada) de un agente infeccioso. Tradicionalmente, el agente
infeccioso se cultiva en cultivo, se purifica y se inactiva o se atenúa sin, por supuesto, perder la
capacidad de provocar una respuesta inmune que sea eficaz contra la forma virulenta del
organismo infeccioso. A pesar del considerable éxito que se ha logrado en la creación de vacunas
efectivas contra enfermedades como el sarampión alemán, la difteria, la tos ferina, el tétanos, la
viruela y la poliomielitis, existen varias limitaciones en el modo actual de producción de vacunas.

• No todos los agentes infecciosos pueden crecer en la agricultura, se han desarrollado vacunas
para una serie de enfermedades. • La producción de virus antropogénicos y humanos requiere una
cultura celular mínima, que es costosa. • Tanto el índice como la tasa de producción de virus
anónimos y humanos en la cultura suelen ser bastante bajos, lo que hace que la producción de
vacunas sea costosa. • Se requieren precauciones de seguridad extensas para asegurar que el
personal de laboratorio y de producción no esté expuesto a un agente patógeno. • Los lotes de
vacunas que no se han consumido pueden atenuarse de forma suficiente durante el proceso de
producción, introduciendo así organismos virulentos en la vacuna y propagando inadvertidamente
la enfermedad. • Las líneas atenuadas pueden ser revertidas, la aposibilidad requiere pruebas
continuas para garantizar que no se haya producido la readquisición de la virulencia. • Las
Notalldiseases (por ejemplo, síndrome de déficit inmunológico adquirido [SIDA]) se pueden
prevenir mediante el uso de vacunas tradicionales. • La mayoría de las vacunas actuales han
limitado su vida útil y a menudo requieren refrigeración para mantener la potencia. Este requisito
crea problemas de almacenamiento en países con áreas rurales grandes y no electrificadas.

En las últimas 2 décadas, la tecnología de ADN recombinante ha proporcionado un medio para

crear una nueva generación de vacunas que superan los inconvenientes de vacunas tradicionales.
La disponibilidad de la clonación de genes ha permitido a los investigadores contemplar varias
estrategias novedosas para el desarrollo de vacunas.

• La virulencia puede eliminarse de un agente infeccioso que conserva la capacidad de estimular

una respuesta inmunológica. En este caso, el agente genéticamente modificado podría usarse
como una vacuna viva sin preocuparse por la reversión a la virulencia, porque es imposible que un
gen completo se vuelva a adquirir espontáneamente durante el crecimiento en cultivo puro. • Se
podría crear un sistema vivo de anticuerpos no patogénicos que contenga determinantes discretos
antigénicos de un agente patógeno no relacionado. De esta forma, el sistema de soporte facilita la
inducción de una fuerte respuesta inmunológica dirigida contra el agente patógeno. • Para
agentes infecciosos que no se pueden mantener intactos, los genes para las proteínas que tienen
determinantes antigénicos críticos se pueden aislar, clonar y expresar en un sistema hospedador
alternativo, como Escherichia coli o una línea celular de mamífero. Estas proteínas génicas
clonadas se pueden formular en una vacuna. • Todos los agentes infecciosos que no dañan las
células de reserva directamente; en cambio, la afección de la enfermedad se produce cuando el
sistema inmune del huésped ataca sus propias células (infectadas). Al parecer, puede crearse un
sistema específico de destrucción celular específica. Aunque no es una vacuna verdadera, este tipo
de sistema ataca solo a las células infectadas, eliminando así la fuente de la respuesta
inmunológica adversa. En las cajas, se construye el gen de la proteína de fusión. En primer lugar,
una parte de esta proteína de fusión se une a una célula infectada. Entonces, la otra parte mata a
la célula infectada.

Debido a que no requieren estrictos requisitos regulatorios, las primeras vacunas que se
produjeron mediante técnicas de ADN recombinante fueron para enfermedades animales, como la
fiebre aftosa, la rabia y la diarrea, una enfermedad diarreica de cerdos y ganado. Además, en la
actualidad se están desarrollando muchas más vacunas para animales. En el caso de las
enfermedades humanas, un número cada vez mayor de vacunas recombinantes se encuentran en
diversas etapas de desarrollo, incluidos los ensayos clínicos (tabla 12.2). Desafortunadamente, en
comparación con la cantidad de nuevos agentes terapéuticos, se han desarrollado muy pocas
vacunas basadas en ADN recombinante. Según los productores de vacunas, ¿tardan tanto las
nuevas vacunas en llegar al mercado? Primero, aunque en el año 1970 había 25 fabricantes
principales de vacunas en todo el mundo, en 2005 solo había 5. En segundo lugar, actualmente las
vacunas se consideran casi como un producto básico, con pocos incentivos financieros desarrollar
nuevas vacunas; en 2005, el mercado mundial de vacunas preventivas fue de aproximadamente $
8 mil millones. En cuarto lugar, en 1980 en los Estados Unidos, se introdujeron "buenas prácticas
de fabricación" en la producción de vacunas, lo que ocasionó un aumento progresivo de los costos
de fabricación. En quinto lugar, la transición de procesos convencionales a nuevos para la
producción de vacunas es costosa. consume mucho tiempo (sin incluir los ensayos clínicos), por lo
que es preferible continuar utilizando una tecnología más establecida. En el lado positivo, el
enfoque de los fabricantes de vacunas más grandes en los productos a gran escala ha
proporcionado a las empresas de biotecnología más pequeñas una serie de oportunidades de
nicho para desarrollar y comercializar nuevos productos. Por último, dado que la mayoría de las
vacunas se destina a proteger grandes cantidades las poblaciones, las muy grandes cantidades de
dinero que las empresas a menudo cobran para tratar a una sola persona con algunos de los
agentes terapéuticos más nuevos (ver el capítulo 10) no son realistas para el precio de una nueva
vacuna. De hecho, es precisamente en muchos países más pobres, donde la mayoría de las
personas no pueden pagar mucho por el tratamiento o la inmunización, las vacunas son más
necesarias.

Vacunas de subunidades

Las vacunas generalmente consisten en formas muertas o atenuadas de todo el agente patógeno.
Los anticuerpos provocados por estas vacunas inician una respuesta inmune para inactivar
(neutralizar) organismos patógenos uniéndose a proteínas en la superficie externa del agente.
Entonces, ¿las vacunas necesitan contener todo el organismo, o partes específicas de organismos
patógenos? Los virus causantes de la forsisease, se debe a que las proteínas virales de la superficie
externa purificada, ya sea cápside o proteínas de la envoltura (Fig. 12.1), son suficientes
anticuerpos neutralizadores anteriores en el organismo hospedador. Las vacunas que usan
componentes de un organismo patógeno en lugar de todo el organismo se llaman vacunas de
"subunidad"; La tecnología de ADN recombinante es muy adecuada para desarrollar nuevas
vacunas de subunidades. El uso de vacunas de subunidades tiene ventajas y desventajas. En el
lado positivo, el uso de una o más proteínas purificadas como inmunógeno asegura que la
preparación sea estable y segura, se define químicamente con precisión, y está libre de proteínas
extrañas y ácidos nucleicos que pueden iniciar efectos secundarios indeseables en el organismo
huésped. En el lado negativo, la purificación de una proteína específica puede ser costosa, y en
ciertos casos, una proteína aislada puede no tener la misma conformación que in situ (dentro de la
cápside o envoltura viral), con el resultado de que su antigenicidad disminuye . Obviamente, la
decisión de producir una subunidad de vacuna depende de una evaluación de varios factores
biológicos y económicos.

Virus del herpes simple

El virus del herpes simple (VHS) se ha implicado como un agente cancerígeno (oncogénico),
además de sus funciones más comunes de causar enfermedades de transmisión sexual,
infecciones oculares graves y encefalitis, por lo que la prevención de la infección por VHS
mediante vacunación ya sea el virus muerto o atenuado puede poner al receptor en riesgo de
cáncer Por lo tanto, la protección contra el VHS se lograría mejor con una vacuna de subunidad,
que no sería oncogénica. El requisito principal para crear cualquier vacuna de subunidad es la
identificación del componente (s) del agente infeccioso que provoca anticuerpos que reaccionan
contra la forma intacta del agente infeccioso. La glicoproteína D (gD) de la envoltura de HSV tipo 1
(HSV-1) es un componente de este tipo, ya que después de la inyección en ratones, provoca
anticuerpos que neutralizan el HSV intacto. El gen gD de HSV-1 se aisló y luego se clonó en un
vector de expresión de mamífero y se expresó en células de crisotino chino (CHO) (figura 12.2),
que, a diferencia del sistema de E. coli, glicosila adecuadamente proteínas eucariotas extrañas. La
secuencia completa del gen gD codifica una proteína que se une a la membrana celular del
hospedero (Fig. 12.3A). Sin embargo, la proteína unida a la membrana es mucho más difícil de
purificar que una proteína soluble. En consecuencia, el gen gD se modificó mediante la eliminación
de los nucleótidos que codifican el dominio de unión a la transmembrana C-terminal (Fig. 12.3B).
El gen modificado se transformó en células CHO, donde el producto se glicosilaba y secretaba en el
medio externo (Fig. 12.2). En pruebas de laboratorio, la forma modificada de gD fue efectivo
contra HSV-1 y HSV-2. Fiebre Aftosa ScEYEnce Studios Glick / Pasternak: Biotecnología Molecular,
4e Fi

Virus de la fiebre aftosa

(FMDV)prueba y cerdos y es extremadamente virulenta, pero en su mayor parte, ha sido posible

mantener los efectos negativos del virus a un mínimo mediante el uso de formaldehído preparado
con formaldehído con formalina. Aproximadamente 1 billón de dosis de esta vacuna de virus
muertos se utilizan en todo el mundo cada año. A pesar de la disponibilidad de la vacuna, en 2001
se produjo un brote importante de fiebre aftosa en Europa en el que se produjeron decenas de
miles de sacrificados y sus cadáveres fueron incinerados en un esfuerzo por evitar que el virus se
propague. La investigación en FMDV encontró que el determinante del genoma mortal que induce
anticuerpos neutralizantes es la proteína 1 de la cápside viral (VP1). Aunque la VP1 purificada es
un antígeno mucho menos potente que las partículas víricas intactas, aún puede provocar
anticuerpos neutralizantes por sí mismo y, por lo tanto, puede proteger a los animales de la
infección por FMDV. Por lo tanto, el gen para VP1 se dirige hacia la biotecnología molecular,
clonación 4e. El genoma de FMDV se compone de ARN de cadena simple (aproximadamente 8,000
nucleótidos de longitud). Por lo tanto, para manipulaciones de ADN recombinante, primero fue
necesario sintetizar un ADN complementario bicatenario (ADNc) del genoma completo (Fig. 12.4).
Este ADNc se digirió luego con enzimas de restricción, y los fragmentos se clonaron en un vector
de expresión de E. coli. El producto de la secuencia de codificación de VP1 se identificó
inmunológicamente como parte de una proteína de fusión bajo el control del sistema represor pL
del promotor cI. La proteína de fusión tenía 396 aminoácidos de longitud y consistía en una
porción de una proteína transportadora estabilizadora, es decir, la proteína replicasa del
bacteriófago MS2, así como toda la secuencia codificante de la proteína FMDVVP1 (Fig. 12.4). La
proteína de fusión que contiene el fragmento de proteína VP1 era capaz de generar anticuerpos
neutralizantes contra FMDV. Sin embargo, una proteína de fusión enfrenta más obstáculos
regulatorios del gobierno que la VP1 intacta debido a los posibles efectos inmunogénicos de la
componente no VP1. Por lo tanto, la secuencia de VP1 sola tendrá que subclonarse en un vector
de expresión diferente. Sin embargo, una vacuna de subunidad para la fiebre aftosa pronto podría
estar lista para ensayos preclínicos.

Cólera
La bacteria Vibrio cholerae, el agente causal del cólera, coloniza el intestino delgado y secreta
grandes cantidades de una enterotoxina hexámera, que es el agente patógeno real. Esta proteína
consta de una subunidad, la subunidad A, que tiene actividad de ribosilación de ADP y estimula la
adenilato ciclasa, y una subunidad B idéntica que se une específicamente a un receptor de células
de la mucosa intestinal (Fig.12.5). Los dominios funcionales de Subunidad: el péptido A1, que
contiene la actividad tóxica, y el péptido A2, que se une a las
subunidadesAsubunittothe.Untilafewyearsago , la vacuna contra el cólera tradicional que consiste
en V. cholerae muerto con fenol era de uso común. Esta vacuna generó solo una protección
moderada, que típicamente dura de 3 a 6 meses. Más recientemente, se ha comenzado a utilizar
una vacuna (Dukoral) consistente en cepa clásica Inaba de V. cholerae activada por calor, cepa
clásica Ogawa inactivada por calor, cepa Inaba El Tor inactivada con formalina, cepa Ogawa
inactivada con formalina y subunidad recombinante de coleratoxina en B. La vacuna se toma por
vía oral (dos dosis con una semana de diferencia), y se afirma que no se requiere una vacuna de
refuerzo adicional durante aproximadamente 2 años.

SARS

En 2003, hubo brotes más o menos simultáneos en varias ciudades importantes, como Hong Kong,
Singapur y Toronto, de una enfermedad nueva y desconocida. El primer caso de esta enfermedad,
síndrome respiratorio agudo severo o SARS, se notificó en la provincia de Guangdong, sur de la
República Popular de China, en noviembre de 2002. Dada la enorme frecuencia de los viajes
aéreos, la enfermedad se extendió rápidamente a 29 países en cinco continentes. Con la asistencia
de la Organización Mundial de la Salud, las autoridades de las regiones afectadas implementaron
de inmediato procedimientos estrictos de control de infecciones, por lo que a mediados de julio de
2003, el brote se contuvo efectivamente. Sin embargo, esto no fue antes de un total de 8,096
casos de SRAS y se informaron 774 muertes asociadas. En muy poco tiempo, los científicos
identificaron un nuevo coronavirus como agente causal de la enfermedad. El virus del SARS
contiene un genoma de ARN con sentido positivo de cadena sencilla de aproximadamente 30 kb.
En la naturaleza, la proteína viral del pico, que se inserta en la membrana viral, se une a una
proteína receptora que está presente en las superficies de las células hospedadoras de mamíferos
(Fig. 12.6). Después de la unión del receptor del virus, las membranas celulares y venosas pueden
fusionarse, facilitando así la entrada del virus en la célula. La proteína spike (o la porción externa
de la molécula) es un candidato atractivo para el desarrollo de una vacuna de subunidad. En la
práctica, se descubrió que la porción externa de la proteína spike (es decir, los aminoácidos 318 a
510) podía enlazar de manera eficiente con la proteína receptora celular. Tras la determinación de
la secuencia de nucleótidos completa del virus SARS en 2003, fue relativamente sencillo expresar
una versión optimizada de codones de este péptido de 192 aminoácidos en células CHO. Además
de codificar el péptido puntiforme de 192 aminoácidos, la construcción de ADN introducida en las
células CHO también incluía una señal de secreción de mamífero, una etiqueta de purificación de
proteína A N-terminal (Staphylococcus aureus) y una proteascleagujasita de virus de grabado de
tabaco (Fig. 12.7). Las proteínas recombinantes sintetizadas en células CHO se secretaron en el
medio de crecimiento, se purificaron por cromatografía de afinidad en una columna que contenía
inmunoglobulina G inmovilizada y luego se digirieron con proteasa de virus de grabado de tabaco
para eliminar la etiqueta de purificación de proteína A. Usando esta construcción, el fragmento de
proteína de pico se sintetizó y purificó fácilmente. Hasta la fecha, se ha demostrado que la forma
completamente glucosilada de esta vacuna de subunidad candidata provoca una respuesta
inmune fuerte en ratones. Todavía está por ver si puede proteger a los animales inmunizados
contra la infección con el virus SARS.

Staphylococcus aureus

La bacteria Gram-positiva S. aureus es una causa importante de infección adquirida en el hospital.

Esta bacteria produce una toxina formadora de poros; es la principal causa de infecciones del
torrente sanguíneo, el tracto respiratorio inferior y la piel; y, debido a la aparición de cepas
resistentes a los antibióticos, es una grave amenaza para la salud pública. Para abordar el desafío
de tratar infecciones por S. aureus, Se han desarrollado vacunas de células enteras atenuadas o
muertas. Sin embargo, estas vacunas no han sido particularmente efectivas. De forma similar, las
vacunas de subunidades compuestas de proteínas de superficie bacterianas individuales generan
respuestas inmunes que proporcionan solo protección parcial cuando se prueban en animales de
experimentación. Sin embargo, recientemente se ha desarrollado una subunidad de vacuna más
eficaz para proteger a los individuos contra S. aureus combinando varios de los antígenos de la
bacteria (Fig. 12.8). Comenzando con la cepa de S. aureus causante de la enfermedad, se
identificaron 23 proteínas bacterianas de la superficie externa a partir de ADN genómico datos de
secuencia Luego, las regiones codificantes de estas proteínas, menos las secuencias señal, fueron
amplificadas y clonadas en vectores plasmídicos que permitieron que las proteínas se expresaran
en E. coli con una etiqueta poli-His en el extremo N del proteína (para facilitar la purificación de la
proteína sobreexpresada). Las proteínas se expresaron y se purificaron, y los ratones se
inmunizaron por separado con cada una de las 23 proteínas purificadas. Los ratones inmunizados
se desafiaron posteriormente mediante inyecciones de S. aureus causante de enfermedades vivas.
Muchas de las proteínas de superficie recombinantes generaron una respuesta inmune que
proporcionó protección parcial contra la enfermedad estafilocócica, y algunas proteínas
proporcionaron más protección que otras. Sin embargo, a largo plazo, la inmunización con
proteínas de superficie individuales solo proporcionó una protección modesta. Se utilizó una
mezcla de las cuatro proteínas que individualmente generaban los anticuerpos más efectivos para
inmunizar ratones y se descubrió que protegía completamente contra el patógeno. El diseño
experimental aseguró que solo se usaron proteínas de superficie de S. aureus comunes y no
específicas de cepa para inmunizar ratones. Por lo tanto, no es sorprendente que la vacuna de
subunidad tetravalente que se desarrolló fuera efectiva contra cinco aislados (cepas) clínicos
diferentes de S. aureus. Este trabajo representa un primer paso importante en el desarrollo de una
vacuna contra S. aureus.

Virus del Papiloma Humano

Prueba El virus del papiloma humano es el agente causal de muchas enfermedades de transmisión
sexual comunes. Si bien la mayoría de estas infecciones son benignas y a menudo la infección
asintomática y persistente con algunas cepas de virus del papiloma humano está asociada con el
desarrollo de cánceres cervicales y relacionados, así como con verrugas genitales. Dado que el
virus del papiloma humano tipo 16 se asocia con aproximadamente el 50% de los cánceres de
cuello uterino, una vacuna que previene la infección por el virus del papiloma humano tipo 16
podría reducir significativamente la incidencia de cáncer de cuello uterino. Además, una vacuna
que se dirige contra varios tipos diferentes de virus del papiloma humano podría prevenir de
forma efectiva casi todos los cánceres de cuello uterino inducidos por el virus del papiloma
humano. Para poner esto en perspectiva, el cáncer de cuello uterino es el segundo cáncer más
comúnmente diagnosticado entre las mujeres en todo el mundo, lo que representa más de
250,000 muertes por año. ScEYEnce Studios g. 12.09 En junio de 2006,
U.S.FoodandDrugAdministration aplicó una vacuna que protege a las mujeres contra la infección
por el virus del papiloma humano tipos 6, 11, 16 y 18, los tipos más frecuentemente asociados con
cáncer cervical y complicaciones genitales. Hacia fines de 2006, esta vacuna había sido aprobada
para su uso en más de 50 países en todo el mundo. La vacuna, llamada Gardasil, es cuadrivalente,
es decir, contiene partículas parecidas a virus ensambladas a partir de las principales proteínas de
la cápsida (L1) de los mencionados tipos de virus del papiloma humano (Fig.12.9 y Boox12.1).
Anteriormente mostraba que la proteína L1 puede autoensamblarse en partículas similares a virus
que se parecen al virus del papiloma viriones, y estas partículas son altamente inmunogénicas,
induciendo anticuerpos neutralizantes contra el virus vivo. El gen para la proteína L1 de cada uno
de los cuatro tipos de virus fue clonado y expresado en una cepa recombinante de Saccharomyces
cerevisiae. Después de las distintas fermentaciones de las cuatro cepas de levadura, las proteínas
de la cápside viral se ensamblaron en virus como partículas (es decir, la cápside viral sin otras
proteínas virales o el ácido nucleico viral). Estas partículas similares a virus se purificaron y
combinaron para formar la vacuna tetravalente.

Vacunas peptídicas

Se plantea la cuestión de si una pequeña parte discreta (dominio) de una proteína puede actuar
como una subunidad eficaz de la vacuna e inducir la producción de anticuerpos neutralizantes.
Intuitivamente, uno esperaría que solo las porciones, o dominios, de una proteína que son
accesibles a la unión de anticuerpos, es decir, aquellos en la superficie exterior del virus, serían
inmunológicamente importantes y aquellos ubicados en regiones inaccesibles dentro de la
partícula del virus. podría ser ignorado si no contribuyen a la conformación de
theimmunogenicdomain (Fig.12.10) .Si este argumento es válido, es posible que los péptidos
cortos que imitan epítopes (determinantes antigénicos) sean inmunogénicos y puedan utilizarse
como vacunas (vacunas de péptidos). Sin embargo, existen ciertas limitaciones para usar péptidos
cortos como vacunas:

• Para que sea eficaz, el anepitopemo debe consistir en la extracción prolongada de aminoácidos
contiguos, que no siempre ocurre de manera natural. • El péptido debe ser capaz de asumir la
misma información que el epítopo en la partícula viral intacta. • Un solo péptido no es
suficientemente inmunogénico.

Fiebre aftosa

Se identificaron los péptidos de las células del antimicrobiano soluble antimicrobiano FMDVVP1
de la estructura cristalográfica de rayos X, y los dominios sintetizados químicamente de la proteína
se probaron como vacunas peptídicas candidatas. Péptidos correspondientes a los aminoácidos
141 a 160, 151 a 160 y 200 a 213, que se encuentran cerca del extremo C-terminal de VP1, y los
aminoácidos 9 a 24, 17 a 32 y 25 a 41, que son localizado cerca del extremo N-terminal de VP1,
cada uno se unió a una proteína transportadora inerte separada (hemocianina de lapa
californiana) y se inyectó en agapornícolas inguinales (Fig. 12.11). Los péptidos verdes se
reutilizaron ociosamente degradados a menos que estén unidos a la superficie de una molécula
portadora más grande. Una inoculación única con el péptido 141 a 160 provocó suficientes
anticuerpos para proteger a los retoques posteriores con FMDV. Por el contrario, la inoculación
con VP1 completa o péptido 9 a 24, 17 a 32 o 25 a 41 produjo niveles más bajos de anticuerpos
neutralizantes. En un experimento adicional, un péptido más largo que consiste en los
aminoácidos 141 a 158 unido a los aminoácidos 200 a 213 por dos residuos de prolina provocó
altos niveles de anticuerpos neutralizantes en cobayas, incluso cuando se inyectó sin ninguna
proteína transportadora. Esta molécula de "dos péptidos" fue más efectiva que cualquiera de los
péptidos únicos solos e impidió la proliferación de FMDV en la captura, así como en los eucaliptos.
Aunque estos resultados fueron prometedores, la cantidad (dosis) de material peptídico que debía
usarse para provocar una respuesta inmunológica fue de aproximadamente 1000 veces más que la
cantidad de FmDV activada necesaria para provocar la misma respuesta. En cuanto a este
problema, el ADN que codifica el péptido VP1 de FMDV 142 a 160 se unió al gen que codifica un
altamente inmunoScEYEnce Studios g. 12.11 geniccarriermolecule, hepatitisBviruscorentigen
(HBcAg). Cuando el gen para esta proteína de fusión se expresó en E. coli o células animales en
cultivo, las moléculas de proteína se autoensamblaron en "partículas estables de 27 nm", con el
péptido FMDVVP1 localizado en la superficie superior de la partícula. Estas partículas son
altamente inmunogénicas en animales de laboratorio. Por lo tanto, HBcAg puede ser una molécula
transportadora efectiva para estos péptidos sinteticos. Una comparación de las
inmunogenicidades en cobayas de una variedad de vacunas de VPHP, todas las cuales contenían la
secuencia del VPP142 a 160, reveló que la proteína de fusión con HBC y FMDVVP1 aminoácidos
142 a 160 era aproximadamente 1/10 tan inmunogénica como las partículas de FMDV inactivadas,
35 veces más inmunogénica proteína de fusión que contiene β-galactosidasa de E. coli y
aminoácidos FMDVVP1137 a162 y 500 veces más inmunogénica que la libre péptido sintético
compuesto de aminoácidos142 a 160. Debido a que los péptidos sintéticos se fusionan con HBcAg
no infectan el ensamblaje de las partículas de 27% de hepatitis Bvirus, y debido a que estas
partículas son casi tan inmunogénicas como el virus intacto del que se deriva el péptido sintético,
este enfoque puede convertirse en un método general para el suministro de vacunas peptídicas.

Malaria

El género Plasmodium consiste en aproximadamente 125 especies conocidas de protozoos

parásitos, 5 de los cuales se sabe que infectan a los humanos y causan malaria. El ciclo de vida de
Plasmodium es muy complejo. Los esporozoítos de la saliva de un mosquito hembra mordiente se
transmiten a la sangre o al sistema linfático y luego migran al hígado e invaden las células del
hígado (hepatocitos) (Fig.12.12). Los bultos de los parásitos de los hepatocitos contienen cientos o
miles de merozoitos. Estos merosomas se alojan en los capilares pulmonares y se desintegran
lentamente allí, generalmente durante 2 o 3 días, liberando merozoitos. Los merozoitos invaden
los glóbulos rojos, donde el parásito se divide varias veces para producir nuevos merozoitos, que
luego abandonan los glóbulos rojos y viajan dentro del torrente sanguíneo para invadir nuevos
glóbulos rojos. El parásito eventualmente forma gametocitos, que quizás se ingieren al alimentar
mosquitos. La fusión del gametocito conduce a la formación de nuevos esporozoitos en el
mosquito que pueden infectar a nuevos individuos y propagar la enfermedad. En el ciclo de vida
del parásito de la malaria, es la multiplicación asexual del estadio de la sangre la responsable de la
mayoría de los síntomas agudos de la enfermedad. En áreas donde la malaria es endémica,
algunas personas muestran una resistencia considerable a la enfermedad a pesar del hecho de que
cuando se examina su sangre se las encuentra portadoras del parásito. Se demostró que esta
resistencia a los peores síntomas de la malaria es el resultado de un mecanismo de "inhibición
celular dependiente de anticuerpos" que inhibe el desarrollo del parásito. En otras palabras,
algunas personas que estaban infectadas con el parásito de la malaria fabricaron anticuerpos
contra una proteína del parásito que impidió el crecimiento del parásito. Después del estudio, se
determinó que los anticuerpos protectores se dirigían a la proteína 3 de superficie de merozoito.
Cuando esta proteína se examinó en diferentes cepas de Plasmodium, observó que aunque la
parte N-terminal de la proteína variaba considerablemente de una cepa a otra, el extremo C-
terminal de la proteína estaba altamente conservado entre los diversos aislados del parásito. Por
lo tanto, se decidió sintetizar químicamente péptidos que correspondían a pequeñas porciones del
extremo C de la proteína 3 de superficie de merozoito. Los anticuerpos humanos de individuos
que eran resistentes al parásito se purificaron por afinidad basándose en su interacción con uno o
más de estos péptidos. Los anticuerpos que se unieron a los péptidos se analizaron luego en un
ensayo de inhibición celular dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos dirigidos contra los
péptidos B, C y D (Fig. 12.13) tienen mayor efecto inhibidor sobre el crecimiento de los parásitos.
Debido a la capacidad de los péptidos B, C y D para unirse y seleccionar anticuerpos protectores,
se sintetizó químicamente un péptido que representa los residuos de aminoácidos 181 a 276 de la
proteína de superficie de merozoito. Este péptido se está probando actualmente en ensayos
clínicos como una nueva vacuna contra la malaria. Si bien es necesario realizar más
investigaciones, en el futuro, las vacunas de péptidos sintéticos podrían convertirse en alternativas
altamente específicas, relativamente económicas, seguras y efectivas a las vacunas tradicionales.

Inmunización genética: entrega de vacunas de ADN

Se ha desarrollado una nueva estrategia que provoca una respuesta de anticuerpos sin la
introducción de un antígeno. En este caso, el gen que codifica una proteína antigénica se
introduce en las células de un animal diana, donde se sintetiza el antígeno (Tabla 12.3). En los
experimentos iniciales, microproyectiles de oro se recubrieron con ADN plasmídico de E. coli que
porta un gen antígeno bajo el control transcripcional de un promotor de virus animal. Se usó un
sistema biolístico para administrar los microproyectiles a las células en los oídos de los ratones
(consulte el capítulo 18 para obtener una descripción más detallada del sistema biolístico). Otros
trabajadores introdujeron ADNc clonados en células de ratón inyectando grandes cantidades del
plásmido que lleva el ADN diana directamente en los músculos de animales de prueba. Sin
embargo, la "inmunización genética" efectiva mediante inyección directa en los músculos (100 μg
por ratón) requiere de 3 a 4 órdenes de magnitud más de ADN que el sistema de administración
biolística (10 a 100 ng por ratón). Una característica distintiva de la inmunización genética es que
se pasa por alto el procedimiento costoso y lento de purificar un antígeno o crear un vehículo de
administración de vacuna recombinante. Además, es más probable que las proteínas producidas
por este procedimiento se modifiquen correctamente después de la traducción que las proteínas
producidas por diferentes organismos hospedadores. Una ventaja de la inmunización genética,
además de pasar por alto la necesidad de antígenos proteicos purificados, es que puede
desencadenar una respuesta solo contra la proteína codificada en el plásmido y no contra el
propio plásmido. Además, cuando se introduce ADN de plásmido en un sistema de mamífero, solo
aquellos genes (o ADNc) bajo el control de señales reguladoras eucarióticas se transcribirán y
traducirán. Los genes de resistencia a antibióticos para mantener el plásmido en E. coli no se
transcribirán ni traducirán, y el mismo vector se puede usar para administrar diferentes proteínas
a un individuo al mismo tiempo, o la administración del mismo gen se puede repetir una cantidad
de veces. La viabilidad de la inmunización genética se ha examinado en detalle. En una serie de
experimentos, los ratones fueron inyectados en el cuádriceps de ambas piernas con un plásmido
de E. coli que porta el ADNc para la nucleoproteína del virus de la gripe A bajo el control
transcripcional de un virus del sarcoma de Rous o un promotor de citomegalovirus. Aunque la
expresión de la nucleoproteína fue demasiado baja para detectarla, se observaron anticuerpos
específicos de nucleoproteína en la sangre de los ratones de prueba 2 semanas después de la
inyección inicial. En comparación con los ratones control, los ratones inyectados con
nucleoproteína se protegieron significativamente frente a los efectos de la infección por virus de la
gripe (Fig. 12.14). Además, los ratones inyectados con nucleoproteína también estaban protegidos
contra una cepa diferente del virus de la gripe. Esta protección cruzada contrasta fuertemente con
las vacunas tradicionales contra el virus de la influenza, que están dirigidas contra los antígenos de
superficie del virus, de modo que cada vacuna es específica para una sola cepa de virus de la gripe.
Además, las vacunas tradicionales funcionan solo mientras los antígenos en la superficie del virus
no cambien. Desafortunadamente, los genes para los antígenos de superficie mutan a una tasa
alta, lo que crea diferencias significativas entre las cepas. Aunque los componentes centrales del
virus, como la nucleoproteína, son relativamente invariables, pueden activar el sistema inmune
por un mecanismo que es diferente al de los antígenos de superficie. Biotecnología Molecular, 4e
Se desconoce el destino del ADN introducido, y podría tener el efecto indeseable de integrarse en
el genoma de la célula huésped, posiblemente alterando un gen importante. Sin embargo,
actualmente se considera que este riesgo es extremadamente bajo. Es más probable que el ADN
exista durante un corto período como un elemento extracromosómico no replicativo antes de
degradarse. Hasta la fecha, la inmunización genética se ha utilizado principalmente para inducir
respuestas inmunes en animales, y en un grado más limitado en humanos, contra varios
organismos patógenos, incluidos virus de la influenza A, virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) tipo 1, herpesvirus bovino 1, virus de la rabia, especies de Plasmodium (que causan malaria),
virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, rotavirus bovino, virus sincicial respiratorio bovino, virus
de la seudorrabia, virus de la fiebre aftosa, Newcastledisease virus, Clostridium tetani (que causa
el tétanos) y Mycobacterium tuberculosis (que causa tuberculosis). Varios ensayos clínicos en
humanos que usan vacunas de ADN están actualmente en curso. Uno de los problemas con el uso
de vacunas de ADN en animales grandes y humanos en comparación con ratones es que la eficacia
de transfección del ADN plásmido introducido a menudo es insuficiente para generar una
respuesta inmune protectora. Un enfoque para suministrar ADN extraño a las células animales
utiliza partículas poliméricas microscópicas (0.3 a 1.5 μm) biodegradables con una superficie
catiónica que enlaza al ADN plasmídico (Fig. 12.15). El ADN plasmídico se une a las superficies de
estas "micropartículas" y se libera lentamente durante un período de 2 a 3 semanas después de la
inoculación de un animal. Usando micropartículas, fue posible lograr el mismo efecto biológico
que con el ADN desnudo con aproximadamente 250 veces menos ADN, lo que demuestra el
potencial de este enfoque. Además, el nivel de anticuerpos inducidos por la expresión de los genes
codificados por plásmido unidos a micropartículas se potenciaron significativamente mediante (i)
la adición del fosfato de aluminio adyuvante de la vacuna y (ii) el uso de nanopartículas de 0,05 μm
de diámetro que se recubrieron con poli-l-lisina. En contraste con el ADN desnudo, el ADN unido a
micropartículas indujo respuestas de linfocitos T citotóxicos potentes a una dosis baja. Hasta la
fecha, la mayoría de las vacunas de ADN se han administrado por inyección intramuscular o
intradérmica. Aunque estas vacunas pueden inducir una respuesta inmune potente, no inducen la
inmunidad de la mucosa. La inmunidad a la mucosa puede prevenir la entrada de patógenos en el
cuerpo, mientras que la inmunidad sistémica trata con los patógenos solo una vez que están
dentro del cuerpo. Esta es una consideración importante porque las superficies de la mucosa,
incluidos los tractos respiratorio, intestinal y urogenital, son los sitios principales de transmisión de
muchas enfermedades infecciosas. Sin embargo, debido a las barreras protectoras de las
superficies de la mucosa, las vacunas tradicionales basadas en antígenos son en gran medida
ineficaces a menos que se administren con agentes específicos que penetren o se unan a la
mucosa, es decir, adyuvantes de la mucosa. La inmunidad de la mucosa induce una respuesta
separada y distinta de la inmunidad sistémica. Los anticuerpos producidos como parte de la
respuesta inmune de la mucosa restringen no solo a los patógenos de la mucosa, sino también a
los microorganismos que inicialmente colonizan las superficies de la mucosa y luego causan una
enfermedad sistémica. Muchas vacunas de mucosa son organismos vivos atenuados que infectan
las superficies de la mucosa y son efectivos para inducir respuestas en la mucosa. De estos, las
vacunas orales contra la polio y las vacunas atenuadas de Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a
y Vibrio cholerae están autorizadas para su uso en humanos. Las vacunas de ADN que están
diseñadas para el suministro a las superficies de la mucosa son similares en principio a las
utilizadas para la administración intramuscular o intradérmica. Para aumentar la absorción del
plásmido y disminuir su degradación posterior, se han probado varios métodos de formulación de
ADN. Por ejemplo, los liposomas catiónicos (cargados positivamente) se han usado para
suministrar ADN (que tiene una cadena principal de fosfato cargada negativamente) al tracto
respiratorio y se ha usado el ADN en micropartículas biodegradables para la administración oral de
ADN extraño. Además, para mejorar la potencia de las vacunas de ADN para humanos, se han
diseñado varias estrategias, que incluyen el uso de plásmidos que, además de codificar un gen
diana, también expresan una (s) citocina (s), como la interleucina-2 (IL-2), IL-10, o IL-12
(whichcanactasan 2nd Proof3rd Proof mediador intercelular en la generación de una respuesta
inmune). Se ha intentado una gama de sistemas, incluidos liposomas, vectores vivos (bacterias y
virus) y una amplia gama de adyuvantes que aumentan la respuesta inmune (toxinas bacterianas,
carboximetilcelulosa, derivados lipídicos, sales de aluminio y saponinas) para la administración de
ADN a diferentes tipos de células. Por necesidad, varias estrategias de optimización se prueban en
ratones antes de que se prueben en animales más grandes y luego en humanos, sin ninguna
garantía de que un enfoque que funcione bien en ratones también sea una estrategia exitosa en
humanos. Sin embargo, dadas las muchas ventajas percibidas de la inmunización genética sobre el
uso de vacunas convencionales (Tabla 12.3), esto ha demostrado que 1st ProofFinal4rd Proof es
un campo activo de investigación. Por ejemplo, la electroporación se ha usado para aumentar la
transfección del ADN que codifica antígenos diana. Con este enfoque, el ADN se inyecta por vía
intramuscular, y el músculo esquelético se estimula de forma eléctrica inmediatamente con un
generador de impulsos. A pesar de que este procedimiento, que causa cierta incomodidad en el
paciente, produce lesiones tisulares locales e inflamación, es tolerado por los pacientes sin la
necesidad de anestesia, y no parece haber efectos secundarios negativos a largo plazo para la
administración del ADN. De este modo. Más probable, el impulso eléctrico aumenta la eficacia de
transfección del ADN añadido y se está convirtiendo en un método de elección para la
administración clínica de vacunas de ADN. Se desarrolló una cepa modificada de la bacteria
invasora Shigella flexneri para facilitar el suministro de ADN a las células animales para la
inmunización genética (Fig. 12.16). Shigella puede entrar en las células epiteliales de los animales,
escapando de la vacuola fagocítica, y la bacteria puede dirigir el ADN plásmido a el núcleo de la
célula huésped, donde, si el / los gen (es) introducido (s) contiene (n) un promotor eucariótico, se
transcribe. Shigella es normalmente un organismo patógeno y no sería un sistema de
administración de ADN aceptable. Por lo tanto, para usar Shigella, primero fue necesario construir
una versión no patógena del organismo de tipo salvaje al (1) diseñar la bacteria con deficiencia de
toxina y (2) realizar una mutación de deleción en el gen asd de Shigella, que codifica la enzima
aspartato β-semialdehído deshidrogenasa. Esta enzima normalmente está implicada en la síntesis
del ácido diaminopimélico constitutivo de la pared celular bacteriana; por lo tanto, el mutante no
puede crecer a menos que se añada ácido diaminopimélico al medio de crecimiento. Las cepas de
Shigella con la mutación asd pueden invadir las células epiteliales de los animales y liberar su ADN
plasmídico; sin embargo, una vez que están presentes, las células de Shigella no pueden proliferar.
La determinación de la seguridad del uso de Shigella como vector para la administración de ADN a
las células animales debe esperar los resultados de los ensayos en humanos; sin embargo, los
resultados de los experimentos con conejillos de Indias son prometedores. La mayor ventaja
potencial de este enfoque es que con el sistema Shigella, ADN para la vacunación puede
administrarse por vía oral, lo que simplifica enormemente la administración de una variedad de
vacunas. Algunas limitaciones de las vacunas basadas en plásmidos son (1) la necesidad de
promotores fuertes que funcionen in vivo para transcribir selectivamente el ADN introducido, (2)
bajos niveles de expresión de genes extraños como resultado de las diferencias en el uso de
codones entre el gen introducido (a menudo origen viral, bacteriano o parasitario) y el animal que
se está inoculando, y (3) la presencia de genes marcadores genéticos de resistencia a antibióticos
en el vector plasmídico. Para evitar el uso de genes marcadores de resistencia a antibióticos, los
investigadores han desarrollado una serie de vectores de expresión de genes minimalistas
definidos inmunogénicamente (MIDGE) (Fig. 12.17). Después de la inserción del gen de interés en
un MIDGE vector, el gen de resistencia a antibióticos se escinde del vector, y se añade un
capuchón de oligonucleótido específicamente a ambos extremos del ADN linealizado que contiene
solo un promotor / intrón, el gen de interés y una señal de poliadenilación. La porción restante del
plásmido se degrada por exonucleasas. Los extremos con tapa son resistentes a la digestión con
exonucleasa. El vector MIDGE lineal purificado y tapado se usa luego directamente para la
transfección. Estos vectores se han usado con éxito como un sustituto de vectores plasmídicos. La
vacunación de macacos rhesus (monos) con ADN que codifica proteínas del virus de
inmunodeficiencia simia, seguido de un refuerzo con un virus vaccinia modificado que codificaba
muchas de las mismas proteínas, protegió al mono contra el virus de la inmunodeficiencia
bimusiva (Fig.12.18). El ADN inyectado a 0 y 8 semanas expresaron las proteínas del virus de
inmunodeficiencia simia Gag, Pol, Vif, Vpx y Vpr, así como las proteínas del VIH tipo 1 Env, Tat y
Rev. El virus vaccinia recombinante expresó las proteínas del virus de inmunodeficiencia simia Gag
y Pol y la proteína del VIH Env, todo bajo el control de los promotores del virus vaccinia, y se
administró a las 24 semanas. La protección contra el virus de la inmunodeficiencia simia a los 7
meses después del refuerzo con el virus vaccinia modificado recombinante fue mucho mayor que
la protección con cualquiera de los tratamientos por sí mismo. Este procedimiento también
confiere inmunidad contra un desafío viral de la mucosa. Esta característica es importante porque
el sitio de entrada del virus en el host simio está efectivamente bloqueado. También es digno de
mención que la inmunidad fue principal

Caries dental

Las bacterias grampositivas, facultativamente anaeróbicas Streptococcus mutans y Streptococcus

sobrinus se consideran los principales agentes causantes de la caries dental (caries dental). Estos
organismos colonizan las superficies dentales y metabolizan la sacarosa para producir ácido
láctico, lo que hace que el esmalte dental se vuelva vulnerable a la descomposición. La sacarosa
también se usa para producir un polisacárido pegajoso extracelular a base de dextrano (glucano)
que facilita que las células de Streptococcus se adhieran unas a otras y a las superficies de los
dientes, formando placa. Es la combinación de placa y ácido lo que conduce a la caries dental. Dos
regiones de una de las proteínas de adhesión que se encuentran en las superficies de las células de
S. mutans y S. sobrinus son importantes en la adherencia inicial de estas superficies bacterianas:
en consecuencia, es una solución rica en residuos aniónicos, mientras que la otra es rica en
residuos de prolina. Otro componente importante del mecanismo de la caries dental es la enzima
glucosiltransferasa, que es responsable de la síntesis de glucano, un polímero extracelular
insoluble.

de restos de glucosa. Una vacuna de ADN diseñada para prevenir la caries dental incluía las
secuencias codificantes para un péptido rico en alanina y prolina, así como el dominio C-terminal
de una Streptococcus glucosyltransferase. Este dominio C-terminal es necesario para la unión de la
glucosiltransferasa a la superficie de la célula bacteriana. Por lo tanto, esta vacuna de ADN codifica
dos péptidos separados, los cuales facilitan la unión de las células de Streptococcus a la superficie
del diente. En un intento de superar la tendencia de muchas vacunas de ADN a inducir solo una
respuesta inmune débil, la construcción de la vacuna de ADN contenía dos elementos adicionales:
en primer lugar, el dominio extracelular del linfocito antígeno 4 citotóxico (CTLA4), que se expresa
en la superficie de las células presentadoras de antígeno, se incluyó en la construcción. (Fig.
12.19). En segundo lugar, se incluyó la Fragmentación de una molécula de inmunoglobulina G, que
puede unirse al Fcreceptor en la célula presentadora de antígeno, en esta construcción. El uso de
ambos de estos péptidos se diseñó para dirigir específicamente la proteína de fusión
multimíndrome (Fig. 12.19) a las células del sistema inmunitario y de ese modo amplificar la
respuesta inmune y mejorar la eficacia de la vacuna. De hecho, los conejos inmunizados con esta
vacuna, ya sea por vía intranasal o por vía intramuscular, muestran una mejora de forma
significativa la respuesta sistémica y mucosal inmune, específica en comparación con la
inmunización con sólo el péptido alanina y rica en prolina fusionado con el dominio C-terminal de
glucosiltransferasa. Además, posteriormente se demostró que esta vacuna de ADN podría
proporcionar una protección significativa contra la caries dental en ratas que fueron expuestas a S.
mutans y S. sobrinus. Aunque todavía es necesario abordar el problema de la administración de la
vacuna de ADN a los seres humanos para poder probar su eficacia clínica, esta es una estrategia
muy prometedora que podría ser enormemente beneficiosa para las poblaciones humanas.

Vacunas atenuadas

En algunos casos, la manipulación genética puede usarse para construir organismos modificados
(bacterias o virus) que se usan como vacunas recombinantes vivas. Estas vacunas son organismos
no patógenos que se han diseñado para transportar y expresar determinantes antigénicos a partir
de un agente patógeno diana o cepas modificadas genéticamente de organismos patógenos en los
que los genes de virulencia se han modificado o eliminado. En estos casos, como parte de una
bacteria o un virus, los importantes determinantes antigénicos se presentan al sistema inmune
con una conformación que es muy similar a la forma del antígeno en el organismo causante de la
enfermedad. Aunque es exitoso en algunos casos, el antígeno purificado solo a menudo carece de
la conformación nativa y provoca una débil respuesta inmunológica. Cólera Por lo general, es
ventajoso desarrollar una vacuna viva, ya que generalmente son mucho más efectivas que las
vacunas muertas o subunitarias. El principal requisito para una vacuna viva es que no haya formas
virulentas presentes en el material de inoculación. Con este objetivo en mente, se ha desarrollado
una vacuna contra el cólera en vivo. El cólera, causado por la bacteria V. cholerae, es una
enfermedad intestinal de tipo fastativo caracterizada por fiebre, deshidratación, dolor abdominal y
diarrea. Se transmite al beber agua contaminada con materia fecal. En los países en desarrollo, la
amenaza del cólera es una preocupación de salud real e importante cuando los sistemas de
purificación de agua y eliminación de aguas residuales son inadecuados. Dado que V. cholerae
coloniza la superficie de la mucosa intestinal, se razonó que una vacuna contra el cólera eficaz
debería administrarse por vía oral y dirigirse a esta estructura. Con esto en mente, se creó una
cepa de V. cholerae con parte de la secuencia de codificación para el péptido A1 eliminado. Esta
cepa no puede producir enterotoxina activa; por lo tanto, no es patógeno y es un buen candidato
para una vacuna viva. Específicamente, en este experimento, se incorporó un gen de resistencia a
la tetraciclina en la secuencia de ADN del péptido A1 en el cromosoma de V. cholerae. Esta
inserción inactivó la actividad del péptido A1 y también hizo la cepa resistente a la tetraciclina.
Aunque la secuencia del péptido A1 se ha alterado, la cepa no es aceptable como vacuna debido a
que el gen de resistencia a la tetraciclina insertado puede escindir espontáneamente, restaurando
así la actividad de la enterotoxina. En consecuencia, fue necesario diseñar una cepa con una
secuencia de péptido A1 defectuosa que no podría revertirse (Fig. 12.20).

1. Un plásmido que contiene el segmento de ADN clonado para el péptido A1 se digirió con
las enzimas de restricción ClaI y XbaI, cada una de las cuales cortó solo dentro de la
secuencia de codificación del péptido A1 del inserto. 2. Para recircularizar el plásmido, se
añadió un enlazador XbaI al sitio ClaI y luego se cortó con XbaI. 3. Se usó T4 ADN ligasa
para unir el plásmido en los sitios XbaI, eliminando de este modo un segmento de 550
pares de bases del centro de la región codificadora del péptido A1. Esta deleción eliminó
183 de los 194 aminoácidos del péptido A1. 4. Luego, mediante conjugación, el plásmido
que contiene la secuencia codificante del péptido A1 delecionado se transfirió a la cepa de
V. cholerae que porta el gen de resistencia a la tetraciclina dentro de su secuencia de ADN
del péptido A1.
5. La recombinación (un cruce doble) entre la secuencia codificante A1 restante en el
plásmido y el gen peptídico A1 alterado por el gen de resistencia a tetraciclina en el
cromosoma reemplazó la secuencia codificante del péptido A1 cromosómico con el
segmento homólogo en el plásmido que porta la deleción. 6. Después del crecimiento
durante varias generaciones, el plásmido extracromosómico, que es inestable en V.
cholerae, se perdió espontáneamente. 7. Las células con un péptido A1 defectuoso
integrado se seleccionaron sobre la base de su sensibilidad a tetraciclina. Las células
deseadas ya no tenían el gen de resistencia a la tetraciclina, pero portaban la secuencia
del péptido A1 con la deleción.
Una cepa estable con una secuencia de péptido A1 que contiene una eliminación se
seleccionó de esta manera. Esta cepa no produjo enterotoxina activa, pero sin embargo
retuvo todas las otras características bioquímicas de la forma patógena de V. cholerae; es
decir, V. cholerae con un péptido A1 que contiene una deleción es una buena vacuna
candidata porque la bacteria que sintetiza solo A2 y bicapside inmunogenica estimulan la
bacteria. Cuando se evaluó el tren en ensayos clínicos para evaluar su eficacia como
vacuna contra el cólera, los resultados fueron equívocos. Si bien la vacuna confirió casi el
90% de protección contra la enfermedad diarreica en voluntarios, indujo efectos
secundarios en algunos de los que fueron evaluados. Esta cepa puede requerir
modificación en otro locus cromosómico antes de que pueda usarse como vacuna.
Especies de Salmonella
Otros intentos de diseñar cepas no patógenas de bacterias patógenas que podrían usarse
como vacunas vivas han implicado deleciones en regiones cromosómicas que codifican
funciones independientes y esenciales. Se prefieren al menos dos eliminaciones, porque la
probabilidad de que ambos conjuntos de funciones puedan readquirirse simultáneamente
es muy pequeña. Se supone que una cepa "doblemente delecionada" tendría una
capacidad limitada de proliferación cuando se utiliza como vacuna, lo que reduce su
patogenicidad al mismo tiempo que le permite estimular una respuesta inmunológica. Las
cepas del género Salmonella causan fiebre entérica, muerte infantil, fiebre tifoidea e
intoxicación alimentaria. Por lo tanto, se necesita una vacuna efectiva contra estos
organismos. Se han usado deleciones en varios genes diferentes para atenuar diversas
cepas de Salmonella (Tabla 12.4). Estas mutaciones se pueden agrupar en tres categorías
básicas: mutaciones en (1) genes biosintéticos, (2) genes reguladores y (3) genes
implicados en la virulencia. Además, se han reconstruido cepas con más de una deleción.
Por ejemplo, una cepa de doble deleción tiene deleciones en los genes aro, que codifican
enzimas implicadas en la biosíntesis de compuestos aromáticos, y en los genes pur, que
codifican enzimas implicadas en el metabolismo de la purina. Estas cepas de doble
deleción, que pueden cultivarse en un medio completo y enriquecido que suministra los
nutrientes que faltan, generalmente establecen infecciones de bajo nivel, ya que sus
células hospedadoras contienen solo un nivel muy bajo de los metabolitos que requieren
para el crecimiento. Por lo general, su virulencia se reduce en 100 veces o más. Estas
cepas atenuadas de Salmonella son vacunas orales efectivas para ratones, ovejas, ganado,
pollos y humanos. La eliminación del gen dam, que codifica la metilasa de ADN, puede ser
un enfoque altamente eficaz para producir cepas de Salmonella no virulentas. El gen dam
es un interruptor maestro que regula la expresión de 20 a 40 proteínas reguladoras
diferentes de Salmonella. Por lo tanto, cuando los ratones fueron inmunizados con Las
cepas de Salmonella con cepas negativas toleraron hasta 10,000 veces la dosis
normalmente letal. Generalmente, las bacterias patógenas activan muchos de sus genes lo
más brevemente posible para evitar la detección y el ataque del sistema inmune del
huésped. Sin embargo, con cepas Dam-negativas, estos genes se expresan durante
periodos mucho más largos, lo que facilita la detección del sistema inmunitario del
huésped y destruye las bacterias invasoras las bacterias colonizadoras intestinales tienen
genes de represas, si este enfoque con Salmonella resulta ser tan efectivo como se espera,
puede ser posible utilizar un protocolo similar con un rango de bacterias patógenas.
 Especies de Leishmania
Aunque el sistema inmune humano puede responder a las infecciones por parásitos
protozoarios del género Leishmania, ha sido difícil desarrollar una vacuna eficaz contra
estos organismos. Las cepas atenuadas de Leishmania a veces son efectivas como vacunas;
sin embargo, a menudo vuelven a la virulencia. Además, el parásito atenuado puede
persistir durante largos períodos en un individuo infectado pero aparentemente
asintomático. Dichos individuos pueden actuar como reservorios del parásito, que pueden
ser transferidos a otras personas por un huésped intermedio. Para superar estos
problemas, se creó una cepa atenuada de Leishmania que no puede revertir a la virulencia
mediante la eliminación dirigida de un gen metabólico esencial, tal como el que codifica
dihidrofolato reductasetimidilato sintasa. En una de estas cepas atenuadas, Leishmania
major E10-5A3, los dos genes de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa que están
presentes en las cepas de tipo salvaje fueron reemplazados por los genes que codifican
resistencia a las antibióticas G-418 e higromicina. Para la fertilidad, es necesario agregar
timidina al medio que se usa para propagar la cepa atenuada (pero no la de tipo salvaje).
Además, a diferencia del tipo salvaje, la cepa atenuada es incapaz de replicarse en los
macrófagos en el cultivo de tejidos sin que la mediamidia se adhiera al medio del
crecimiento (Fig. 12.21). Es importante destacar que la cepa atenuada sobrevive solo unos
pocos días cuando se inocula en ratones; en ese momento, no causa ninguna enfermedad.
Además, este período es suficiente para inducir una inmunidad sustancial contra
Leishmania en la administración de BALB / cmiceaftera del parásito de tipo silvestre (Fig.
12.22). Dado que el parásito atenuado no estableció una infección persistente o causa
enfermedad, incluso en las cepas más susceptibles de ratones probados, se considera que
es una vacuna endógena de gran caducidad. Después de los experimentos adicionales con
animales, debería ser posible probar si este parásito atenuado es eficaz como una vacuna
en humanos. Virus del herpes simple Al igual que otros organismos patógenos que se han
desarrollado como vacunas vivas, se han eliminado partes del genoma del VHS.
Inicialmente, fue pensó que se podría obtener una respuesta inmune fuerte solo si el virus
fuera capaz de replicarse. Sin embargo, varias vacunas basadas en virus no replicantes
inducen una respuesta inmune. Desarrollar un VHS avirulento es importante, ya que las
vacunas de subunidades hasta ahora no han tenido éxito en inducir inmunidad contra el
virus. Para preparar una vacuna VHS segura y eficaz en vivo, se generaron dos deleciones
en diferentes lugares del genoma viral de forma independiente y luego se combinaron
para formar un virus de doble deleción. Esta cepa no puede proliferar en las células
huésped, y la probabilidad de que ambos conjuntos de funciones puedan volver a
adquirirse simultáneamente es muy pequeña. Esta cepa de replicación defectuosa induce
inmunidad protectora que puede reducir la diseminación viral aguda y la infección latente.
Vacunas de vectores
Vacunas dirigidas contra virus
El virus de la vacuna, en forma de vacuna viva, ha llevado a la erradicación mundial de la
viruela. El virus Vaccinia es un miembro de la familia de poxvirus. Este virus
completamente secuenciado tiene un genoma de ADN bicatenario que contiene 187 pares
de kilobases (kb) y codifica aproximadamente 200 proteínas diferentes. El ADN del virus
vaccinia se replica dentro del citoplasma de las células infectadas. Es posible la replicación
y la transcripción citoplásmica, en lugar de la nuclear, porque el ADN del virus vaccinia
contiene genes para la ADN polimerasa, la ARN polimerasa y las enzimas para el ARN
mensajero capilar, metilado y poliadenilato (ARNm). Por lo tanto, si se inserta un gen
extraño en el genoma del virus vaccinia bajo el control de un promotor de virus vaccinia,
se expresará independientemente de las funciones enzimáticas y reguladoras del
hospedador. El virus puede infectar a humanos y muchos otros vertebrados, así como a
invertebrados. Además de tener un amplio rango de hospedantes, el virus vaccinia está
bien caracterizado a nivel molecular, es estable durante años después de la liofilización
(liofilización) y es usualmente un virus benigno. Por estas razones, es un candidato fuerte
como vacuna vectorial. La función de una vacuna vector es administrar y expresar genes
clonados que codifican antígenos que provocan anticuerpos neutralizantes contra agentes
patógenos. Desafortunadamente, el genoma del virus vaccinia es muy grande y carece de
sitios de restricción únicos. Por lo tanto, no es posible insertar ADN adicional directamente
en el genoma viral. Por necesidad, los genes para antígenos específicos se deben
introducir en el genoma viral mediante recombinación homóloga in vivo.
1.La codificación de secuencia de ADN de un antígeno específico, como HBCc, se inserta en
un vector plasmídico inmediatamente cadena abajo de un promotor de virus vaccinia
clonado y en el medio de un gen no esencial del virus vaccinia, tal como el gen de la
enzima timidina quinasa (figura 12.23A). 2. Este plásmido se usa para transfectar células
animales negativas a la timidina quinasa en cultivo, habitualmente fibroblastos de
embriones de pollo, que se han infectado previamente con virus vaccinia de tipo salvaje,
que produce una timidina cinasa funcional. 3. La recombinación entre las secuencias de
ADN que flanquean el promotor y el gen del antígeno neutralizante en el plásmido y las
secuencias homólogas en el genoma viral da como resultado la incorporación del gen
clonado en el ADNvvico (Fig. 12.23B). Aunque el evento de recombinación es raro, la
ausencia de timidina quinasa la actividad en las células huésped y la alteración del gen de
timidina quinasa en el virus recombinado hacen que las células hospedadoras sean
resistentes a los efectos tóxicos de la bromodesoxiuridina. Este esquema de selección
enriquece las líneas celulares que portan un virus vaccinia recombinante. 4. La selección
definitiva de células con un virus vaccinia recombinante se realiza mediante hibridación de
ADN con una sonda para el gen del antígeno.
Dado que los mutantes negativos a timidina quinasa del virus vaccinia surgen
espontáneamente a una frecuencia relativamente alta de aproximadamente 1 partícula de
virus en 103 a 104, un marcador seleccionable a menudo se transfiere conjuntamente con
el gen diana. Esto hace que sea mucho más fácil distinguir un mutante de timidina quinasa
espontáneo de un mutante deliberadamente generado por recombinación homóloga. En
otras palabras, un virus con una mutación espontánea no llevaría el marcador
seleccionable, mientras que un virus que se sometió a recombinación homóloga sí lo haría.
El gen neo, que codifica la enzima neomicina fosfotransferasa II y confiere resistencia al
análogo de kanamicina G-418, se usa a menudo como marcador seleccionable. Este gen, a
diferencia de otros marcadores seleccionables, es bastante estable una vez que se inserta
en el genoma del virus vaccinia. Para evitar la alteración de los genes del virus vaccinia o la
necesidad de cribado de marcadores seleccionables, se ha ideado un nuevo sistema en el
que cada virus recombinante que puede formar una placa contendrá y expresará el gen
diana. El virus vaccinia de tipo salvaje contiene un gen, vp37, que es responsable de la
formación de placas cuando el virus se cultiva en una célula animal (Fig. 12.24A).
Eliminación del gen vp37 y su sustitución por un E. colimarkergene (Fig. 12.24B) Crea un
mutante de vacunavirus que no forma placas después de 2 a 3 días de crecimiento en
cultivo celular. Los genes diana se introducen en el virus vaccinia mutante mediante
recombinación homóloga con un vector de transferencia que porta el gen vp37, así como
el gen objetivo (Fig. 12.24C). Combinación homóloga entre el mutante formador de placa y
el vector de transferencia, los virus que pueden formar placas. han adquirido el gen vp37.
Además, el gen diana se inserta en el genoma del virus vaccinia y el gen marcador
seleccionable se pierde. Dado que el gen vp37 se ha eliminado en el virus vaccinia
mutante, es imposible que esta mutación revierte al tipo salvaje. Por lo tanto, cada virus
que forma una placa lleva la construcción deseada. Este procedimiento es simple y
directo, es aplicable a la clonación y expresión de cualquier gen diana, no requiere ningún
gen marcador adicional, y no interrumpe ningún virus del virus vaccinia. Varios genes
antigénicos se insertaron con éxito en el genoma del virus vaccinia y posteriormente se
expresaron en células animales en cultivo.Estos antígenosincludenproteínavirus, proteína
antígeno superficial de la hepatitis B, proteínas superficiales del virus Sindbis, proteínas NP
y HA del virus de la gripe, proteínas N y G del virus de la estomatitis vesicular y HSV
glicoproteínas. Se ha demostrado que varios vehículos de virus vaccinia recombinantes
son vacunas efectivas. Por ejemplo, la vacuna recombinante es un virus que oxida el gen
HSV-1 gD (glicoproteína D) que previene las infecciones por herpes en ratones. Otro virus
vaccinia recombinante que expresa el gen del antígeno de superficie del virus de la rabia
pudo provocar anticuerpos neutralizantes en zorros, que son los principales portadores de
la rabia en Europa, y se ha utilizado en el campo durante algún tiempo, incluso en un área
de aproximadamente 10.000 km2 en Bélgica. La vacuna del virus recombinante de la
vacuna del virus vaccinia-rabia que se encuentra actualmente en el mercado (Raboral) es
una vacuna vírica viva que contiene 108 unidades formadoras de placas (UFP), partículas
vivas orales, perdosas. Se construye mediante la inserción de la copia del ADN que codifica
la glicoproteína G de una cepa del virus de la rabia el gen de timidina quinasa de una cepa
de virus vaccinia. Una vez que la vacuna es ingerida por un zorro, el virus vaccinia
comienza a replicarse y expresa la glicoproteína G de la rabia, que estimula el desarrollo
de respuestas inmunes a la glicoproteína de la rabia. Esto da como resultado la producción
de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la rabia en los zorros inmunizados. Esta
inmunidad típicamente dura aproximadamente 12 meses en cachorros y 18 meses en
animales adultos. El uso de vacunas vectorizadas construidas a partir del virus vaccinia
también ofrece la posibilidad de vacunar a las personas contra varias enfermedades
diferentes con un tratamiento. Esto se puede lograr usando un virus vaccinia
recombinante que porta genes clonados que codifican una cantidad de antígenos
diferentes. El momento de la producción de una proteína extraña cuyo gen se transporta
en un virus vaccinia depende de si un promotor del virus vaccinia funciona durante la fase
temprana o tardía del ciclo de infección, y la fuerza del promotor determina la cantidad de
nerviosa que se produce.Forthe Molecular Biotechnology, 4e en su mayoría, promotores
tardíos para una proteína de 11 kilodalton (kDa) (p11) y la proteína de inclusión del virus A
de viruela bovina ( pCAE) se han utilizado para alcanzar altos niveles de expresión de
genes extraños. Cuando los genes que codifican diferentes proteínas extrañas se insertan
en un virus vaccinia, cada uno se coloca bajo el control de un promotor de virus vaccinia
diferente para evitar la posibilidad de recombinación homóloga entre diferentes partes
del genoma del virus que podría causar la pérdida de los genes clonados. Una vacuna viral
recombinante viva tiene varias ventajas sobre la segunda prueba de Proof3rd matada. 1st
ProofFinal4rd Proof virusdesubunitvaccines. En primer lugar, el virus presenta el antígeno
auténtico de una manera que se parece mucho a una infección natural. En segundo lugar,
el virus se puede replicar dentro del huésped, amplificando así la cantidad de
antigenthatactiva de la liberación de anticuerpos de las células B (respuesta humoral) y
estimula la producción de células T (respuesta inmune mediada por células). Una
desventaja del uso de una vacuna vírica recombinante viva es que la vacunación de un
huésped inmunosuprimido, tal como un individuo con SIDA, puede conducir a una
infección viral grave. Una forma de evitar este problema puede ser inserte el gen que
codifica IL-2 en el vector viral. El IL-2 mejora la respuesta de las células T del sistema
inmunitario, lo que permite al receptor limitar la proliferación del vector viral y, por lo
tanto, disminuye la posibilidad de una infección no deseada. Si la proliferación de virus
vaccinia tiene efectos perjudiciales en ciertos pacientes, sería útil matarla o inhibirla
después de la vacunación. Un enfoque es crear un virus vaccinia sensible al interferón: el
virus vaccinia de tipo salvaje es relativamente resistente al interferón, cuya proliferación
se reduce. Tal vector de virus sería susceptible a la intervención del fármaco si surgieran
complicaciones de la vacunación con vectores del virus vaccinia. La base de la resistencia
del virus vaccinia al interferón no se conocía hasta entonces. Se encontró una vacuna de
10,5 kDa que codifica una proteína de 10,5 kDa que tiene una secuencia de aminoácidos
muy similar a la de una porción del factor de iniciación eucariota de la célula huésped de
36,1 kDa2 (eIF -2a). Las regiones N-terminales de ambas proteínas contienen 87
aminoácidos que son casi idénticos. Además, esta secuencia compartida contiene un
residuo de arsénico, aminoácido51, en el que IF-2a está fosforilado normalmente por la P1
quinasa activada por interferón. Cuando este residuo de serina en eIF-2a se fosforila en
células tratadas con interferón, se inhibe la síntesis de proteínas y, por lo tanto, la
replicación viral. Por lo tanto, el virus de vaccinia puede evitar
inhibitionbyinterferonbecausetheK3Lproteinactsasacompetitive inhibitorofeIF-
2aphosphorylation (Fig.12.25) .Por lo tanto, deletionofallor
negativemutantofvacciniaviruswasconstructed-
aportionoftheK3Lgenefromvacciniavirusshouldmakethevirussensitivetointerferon.AK3L
byPCRmutagenesisoftheK3Lgenecarriedonaplasmid, followedby
homologousrecombinationtoreplacethewild-typeK3Lsequencewiththe versión modificada.
Cuando se probaron las versiones de tipo salvaje y mutante del virus vaccinia para
detectar la sensibilidad al interferón, el mutante era de 10 a 15 veces más sensible a la
interferencia que la versión de tipo silvestre (Fig. 12.26). La reinserción de la secuencia K3L
de tipo salvaje en el virus mutante restableció el nivel de sensibilidad al interferón que se
encuentra en el tipo salvaje. Esto indica que
K3Lindeedinvolvedininterferonresistancephenotypeofvaccinia virus. Este trabajo es un
paso importante en el desarrollo de vectores de virus vaccinia más seguros. Además, otros
virus resistentes al interferón pueden contener secuencias comparables a K3L y, por lo
tanto, pueden ser útiles para la construcción de mutantes de deleción sensibles al
interferón. Se han desarrollado otros enfoques comparables para la creación de cepas
atenuadas del virus vaccinia. Por ejemplo, como una cepa de virus vaccinia, construida
para tener una mutación en el gen B8R, que codifica un receptor viroico, es menos
patógena para los ratones que la cepa viral parental. En la actualidad, se han autorizado
varias vacunas basadas en virus vaccinia veterinarios, y se están llevando a cabo estudios
clínicos para probar su eficacia en la prevención de varias enfermedades infecciosas
humanas. Esta tecnología se basa en parte en el desarrollo de una versión atenuada de la
cepa del virus vaccinia que se había utilizado previamente en la erradicación de la viruela.
Para evitar cualquier riesgo de que el vector se convirtiera en una fuente de enfermedad,
se eliminó parte de la información genética del genoma del virus de modo que el vector
viral estaba muy atenuado. Este virus atenuado se ha usado para expresar una serie de
antígenos virales con la expectativa de que el virus recombinante sería una vacuna viva
eficaz. Se ha logrado la protección clonando glucoproteínas del virus de la seudorrabia
porcina, glicoproteínas hemaglutininas del virus de la gripe equina, una proteína de
espícula del virus del SARS y una poliproteína del virus de la encefalitis porcina japonesa y
luego vacunacion humana para prevenir la transmisión de estos virus. Debido al éxito de
estas vacunas atenuadas de virus vaccinia, se ha propuesto que este virus se considere un
sistema de administración general para una amplia gama de proteínas. Para campañas de
vacunación masiva en países en desarrollo, sería ventajoso poder entregar vacunas vivas
de una manera simple, rápida y rentable. Además, con patógenos transmitidos por la
mucosa, como el VIH, las rutas de vacunación tradicionales pueden no inducir respuestas
inmunitarias de la mucosa suficientes para proporcionar inmunidad protectora. Una
posible alternativa a la vacunación tradicional es la inmunización en aerosol, que es
potencialmente más segura, más fácil y menos costosa de administrar. Con este fin, los
investigadores probaron las capacidades de dos vectores atenuados basados en el virus
vaccinia para ser entregados de manera efectiva mediante la inmunización en aerosol. De
hecho, se descubrió que la administración de aerosoles era tanto segura como efectiva,
produciendo respuestas inmunes sistémicas y mucosales duraderas cuando se
administraban a macacos rhesus (monos). Este enfoque aún debe ser probado con
humanos; sin embargo, podría ofrecer un medio eficaz de inocular a un gran número de
personas en el futuro. Aunque gran parte del trabajo sobre el desarrollo de vacunas virales
vivas se ha llevado a cabo con el virus vaccinia, otros virus, como adenovirus, poliovirus y
varicela-zoster, también se están probando como posibles vectores de vacuna. El
poliovirus latente puede suministrarse por vía secundaria y destruir ScEYEnce Studios g.
12.25 Glick / Pasternak: Biotechnology molecular, 4e Fi mucosal vaccine, que se dirige a
los receptores en los pulmones o el tracto gastrointestinal, también podría ser útil contra
una variedad de enfermedades, incluyendo cólera, fiebre tifoidea, influenza, neumonía,
mononucleosis y rabia. Sin embargo, la seguridad y eficacia de cualquier virus
aparentemente benigno como un sistema de entrega y expresión de genes debe estar
firmemente establecido antes de llevar a cabo los ensayos clínicos.
Vacunas dirigidas contra las bacterias
Desde el descubrimiento y posterior difusión generalizada de antibióticos, solo una
cantidad modesta de investigación se ha dirigido hacia el desarrollo de vacunas para
enfermedades bacterianas. Sin embargo, existen buenas razones para desarrollar vacunas
bacterianas: • No todas las bacterias y enfermedades son tratadas con antibióticos. • El
uso de antibióticos durante los últimos 40 años se ha producido en la proliferación de
cepas bacterianas que son resistentes a varios antibióticos. • Las instalaciones de
refrigeración fiables para el almacenamiento de antibióticos no están comúnmente
disponibles en muchos países tropicales. • Es muy difícil asegurar que las personas que
reciben antibioticoterapia reciban el curso completo del tratamiento. Dada la necesidad
de producir vacunas que sean eficaces contra las enfermedades bacterianas, la pregunta
es: ¿qué estrategias son las más efectivas? En los casos en que la bacteria que causa la
enfermedad no crece bien ScEYEnce Studios g. 12.26 Glick / Pasternak: Biotecnología
Molecular, 4e Fi 1st Proof, el desarrollo de una atlanta atenuada no es factible. En estas
bacterias, se deben utilizar enfoques alternativos. Por ejemplo, Rickettsia rickettsii, una
bacteria gramnegativa intracelular que causa la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas,
no crece en cultivo. En este caso, se usó una proteína de 155 kDa clonada que es un
antígeno de superficie principal de R. rickettsii como una vacuna de subunidad y se
encontró que protege a los ratones inmunizados contra la infección por esta bacteria que
causa la enfermedad. 2nd Proof3rd Proof4rd Prueba de Tuberculosis.
La tuberculosis, una de las enfermedades infecciosas más importantes en todo el mundo,
es causada por la bacteria M. tuberculosis. La bacteria puede formar lesiones en cualquier
tejido u órgano, lo que conduce a la muerte celular. Los pulmones son los más
comúnmente afectados. Los pacientes sufren fiebre y pérdida de peso corporal, y sin
tratamiento, la tuberculosis a menudo es fatal. Se estima que aproximadamente 2 billones
de personas están actualmente infectadas con el organismo y que aproximadamente 2 a 3
millones de muertes al año son el resultado de estas infecciones . En los últimos 50 años,
los antibióticos se han usado para tratar a pacientes infectados con M. tuberculosis. Sin
embargo, numerosas cepas resistentes a múltiples fármacos de M. tuberculosis son ahora
prevalentes. En los Estados Unidos, entre los pacientes con VIH infectados con una cepa
de M. tuberculosis resistente a los antibióticos, existe una tasa de mortalidad del 50%
dentro de los 60 días. En consecuencia, una enfermedad bacteriana que se pensaba que
estaba bajo control se ha convertido en un grave problema de salud pública en muchas
partes del mundo. Actualmente, en algunos países, BacillusCalmette-Guérin (BCG), una
cepa atenuada de Mycobacterium bovis que se desarrolló entre 1906 y 1919, se utiliza
como vacuna contra la tuberculosis. Sin embargo, el uso de esta vacuna tiene un
retroceso. En primer lugar, las células BCBC pueden desencadenar infecciones en
individuos inmunodeprimidos, como los pacientes con SIDA. En segundo lugar, el individuo
tratado con BCG responde positivamente a una prueba diagnóstica de comorbilidad
contra la tuberculosis, que hace que sea imposible distinguir entre individuos infectados
con M. tuberculosis y que se inocularon con células BCG. Por estas razones, la EBG no está
aprobada para el uso de un número de países, incluidos los Estados Unidos. En un intento
por determinar si podría desarrollarse una vacuna más segura y más efectiva contra la
tuberculosis, se examinó el grado de inmunoprotección provocado por las proteínas
extracelulares de M. tuberculosis purificadas. Tras el crecimiento de la bacteria en el
cultivo de líquido, se purificaron las proteínas más abundantes (Fig. 12.27). Cada una de
estas proteínas se usó por separado y luego en combinación para inmunizar cobayos. Los
animales inmunizados se expusieron después a un aerosol que contenía aproximadamente
200 células de M. tuberculosis vivo, una gran dosis para estos animales. Los animales se
observaron durante 9 a 10 semanas antes de examinar sus pulmones y bazos en busca de
organismos causantes de enfermedades. En estos experimentos, algunas de las
combinaciones de proteínas purificadas proporcionaron un nivel ligeramente más bajo de
protección contra la pérdida de peso, la muerte y la infección del pulmón y el espleno
humano y la vacuna viva BCG. Entre las proteínas que proporcionaron protección destacó
la proteína secretora principal de M. tuberculosis, una mycolytransferase de 30 kDa
también conocida como antígeno α, orantigen85B. Sin embargo, , la codificacion de
vacuna de DNA esta proteína fue incluso menos efectiva que la proteína secretada
purificada. Si bien esta y posiblemente otras proteínas secretadas por M. tuberculosis
podrían eventualmente ser parte de una vacuna segura y eficaz para la prevención de la
tuberculosis en humanos, es necesario desarrollar un sistema de administración adecuado
para ellas. En teoría, el sistema de administración óptimo para un antígeno que
proporciona protección contra la tuberculosis debería ser (1) capaz de multiplicarse en el
huésped mamífero, (2) no patógeno y (3) capaz de expresar y secretar el antígeno
protector. Todos estos requisitos se satisfacen con la BCGstrain disponible. Por lo tanto,
anE. El vector lanzadera de coli-micobacteria que contenía el gen para la proteína de 30
kDa (antígeno-a) bajo el control de su propio promotor se introdujo en diferentes cepas de
CBC (figura 12.28). Las células transformadas produjeron 2,0 a 5,4 veces más proteína de
30 kDa que las células no transformadas. Además, a pesar del hecho de que los genes
introducidos estaban codificados por plásmidos y, por lo tanto, eran potencialmente
inestables, las células transformadas continuaron expresando un alto nivel de proteína de
30 kDa después de la vacunación de un animal de prueba. De acuerdo con la hipótesis de
que las proteínas extracelulares de los organismos intracelulares son moléculas
inmunoprotectoras clave, la guinea infectada infectada con BCG tiene una cantidad
significativamente menor de bacilos en sus pulmones y bazos. Además, había lesiones más
pequeñas y menos en sus pulmones, bazos e hígados, y la supervivencia de los animales
aumentó significativamente, en comparación con los animales vacunados cuando se
transformaron en BCG (Fig. 12.29). Este es el primer informe de una vacuna contra la
tuberculosis que es más potente que la vacuna comercial actualmente disponible. Esta
vacuna se encuentra actualmente en ensayos clínicos; si tiene éxito, podría salvar decenas
de miles de vidas. Además, es posible preparar preparaciones de BCG en las que las
bacterias individuales forman estructuras tipo barra, de 1 a 4 μm de largo y de 0,2 a 0,4
μm de diámetro, que pueden servir como base para una vacuna bacteriana viva que se
administra como aerosol, facilitando así la inoculación de recién nacidos. Bacterias como
sistemas de administración de antígenos Los antígenos que se encuentran en la superficie
externa de una célula bacteriana tienen más probabilidades de ser inmunogénicos que los
que están en el citoplasma. Por lo tanto, una estrategia es colocar un antígeno
neutralizante de una bacteria patógena en la superficie de la bacteria no patogénica. Las
colas se preparan a partir de una sola proteína llamada flagelina. Bajo un microscopio,
aparecen como estructuras filiformes conspicuas en las superficies externas de algunas
bacterias. Si se pudiera hacer que los flagelos de un organismo no patógeno transporten
un epítopo específico de una bacteria patógena, se podría lograr fácilmente la
inmunogenicidad protectora. Esta estrategia se usó para investigar la vacuna cólera
(Fig.12.30). Se insertaron oligonucleótidos asintéticos que especifican un péptido de la
toxinatoxina B en una porción del gen de Salmonella flagelina que varía
considerablemente de una cepa a otra (segmento hipervariable). La construcción se
introdujo luego en una cepa de Salmonella negativa para flagelo. El epítopo, que consistía
en los restos aminoacídicos 50 a 64 de la toxina del cólera Bsubunit, se mostró
previamente a anticuerpos anticonceptivos contra la intolerancia a la cóleratoxina.
Elfluoquímico funcionaba anormalmente.Además, el epítopo estaba presente en la
superficie del flagelo. La inmunización de ratones mediante inyecciones intraperitoneales
de aproximadamente 5x106 bacterias muertas genéticamente modificadas o destruidas
con formalina provocó altos niveles de anticuerpos dirigidos contra el péptido, es decir, los
aminoácidos 50 a 64, y la molécula de toxina del cólera intacta. Pueden insertarse dos o
tres epítopos diferentes en un solo gen de flagelina de Salmonella, creando así una vacuna
bacteriana multivalente. Las cepas de Salmonella atenuadas pueden administrarse por vía
oral, lo que les permitiría administrar una gama de antígenos bacterianos, virales y
parasitarios al sistema inmunológico de la mucosa. Por este motivo, es importante la
elección del promotor que impulsa la transcripción del antígeno extraño. Si se usa un
promotor demasiado fuerte, la carga metabólica podría limitar la proliferación bacteriana.
Además, a diferencia de un sistema cerrado, tal como un recipiente de fermentación, el
cambio de temperatura o la adición de metabolitos específicos para inducir la expresión
del gen extraño no es posible cuando el vector bacteriano se agrega a un animal huésped.
Por otro lado, los promotores que responden a las señales ambientales pueden
proporcionar medios efectivos para controlar la expresión del gen del genigno anterior.
Por ejemplo, el E. promotor coli nirB, que es regulado tanto por el nitrito como por la
tensión de oxígeno del ambiente, se vuelve activo en condiciones anaeróbicas. En una
serie de experimentos, el promotor nirB se usó para dirigir la expresión del fragmento C
inmunogénico no tóxico de la toxina de C. tetani (toxina tetánica) en una cepa atenuada
de Salmonella. Se estima que más de 1 millón de muertes por año en el mundo en
desarrollo son el resultado de infecciones por C. tetani. Cuando la cepa modificada de
Salmonella se cultivó aeróbicamente en cultivo, el fragmento C de toxina tetánica no se
sintetizó; sin embargo, después de la administración oral de la bacteria para analizar
ratones, se produjo el fragmento C, y los animales generaron anticuerpos contra el
péptido. Por lo tanto, la cepa de Salmonella diseñada tiene potencial como vacuna
antitetánica oral en vivo. La bacteria gramnegativa Helicobacter pylori, en forma de
espiral, gastrointestinal y microaerófila, se distribuye ampliamente entre las poblaciones
humanas. Se cree que es el agente causal de una serie de enfermedades
gastrointestinales, que incluyen gastritis crónica, úlceras pépticas, linfoma gástrico y
cáncer gástrico. Entre las personas infectadas, que incluye a más de la mitad de la
población mundial, alrededor del 10% tienen riesgo de desarrollar úlceras pépticas. En los
últimos años, el tratamiento médico para las úlceras pépticas ha cambiado de antiácidos a
antibióticos e inhibidores de la bomba de protones. Los antibióticos erradican la infección
por H. pylori, mientras que los inhibidores de la bomba de protones bloquean la enzima
ATPasa hidrógeno-potasio, impidiendo la producción de ácido de las células parietales en
la mucosa gástrica, lo que facilita la curación de la mucosa. Desafortunadamente, H. pylori
es resistente a varios antibióticos de uso común, incluidos metronidazol, amoxicilina,
eritromicina y claritromicina. El tratamiento de H. pylori requiere regímenes
multimedicamentos porque el organismo reside en una capa de moco que actúa como
barrera para la penetración de antibióticos. Además, el curso necesario de tratamiento
con antibióticos es demasiado costoso para las poblaciones de los países menos
desarrollados. La colonización del tracto gastrointestinal por H. pylori se ve facilitada por
la acción de una ureasa codificada por H. pylori. Esta enzima hidroliza la urea al dióxido de
carbono y al amoníaco, neutralizando así el ácido del estómago, permitiendo que la
bacteria sobreviva, se una y funcione en el huésped. La ureasa es una metaloenzima de
níquel expuesta a la superficie y citosólica y es una de las proteínas expresadas más
abundantemente en H. pylori. La enzima comprende dos subunidades, A y B, que se
ensamblan en una estructura supramolecular compleja [(αβ) 3] 4. La subunidad B es más
antigénica, por lo que es posible candidato de vacuna. Para desarrollar una vacuna que
proteja a las personas contra las infecciones por H. pylori, los genes que codifican las
subunidades A y B de H. pylori se expresaron constitutivamente bajo el control de un
promotor de Salmonella en una cepa genéticamente delecionada de S. enterica serovar
Typhi (Fig. 12.31). Ni la inmunización con S. enterica serovar Typhi que expresa ureasa sola
ni la inmunización con la enzima ureasa purificada más un adyuvante confieren protección
contra la estimulación con una cepa de H. pylori adaptada a ratón. Por otro lado, un
protocolo de vacunación que combinaba tanto S. enterica serovar Typhi y ureasa que
expresaban ureasa más un adyuvante era protector. Si bien el éxito de este enfoque aún
no se ha establecido en los seres humanos, estos resultados iniciales son alentadores y
dan esperanzas de que se desarrolle una vacuna humana contra H. pylori en el futuro
cercano.

Resumen
Tradicionalmente, las vacunas han sido agentes infecciosos inactivados o atenuados
(bacterias o virus) que se inyectan en un organismo productor de anticuerpos para
producir inmunidad. Hay una serie de inconvenientes para estas vacunas. Por ejemplo, no
todos los organismos patógenos pueden crecer hasta los grandes volúmenes necesarios
para fabricar una vacuna, existen problemas de seguridad cuando se manipulan grandes
volúmenes de organismos patógenos, las cepas atenuadas pueden volver al estado
infeccioso, la inactivación puede ser incompleta y el estante la vida es a menudo depende
de la refrigeración.
La tecnología de ADN recombinante se ha utilizado de diversas maneras para crear
vacunas confiables. Los agentes no infecciosos inmunológicamente activos se producen
mediante la eliminación de los genes que causan la virulencia; con esta eliminación, una
vacuna viva nunca podría volver a la forma infecciosa. Un gen (es) que codifica el (los)
determinante (s) antigénico (s) principal (es) de un organismo patógeno se pueden clonar
en el genoma de un organismo portador benigno (generalmente un virus o bacteria), que
se puede usar como vacuna sin preocuparse de la presencia de organismos patógenos. Los
genes o segmentos de genes que codifican los principales determinantes antigénicos de
organismos patógenos se pueden clonar en vectores de expresión, y se pueden cosechar,
purificar y usar grandes cantidades del producto como vacuna. Con la última estrategia,
los genes completos producen vacunas de subunidades, y los dominios clonados de los
principales determinantes antigénicos producen vacunas peptídicas. Las vacunas
peptídicas también pueden producirse por síntesis química de péptidos. Como alternativa
al uso de proteínas o péptidos antigénicos clonados para la inoculación, pueden utilizarse
constructos de ADN que codifican la proteína o péptido antigénico. Estas construcciones
de ADN pueden entregarse directamente a animales o humanos.