METABOLISMO PRIMARIO DE NITRÓGENO
7.10. Aminoácidos de azufre
7.10.1 Cisteína
El sulfato se reduce a sulfuro en una serie de
reacciones que involucran ATP y ferredoxina
reducida en el cloroplasto (Anderson, 1990),
cuyos detalles completos están más allá del
alcance de este capítulo. La cisteína sintasa [O-
acetilserina (tiol) liasa] cataliza la reacción
explosiva:
O-acetilserina + S2- → cisteína * acetato
La enzima también es responsable de la síntesis
de varias alaninas heterocíclicas / 3-sustituidas,
algunas de las cuales son productos secundarios
importantes de la planta (Ikegami 1990, 1993).
Se han encontrado múltiples formas de cisteína
sintasa en Phaseolus (Bertagnolli y Wedding,
1977), hojas (Nakamura y Tamura, 1989) y hojas
de espinaca (Lunn 1990). En un estudio detallado
de protoplastos de yemas de coliflor, Rolland
(1992) demostró la presencia de cuatro formas
mediante cromatografía de intercambio iónico.
Dos isoenzimas se localizaron en proplastos
purificados, uno en la mitocondria y otro en el
citoplasma. La cisteína sintasa del cloroplasto se
ha purificado hasta la homogeneidad a partir de
la espinaca. La enzima consiste en dos
subunidades idénticas de peso molecular de 35
kDa que contienen una molécula de fosfato de
piridoxal por subunidad. En la cromatografía de
filtración en gel, parte de la actividad de la
enzima eluyó en asociación con la actividad de la
serina acetiltransferasa en una posición
correspondiente a un peso molecular de 310 kDa
(Droux 1992). Los antisueros producidos contra
la enzima cloroplasto mostraron una reactividad
cruzada muy baja con las enzimas
citoplasmáticas y mitocondriales. Se ha aislado
un clon de ADNc que codifica la forma
citoplásmica de cisteína sintasa a partir de
espinaca con un peso molecular de 34 kDa (Saito
1992). Una comparación de la secuencia de
aminoácidos indicó una identidad del 53% con la
enzima. El ADNc no contenía secuencia de
tránsito aparente y se detectó la expresión
constitutiva de ARNm en raíces y hojas. Un clon
de cDNA que codifica la secuencia completa de
la enzima cloroplasto ha sido aislado por Rolland
(1993). El polipéptido de 35 kDa también
contenía un péptido de tránsito de 52
aminoácidos. Se demostró una buena homología
de secuencia primaria (50%) entre la cisteína
sintasa del cloroplasto de espinaca y la isoenzima
305
A del análisis de transferencia Southern indicó
que la enzima del cloroplasto está codificada por
múltiples genes en la espinaca. El gen que
codifica la cisteína sintasa del cloroplasto
también ha sido aislado de la espinaca por Saito
(1993). El análisis de transferencia Northern
indicó que el ARNm se expresó a un nivel más
alto en las hojas que en las raíces. Se ha
demostrado que un clon de cDNA que codifica la
cisteína sintasa de los cromoplastos está regulado
por incremento durante el desarrollo del fruto
(Romer 1992).
7.10.2 glutationa
El tripéptido glutatión: glutamato: se considera
que la cisteína glicina es el principal compuesto
de almacenamiento y transporte que contiene
azufre reducido (Rennenberg, 1982; Rennenberg
y Lamoureux, 1990; Schupp 1992). El glutatión
puede existir en la forma reducida de GSH o en
el estado oxidado como un dímero GSSG, donde
dos moléculas están unidas por un enlace
disulfuro. También se ha propuesto que el
tripéptido puede jugar un papel clave en la
defensa de las plantas frente a diversas tensiones
ambientales, p. frío, calor, sequía, lucha de altura,
ataque de hongos y herbicidas (Smith 1989;
Alscher, 1989). Las fitoquelatinas son polímeros
de 7-glutamilcisteína, que se ha demostrado que
están implicados en la quelación de ciertos
metales tóxicos (Rauser, 1990; Steffens, 1990).
(a) síntesis
La 7-glutamilcisteína sintetasa cataliza el primer
paso dependiente de ATP implicado en la síntesis
de glutatión. La enzima se ha purificado
parcialmente a partir de cultivos en suspensión
celular de nicotina tabacum mediante la
determinación de 7-glutamilcisteína como el
derivado de monobromobimano (Hell &
Bergmann, 1990). Butionina sulfoximina y
metionina sulfoximina fueron inhibidores de la
enzima como se había informado anteriormente
para 7-glutamilcisteína sintasa de tejidos de
mamíferos (Orlowski y Meister, 1971). La
enzima fue completamente inhibida por el
glutatión (Xi = 0.42mM). Los datos indicaron
que la tasa de síntesis de glutatión in vivo puede
estar sustancialmente influenciada por la
concentración de cisteína y glutamato y puede
ser una retroalimentación adicional regulada por
el producto final glutatión (Hell & Bergmann,
1990). La segunda enzima en la vía, la
glutathionine sintetasa, cataliza el dependiente de
ATP
306 PETER J. LEA
unión de glicina al grupo C-terminal de 7-
glutamilcisteína. Se ha detectado actividad
enzimática en preparaciones relativamente
crudas en hojas de espinaca (Law y Halliwell,
1986), plántulas de leguminosas (Macnicol,
1987) y cultivos en suspensión de tabaco (Hell
Bergmann, 1988). La glutatión sintetasa en
guisantes y tabaco también puede usar 7-
glutamil-aaminobutirato como sustrato. En las
plantas que contienen homoglutatión, la enzima
muestra una mayor afinidad por la / 3-alanina que
la glicina (Klapheck 1988).
(b) localización subcelular
El glutatión está presente en los cloroplastos de
las hojas a altas concentraciones (1-6 mM)
aunque también puede estar presente en el
citoplasma (Foyer y Halliwell, 1976, Smith 1985,
Bielawski y Joy, 1986, Klapheck 1987). En las
hojas de guisante, el 72% de la 7-glutamil
cisteína sintetasa y el 47% de glutatión sintetasa
se localizaron en los cloroplastos. En las hojas de
espinaca, la distribución en el cloroplasto fue del
61% y del 58%, respectivamente (Hell &
Bergmann, 1990). Los datos en hojas sugirieron
que hay dos sitios principales de síntesis de
glutatión. Sin embargo, en raíces de maíz, casi el
50% de la actividad de 7-glutamilcisteína
sintetasa se detectó en los plástidos de la raíz de
plántulas de 4 días, mientras que menos del 10%
de la glutatión sintetasa se determinó en el
orgánulo (Ruegsegger y Brunold, 1993).
7.11 histidina
La histidina ha sido descrita como la 'Cenicienta'
de los aminoácidos de las plantas (Miflin, 1980)
con poco trabajo llevado a cabo en la ruta de
síntesis en las plantas, aunque la vía se ha
establecido en bacterias (Bryan, 1990). Se han
aislado líneas celulares mutantes que requieren
histidina para el crecimiento, con deficiencias
enzimáticas propuestas en imidazol glicerol
fosfato deshidratasa o histidinol fosfato
aminotransferasa (Gebhardt 1983; Shimamoto y
King, 1983; Negrutiu 1985). La enzima final en
la ruta, la histidinol deshidrogenasa, cataliza una
reacción de deshidrogenasa de cuatro electrones:
Histidinol + NAD + → Histidinal + NADH
Histidinal + NAD + → Histidina + NADH
La enzima se detectó inicialmente en 10 especies
de plantas diferentes, incluidos los espárragos, la
col y el germen de trigo (Wong y Mazehs, 1981).
Recientemente, la histidinol deshidrogenasa se
ha purificado hasta homogeneidad a partir del
repollo, un procedimiento que comenzó con 10
kg de material foliar (Nagai y Scheidegger,
1991). La enzima es un dímero con un peso
molecular de subunidad de 52 kDa. Al menos
cinco formas diferentes de la enzima podrían
separarse por enfoque isoeléctrico. Se ha aislado
un ADNc de longitud completa que codifica
histidinol deshidrogenasa de repollo y se muestra
que contiene un péptido de tránsito de
cloroplastos putativo de 31 aminoácidos. La
secuencia de proteína predicha era 51% idéntica
a la enzima de levadura y 49% idéntica a la
enzima (Nagai 1991). El ADNc que codifica la
enzima se expresó en 519 células usando el
sistema de vector de expresión de baculovirus, y
se llevó a cabo un procedimiento simple de
purificación en una etapa para obtener grandes
cantidades de enzima pura (Nagai 1992).
EXPRESIONES DE GRATITUD
El trabajo sobre el metabolismo del nitrógeno en
las plantas ha sido financiado por el AFRC y
SERC en los últimos 7 años. Estoy
extremadamente agradecido con Annie
Brotheridge por su incansable ayuda y apoyo al
escribir este manuscrito.
REFERENCIAS
Aarnes, H. (1976) 7, 187-194.
Aarnes, H. (1978) 40, 185-192.
Aarnes, H. (1980) 19, 81-89.
Aarnes, H. (1981) Z. 102, 81-89.
Aarnes, H. y Rognes, S.E. (1974) 13, 2717 -
2724.
Adams, D.G. (1992) en y (S. Mohan, C. Dow y
J.A. Cole, eds), págs. 341-384. Cambridge
University Press, Cambridge.
Alscher, R.G. (1989) 77, Anderson, H.W. (1990)
en (B. J. Miflin y P. J. Lea, eds), vol. 16, pp. 327-
381. Academic Press, San Diego.
Anderson, M.P., Vance, C.P., Heichel, G.H. &
Miller, S.S. (1989) 90, 351 - 358.
Anderson, P.C. & Georgeson, M. (1989) 31, 994
- 999.
Andrews, M. (1986) 9, 511 - 519.
Argandona, V. y Pahlich, E. (1991) 30, 1093 -
1094.
Arruda, P., Bright, S.W.J., Kueh, J.S.H., Lea, P.J.
& Rognes, S.E. (1984) 76, 442 - 446.
Askerlund, P., Laurent, P., Nakagawa, H. y
Kadar, J-C. (1991) 95, 6-13.
Aslam, M., Travis, R.L. y Huffaker, R.C. (1992)
99, 1124 - 1133.