INGENIERÍA GENÉTICA 5/06/18 – 12/06/18

AMPLIFICACIÓN DE LOS GENES DE LAS LISOZIMAS DE

LOS FAGOS ITL-1 Y RSP

1. TÍTULO
Ensayo para amplificar lo genes de las lisozimas de los fagos ITL-1 y RSP, utilizando oligonucleótidos que poseen
sitios de restricción en sus extremos 5’.

2. OBJETIVO
Amplificar los genes de las lisozimas de los fagos ITL-1 y RSP, para su posterior clonación.

3. ANTECEDENTES
Los bacteriófagos poseen enzimas que les permiten lisar a su hospedero bacteriano una vez que ha
culminado su ciclo de replicación y se han formado los viriones dentro de la célula. Proteínas denominadas

holinas forman poros en la membrana plasmática de la bacteria, por lo cuales se liberan enzimas líticas de
tipo lisozima, que degradan la pared de peptidoglicano. Los bacteriófagos ITL-1 y RSP infectan al
fitopatógeno Ralstonia solanacearum. En su genoma se han identificado genes que poseen dominios de

lisozima, los cuales se buscará clonar, para su eventual expresión y evaluación de su actividad lítica. Se
han diseñado los oligonucleótidos LzR-f/LzR-r y LzI-f/LzI-r, que amplifican estos genes. Los oligonucleótidos
se encuentran flanqueando a los genes correspondientes, como se muestra en las figuras 1 y 2.
Adicionalmente, se utilizará el par de oligonucleótidos fi-F/fi-R como control de amplificación, el cual no
posee sitios de restricción y genera un amplicón de 613 pb.
La Tm teórica de estos oligonucleótidos es de 59-60 °C, se correrán reacciones a 60 °C, la cual
previamente se ha identificado como la mejor Tm.

Los oligonucleótidos que se utilizan para clonar fragmentos de PCR, generalmente tienen sitios de
restricción palindrómicos, algunos de ellos ricos en GC, lo que favorece interacciones homodiméricas de

importancia práctica y reducen la eficiencia de la reacción. Existen reactivos como el dimetilsulfóxido

(DMSO), que pueden favorecer la unión de los oligonucleótidos a su sitio blanco. Este reactivo se utilizará
en la reacción de PCR.

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Figura 1. Localización de los oligonucleótidos a utilizar para la amplificación del gen de la lisozima del fago ITL-1.

Figura 2. Localización de los oligonucleótidos a utilizar para la amplificación del gen de la lisozima del fago RSP.

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3.1 Materiales
 Puntas para micropipeta de 200 µL nuevas y estériles
 Puntas para micropipeta de 10 µL nuevas y estériles
 Microtubos de 1.5 mL limpios y estériles
 Microtubos d 0.6 mL limpios y estériles
 Microtubos nuevos de 200 µL
 1 portaobjetos

3.2 Equipo
Termociclador
 GeneAmp®
 PCR Biosystem 9700
 B- Applied Biosystem
Micropipeta de 200 Ul
 Pipet lite RAININ
 KO341430K
Micropipeta de 10 uL
 Pipet lite Rainin
 0961758k
Centrífuga
 Benchman
 My fuge™ min
 BAC110020000010
 AB-02-B6-DOCENNIA
Cámara de electroforesis de 40 muestras
3.3 Reactivos
 PCR Master Mix 2X Thermo Fisher Scientific para PCR punto final.
 Solución de DNA genómico de Fago RSP, 45 ng/uL.
 Solución de DNA genómico de Fago ITL-1, 30 ng/uL.
 Marcador de peso molecular para DNA (SM1363 ladder 2)
 Buffer de carga para DNA 6X
 TAE 50X
 Agarosa
Oligonucleótidos:
Oligo Secuencia Amplicón Tm (°C)
fi-R AAACCCGTTTGTGAGCTGGC 59
613 pb
fi-F GCTGGTTGCTCGGATCTTGATAG 59

LzR-f aagtctGCGGCCGCCGGCCATGAGCGTCACGC 63
559+14+12=585 pb
LzR-r agtagaAGATCTGCCAATGATGGCGATAGCGTTG 60

LzI-f cagtcaTCTAGACCTGACGCATGGCTGAGGGAAC 573+12+12=597 pb 64

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LzI-r agctgaATCGATGGTTTCTCTGAATGCGGCACTACTTG 62

3.4 Protocolo

PREPARACIÓN DE LOS TUBOS DE PCR.

En los microtubos de 1.5mL se adicionaron los siguientes oligonucleótidos (tres oligonucleótidos y un control
negativo) con DMSO al 2%. Considerando que somos el equipo número tres, las etiquetas correspondientes son
señaladas en la tabla No. 1

De esta manera, por grupo se tendrán 24 tubos, de acuerdo a lo señalado en la tabla 1.

Tabla 1. Identificador de cada tubo utilizado en la reacción de PCR.

ID del tubo Oligonucleótidos Equipo
1A fi
1B LzR
1
1C LzI
1D Control neg
2A fi
2B LzR 2
2C LzI
2D Control neg
3A fi
3B LzR
3
3C LzI
3D Control neg
4A fi
4B LzR
4
4C LzI
4D Control neg
5A fi
5B LzR
5
5C LzI
5D Control neg
6A fi
6B LzR
6
6C LzI
6D Control neg

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PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR.

Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN, se utiliza este aparato, donde
nos permite realizar los ciclos necesarios para su amplificación, considerando que La Tm teórica de estos
oligonucleótidos es de 59-60 °C. El programa de PCR utilizado se indica en la tabla 2. Con este programa se
carga en el termociclador, PERO NO SE INICIA, debido a que se necesita su estabilización antes de iniciarlo.

Tabla 2. Programa para la reacción de PCR punto final a utilizar en este protocolo.
Ciclos Segmento Temperatura Tiempo de incubación
Pre incubación 1 95°C 1 min
Desnaturalización 95°C 10 s
Amplificación 35 Alineamiento 60°C 15 s
Extensión 72°C 30s
Extensión final 1 72°C 5 min

ADICIÓN DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS A LOS TUBOS DE PCR.

Se tomó 1 uL de cada muestra de oligonucleótidos y se añadió a los tubos correspondientes. Los
oligonucleótidos fueron adicionados debidamente en los tubos correspondientes por la alumna Beelia, utilizando
la micropipeta SL 10. Siguiendo el orden indicado de la siguiente tabla:

Letra en la Oligonucleótidos
etiqueta del tubo [10 uM]
A fi
B LzR
C LzI
D --- (ninguno)

Al colocar cada uno de los oligonucleótidos, los demás tubos deben estar cerrados, para evitar contaminación
cruzada.
ADICIÓN DE DNA MOLDE A LOS TUBOS DE PCR.
Se utilizó como DNA molde, DNA genómico de los fagos RSP e ITL-1. La alumna Aranza adicionó a cada tubo
de PCR 1 uL del DNA molde (utilizando la micropipeta SL 10) de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla,
el control negativo recibió 1 uL de cada uno:

Letra en la etiqueta del tubo DNA genómico

A RSP
B RSP
C ITL-1
D ITL-1, RSP
Al colocar cada uno de los oligonucleótidos, los demás tubos estaban cerrados para evitar la contaminación
cruzada.

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PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN

En un recipiente pequeño de vidrio Pyrex, se llenó de hielo a la mitad para mantener frías las muestras, y para
eliminar el agua ocasionada por el derretimiento se utilizó una jeringa de 5ml.
Los reactivos se extrajeron del congelador y se colocan en hielo. El Kit de PCR utilizado es el PCR Master Mix 2X
de la marca ThermoFisher Scientific con No. de catálogo K0171, el cual SIEMPRE se mantuvo en hielo.

Para realizar la mezcla de reacción que llevará DMSO al 2% y que se adicionará a los tubos con el número 1 al
final de la clave, se etiqueta un tubo como “2%” y se utilizan los datos mostrados en la siguiente tabla:

Concentración Concentración de Volumen para una Volumen para 4.3

Reactivo
del stock trabajo reacción de 25 uL reacciones

PCR master Mix 2x 1x 12.5 µL 53.8 µL

DMSO 100% 2% 0.5 µL 2.20 µL
Agua PCR -- -- 10.0 µL 43.0 µL
Vol. Final --- --- 23.0 µL 99 µL

Preparada la mezcla de reacción:

1. Se inicia el programa en el termociclador, y se pausa una vez que esté por iniciar la primera etapa.
2. Se colocan 23 uL de la mezcla de reacción en los tubos de PCR.
3. Se colocan los tubos en la parte central de la placa del termociclador
4. Se quita la pausa a los termocicladores y se corre la reacción.

Electroforesis de ácidos nucleicos.

Preparación del gel.
1. Se pesó la cantidad de agarosa necesaria para preparar un gel al 1%, la cual fue de 0.35 gr.
3. Colocamos la agarosa en el matraz Erlenmeyer y se adicionó 35ml de TAE 0.5x.
4. La mezcla se fundió en el horno de microondas por 2 minutos.
5. Verificamos que no quedaran restos de agarosa sin fundir (viendo a contraluz el contenido del matraz).
6. Se enfrió el contenido sumergiendo las paredes del matraz en agua de grifo, con agitación constante y
cuidando que no entre agua al matraz, hasta que el dorso de la mano soporte la temperatura del líquido.
7. Los peines fueron colocados y se vertió la agarosa en el molde del gel.
8. Solidificó por 20 minutos.

Cargado de las muestras:

1. En un portaobjetos se colocaron cuatro gotas de buffer de caga 6X, cada una de 3 uL.
2. De cada uno de sus tubos de PCR, tomamos 3 uL y la mezclamos con las gotas de buffer de carga.
3. Finalmente las muestras fueron cargadas en gel dentro de la cámara de electroforesis, el orden en el que
corrieron las muestras se indica en la siguiente tabla:
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Parte superior del gel Parte inferior del gel

Carril Muestra Carril Muestra
1 1A 18 5A
2 1B 19 5B
3 1C 20 5C
4 1D 21 5D
5 2A 22 MPM, 3 uL
6 2B 23 6A
7 2C 24 6B
8 2D 25 6C
9 MPM, 3 uL 26 6D
10 3A
11 3B
12 3C
13 3D
14 4A
15 4B
16 4C
17 4D
4. Se esperó hasta que el primer colorante llegue final del gel con un voltaje de 90.
5. El gel fue retirado de la cámara y se tiñó sumergiéndolo en una solución de bromuro de etidio por 5 minutos.
6. Finalmente se observó en el fotodocumentador.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Mediante la técnica desarrollada y como se logra visualizar en el gel de electroforesis revelado, se observan
bandas de DNA en los carriles: 3A (control positivo), 3B y 3C de los fagos RSP e ITL-1, siendo el pocillo 3D (control
negativo) el único que no mostró bandas. Tal información es mostrada a continuación:

1A , 1B, 1C, 1D, MPM

Se observó que en los pocillos 1A y 1B hubo bandas

con el peso molecular esperado de 850pb pero con
barrimiento por amplicones incompletos, mientras
que en el pocillo 1C no se dio la correcta amplificación
ya que la banda muestra un peso molecular más bajo.

Mientras que en las siguientes muestras no se observa

amplificación en el carril 2ª posiblemente por la
pérdida de la muestra y además en los carriles 2B, 2C
la amplificación tampoco fue la esperada ya que
muestra un tamaño mucho menor de
aproximadamente 300 pb.

2A, 2B, 2C, 2D, MPM

3A, 3B, 3C, 3D,MPM, 6A, 6B, 6C

Se observó que los pocillos 3A, 3B, 3C dieron como
resultado una amplificación correcta ya que las
bandas corresponden al peso molecular esperado
de 850pb, mientras que en el pocillo 3D se
encuentra el control negativo donde no hubo
ninguna banda lo cual también es correcto. Además
de que hubo algunos barridos debidos a amplicones
incompletos.

En cambio en los pocillos 6A no se muestra ninguna

banda probablemente porque se perdió la muestra,
y por último 6B, 6C la bandas son muy tenues y de
un bajo peso molecular.

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4A, 4B, 4C, 4D, MPM, 6D

Se observó que en los pocillos 4A y 4C hubo bandas con

el peso molecular esperado de 850pb pero con
barrimiento por posibles amplicones incompletos,
mientras que en el pocillo 4B no se dio la correcta
amplificación ya que la banda muestra un peso molecular
más bajo.

Y por último en el carril 6D que no muestra ninguna

banda es correcto ya que se trata del control negativo.

La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5% a 2%. En este caso se
utilizó al 1% para observar bandas de 250pb a 12kb.

Al iniciar la migración de las muestras,

se pudo observar que a medida que iba
avanzando la visualización de los
colorantes (azul de bromofenol y azul
de xileno) contenidos en el buffer de
carga con el que se mezcló la muestra
previa a su colocación en el pocillo.

Dentro del rango de 0.5 y 1.5%, el azul

de xileno migra de manera similar a un
fragmento de DNA de 4 kb, mientras
que el azul de bromofenol se comporta
como un fragmento de 300 pb.

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DISCUSIONES

Es de mucha importancia el correcto manejo de la técnica de PCR para amplificación de genes de interés, dentro
del desarrollo de nuestra práctica, los resultados muestran como un buen manejo de la técnica por parte de
nuestro equipo nos genera los resultados esperados. La concentración para llevar acabo la técnica es un factor de
suma importancia, pues, existen demasiados factores que pueden contaminar o bien truncar la amplificación del
gen de interés; lo que probablemente pasó con los demás equipos.

Por otro lado, consideramos que para nuestros resultados obtenidos se pueden mejorar aún más la visualización de
las bandas, pues es notorio como cada banda tiene un pequeño punto en el centro que nos indica que el gel fue un
poco picado al momento de cargar las muestras, sin embargo, por la gran concentración que teníamos de DNA
amplificado, no influyó en que el restante que se encontraba en el pocillo correspondiente, corriera de manera
correcta sin notarse un barrido de la banda.

En cuanto a la elaboración del gel de agarosa se debe tener sumo cuidado ya que no sólo se pueden presentar errores
por el incorrecto uso de los insumos en cuanto a la adición de los reactivos, etc; si no que también se pueden
presentar distintas complicaciones ocasionadas por el inadecuado uso de la cubeta de electroforesis, peine, etc. Ya
que debido al incorrecto sellado de la cubeta con el masking se provocó el derrame de gel lo cual nos causó pérdida
de tiempo al tener que volver a preparar el gel y desperdicio de reactivos, posteriormente se volvió a elaborar el gel
pero en este caso se colocó un peine que no era del tamaño adecuado para la cubeta de electroforesis, esto provoco
que el peine se ladeara y los pocillos del gel quedaran en un ángulo en el que algunos no iban a ser de utilidad para
aplicarles la muestra a correr, por lo cual se tuvo que elaborar por tercera y última vez el gel, teniendo precaución en
todos estos aspectos para evitar más pérdida de tiempo y reactivos.

CONCLUSIONES:

Se amplificaron los genes de las lisozimas de los fagos ITL-1 y RSP (utilizando oligonucleótidos que poseen sitios
de restricción en sus extremos 5’) con éxito ya que no se presentó contaminación en ninguna de las muestras
de PCR y el tamaño de las bandas corresponde al valor teórico del número de bases de la misma lo cual fue
observado mediante la técnica de electroforesis; por lo que se cumplió con el objetivo de la práctica, aunque
solamente por parte de nuestro equipo; ya que con el resto de los equipos del grupo no fue así.

REFERENCIAS

Lopez M. D. & Sandoval R. A. (2012). Electroforesis. Cap. XIII. Pp 117-125. Fierro F. F. Técnicas de Biología
Molecular. (2009). Electroforesis del ADN. México. Cap. III. Pp 28-34

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