I.

OBJETIVOS
 Aprender a desarrollar los diferentes métodos para el contaje de microorganismo,
para poder determinar la calidad de los alimentos.

 Aprende a realizar un homogenizado de un alimento que será analizado, donde

liberará microorganismo a medio de fluido y desconcentrarlos en diluciones
sucesivas hasta tener un numero tal que haga factible la determinación por
métodos de cultivo.
II. MARCO TEORICO
El análisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y número de
microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de
los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de
microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos
utilizados para investigar el número “total” de microorganismos:
1.-Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables
2.-Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del
número de células viables
3.-Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con
capacidad reductora
4.-Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no
viables
El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de
células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento.
Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:
 método de muestreo utilizado
 distribución de los microorganismos en la muestra
 naturaleza de la microflora del alimento
 naturaleza del alimento
 antecedentes del alimento
 adecuación nutricional del medio de cultivo
 temperatura y medio de incubación
 pH, Aw, potencial de oxidación reducción del medio
 tipo de diluyente utilizado
 número relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se

desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden
considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos
microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir
una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición
del medio y el tiempo de incubación.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de –
34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:
a) los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura:
psicrótofos
b) los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre
30 – 40º C: mesófilos
c) los que crecen por encima de los 45º C: termófilos

MÉTODO
El conteo de poblaciones microbianas por dilución en placa es un método simple y rápido
para la cuenta viable de células microbianas en el suelo. Sin embargo, la cuenta obtenida
es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada por cuenta directa por
microscopia. Las razones para esta discrepancia incluyen la exclusión de la cuenta no
viable directamente en el suelo y la inhabilidad para proveer apropiados nutrimentos en
el medio de crecimiento, para obtener la cuenta total en placa.
El método de dilución en placa se fundamenta en que cualquier célula viable inoculada
en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil identificación, como la
formación de colonias en placas de Agar. Este método consiste en la preparación de una
serie de diluciones de una muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una
alícuota de una dilución sobre la superficie de un medio de cultivo sólido e incubando la
placa de Agar bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilución debe permitir generar
colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación
(unidad viable), la cual se contará como una bacteria. Bajo este fundamento, estas placas
pueden ser usadas no sólo para el conteo de poblaciones microbianas, sino también para
el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado
dependiendo de la naturaleza del microorganismo que se desea contar o aislar (Ramírez
et al., 1992).

CÁLCULOS

1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias.

2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s.

UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).

Dónde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco.
NC = número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la
que se inocula la caja (10-2 a 10-10).
V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
+P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).
III. PARTE EXPERIMENTAL

4.1 Materiales y equipos

 Placas Petri
 Balones
 Tijeras
 Cuchillas
 Solución Salina Peptonada (SSP)
 Estufas
 Tubos de prueba
 Pinzas
 Vasos de licuadora
 Contador de colonias
 Agar nutritivo
 Producto a analizar : tomate

4.2 Procedimiento

 Proceder a armar la licuadora con sus partes previamente esterilizadas, con

ayuda de las pinzas colocar el anillo de silicona junto al aro portacuchillas.
 Imagen 2. Armado de la licuadora
Imagen 1. Anillos de silicona

Preparación de la dilución 10-1

 pesar 50 g de muestra (tomate) en el vaso de licuadora para luego añadir 450 ml

de Solución Salina Peptona (SSP).Trabajar a 30 cm de la llama para evitar
contaminación

Imagen 3. Muestra Imagen 4. Añadido de SSP

de tomate a los 50 g de muestra

 Homogenizar la muestra triturándolo por 2 minutos, comenzando con la

velocidad más baja de la licuadora y aumentando gradualmente la velocidad
hasta alcanzar la máxima velocidad de la licuadora.
 Imagen 5. Homogenización de la Imagen 6. Velocidades que posee
muestra mediante la licuadora la licuadora

 Dejar reposar por 5 minutos hasta que se separe la espuma y se formen tres fases
definidas (separación de fases).

SOBRENADANTE

Imagen 7. Reposado por 5 Imagen 8. Separación de fases

minutos.

Preparación de la dilución 10-2

 Tomar 1 ml del sobrenadante y depositarlo en un tubo que contiene 9 ml de SSP.

Agitar el tubo para mezclar la dilución.
 Imagen 9. Extracción de 1 ml de Imagen 10. Realización de la
sobrenadante de la dilución 10-1 dilución 10-2

Preparación de la dilución 10-3

 Medir nuevamente 1 ml de la dilución anterior (10-2) y llevarlo a un tubo con 9 ml

de SSP, para así obtener la dilución 10-3

Preparación de la dilución 10-4

 Medir nuevamente 1 ml de la dilución anterior (10-3) y llevarlo a un tubo con 9 ml

de SSP, para así obtener la dilución 10-4
El número de diluciones dependerá del tipo de alimento que se va a analizar.

Método de siembra: siembra en profundidad.

 Colocar en placas Petri 1 ml de todas las diluciones preparadas y rotularlas
adecuadamente. Sembrar con pipeta limpia en cada una.
 Imagen 11. Llevado de las diluciones
al centro de las placas Petri

 Agregar a cada placa 15 ml de agar estándar, fundido y temperado a 45 ºC, para

el recuento en placas.

Imagen 12. Agregado del agar a

cada una de las placas.

 Homogenizar con
movimientos rotatorios en forma de infinito. Para mezclar la alícuota liquida y el
medio de cultivo.

Imagen 13. Homogenización de las

placas
  Dejar solidificar todas las placas manteniendo un momento en la superficie de la
mesa.

Imagen 14. Solidificación de la

muestra.

 Incubar a 37 º C por 48 horas.

 Contar el número de colonias que son visibles con la ayuda del equipo de
laboratorio: Cuenta Colonias.

 Calcular el número total de microorganismos, de acuerdo al contaje representativo

de la dilución correspondiente, y expresar los resultados en unidades formadoras
de colonias por gramo o mililitro (UFC / g o ml).

IV. RESULTADOS

Método Recuento en Placa

Incubación 37°C – 48h

Resultado:
Se observó en la placa
la Aparición de muchas
colonias, de diferentes
tamaños y colores, por
ser más de 30 lo
llevamos a un cuenta
colonias, para
determinar la cantidad
de colonias

Se dividió en dos la  DE ACUERDO A LA NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE

placa Petri y se contó
en el cuenta colonias,
dándonos como
resultado 103 colonias.
Método para conteo:
*Contaje x 2:
103 x 2= 206
1031.03x 102x10
*Resultado:
1x103= 1000 UFC/g
2.06 x 102x10= 2060
LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD
SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y
BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO SE ACEPTA UNA
CANTIDAD DE MICROORGANISMOS AEROBIOS VIABLES DE
102 A 103, ENTONCES LAS MUESTRAS DE TOMATE
ANALIZADAS NO ESTAN APTAS PARA EL CONSUMO
DEBIDO A QUE NO CUMPLES CON LOS ESTÁNDARES DE LA
NORMA.

Otro método para 10-1:

1g ---- 10 ml
0.1g--- 1 ml

0.1g --- 206

1g --- x
X = 2060

 Preparación de la Dilución 10-1

 Preparación de la Dilución 10-2

Método Recuento en Placa

Incubación 37°C – 48h

Resultado:
Se observó en la placa
la Aparición de pocas
colonias, de diferentes
tamaños y colores, por
ser menor de 30 no
será necesario usar el
cuenta colonias.

 Preparación de la Dilución 10-3

Método Recuento en Placa

Incubación 37°C – 48h

Resultado:
Se observó en la placa
que no hubo presencia
de colonias, en esta
dilución no se
desarrollaron
microorganismos.

 Preparación de la Dilución 10-4

Método Recuento en Placa

Incubación 37°C – 48h

Resultado:
Se observó en la
placa que no hubo
presencia de
colonias, en esta
dilución no se
desarrollaron
microorganismos
presentes en la
muestra.

VI. CONCLUSIONES

 Se concluye que en la práctica realizada, el método de dilución 10-1 donde

la solución es más concentrada, se observó muchas colonias de diferentes
 tamaños y colores en la muestra de tomate analizada, dando un alto valor
de colonias concluyendo una mala calidad del alimento analizado.

 En el método de dilución 10-2 se observo pocas cantidades de colonias,

por lo tanto en las otras dos métodos no se observo presencia de colonias,
indicando negatividad en el desarrollo de microorganismo en el producto.

VI. DISCUSIONES

- Según Camacho, A. (2009)

En las Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos Se consideran
“representativas“las muestras que tienen un número de colonias dentro del rango de
sensibilidad del método, en este caso, entre 25 y 250 UFC por lo cual damos contra lo
que dice el autor ya que en la práctica se tomó un rango mayor de UFC (30 y 300
colonias) debido a los márgenes de errores que pueden existir en el procedimiento de la
práctica

- Según DIGESA:
Según DIGESA, de acuerdo a la Norma Sanitaria que establece los criterios
microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo
humano se acepta una cantidad de microorganismos aerobios viables para el tomate de
102 a 103,en la práctica la muestra de tomate analizada dio resultados superiores a los
aceptados que fue de 2060, esto determina que el producto no está dentro de los estándares
adecuados según la norma.

BIBLIOGRAFÍA
- Camacho, A. (2009) Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. México.
- Ramírez G. R. M., Luna M. B., Mejía Ch. A., Velázquez M. O., Tsuzuki R. G., Vierna G.
L., Müggenburg I. 1992. “Manual de prácticas de microbiología general. Laboratorio
de microbiología experimental. Facultad de Química”, UNAM.

- DIGESA- RM N° 615-2003 SA/DM: Norma Sanitaria que establece los criterios

microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de
consumo humano