I.

INTRODUCCIÓN
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo Gram negativos, inmóviles o
móviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies
forman ácido o ácido y gas a partir de glucosa. Su composición antigénica es un
mosaico que interrelaciona serológicamente varios géneros y aun familias, muchas de
estas bacterias son parásitos de animales y otros patógenos.
Para enjuiciar la calidad de las aguas se recorre a parámetro físico químico y biológico.
Los parámetros bacteriológicos tienen mayor importancia para dictámenes higiénicos;
es preciso hallar el número de gérmenes saprófilos o de coli y de bacterias procedentes
del intestino humano como indicadores de la contaminación.
Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes,
pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con producción de gas y
ácido. Para determinar el número de estas bacterias se suele emplear medio selectivo
de endo.

II. OBJETIVO
Determinar mediante el método de los tubos múltiples (NMP), el número de coliformes
presentes en una muestra de agua, realizando prueba presuntiva y de confirmación de
coliformes totales.

III. MARCO TEÓRICO

El agua, alimento esencial para los animales incluido el hombre, frecuentemente actúa
como vehículo de transmisión de microorganismos entéricos. La materia fecal puede
accidentalmente alcanzar una fuente de abastecimiento, siendo la forma más común el
ingreso a través de los sistemas de pozo ciego a napas profundas.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) en sus Guías para la calidad del agua
potable, la Directiva 98/83/CE1 y otras normas internacionales, establecen o
recomiendan requisitos de calidad para el agua de consumo humano. En general, la
normativa establece que el agua es apta bacteriológicamente para consumo si se
encuentra exenta de microorganismos patógenos de origen entérico y parasitario
intestinal. Ellos transmiten enfermedades tales como salmonelosis (Salmonella),
shigelosis (Shigella), colera (Vibrio Cholerae), amebiasis (Entamoeba histolytica),
alteraciones gastrointestinales (Aeromonas mesófilas, Helicobacter pylori,
Campylobacter); giardiasis (Giardia lamblia), cristosporidiosis (Crystosporidium),
esquistosomiasis (Schistosoma), desórdenes hepáticos (virus de hepatitis), etc.
La presencia de microorganismos patógenos en el agua de bebida es un riesgo que se
incrementa en las áreas marginales de mayor densidad poblacional o en zonas sin
disponibilidad de agua potable. La seguridad que un agua contaminada puede ser
causal de enfermedades, ha conducido a la necesidad de controlar rutinariamente la
calidad microbiológica de muestras de diversos orígenes.
Los controles rutinarios de la totalidad de los microorganismos hídricos, potencialmente
riesgosos para la salud, resultan difíciles de llevar a cabo debido a la gran variedad de
 bacterias patógenas cultivables, a la complejidad de los ensayos de aislamientos y a la
presencia en baja concentración de varias especies altamente agresivas, sin que el
orden detallado indique prioridad. Por esta razón, los análisis bacteriológicos apuntan a
la búsqueda de microorganismos indicadores de contaminación fecal y se centralizan
en la cuantificación de coliformes. Este grupo está integrado por enterobacterias, siendo
Escherichia coli el indicador universal de contaminación fecal. (Pelczar, Reid & Chan.
(1994). Microbiología. España: McGraw – Hill)

IV. MATERIALES Y EQUIPOS

 2 Botellas esterilizadas
 Probeta de 100 ml
 Pipeta de 5 ml y 10 ml
 9 Tubos de ensayo
 9 campanas Durham
 Placas petri
 Balanza
 Agua peptonada o peptona
 Agua Destilada
 Caldo lauril sulfato
 Agar Mac Conkey
 Mechero
 Asa de inoculación
 Estufa 35 – 37°C
 Jarra eléctrica

V. MÉTODO

Se aplicará la técnica de los tubos múltiples, consiste en la prueba presuntiva y la prueba

de confirmación de coliformes totales. La prueba presuntiva es un procedimiento basado
en la reacción negativa que excluye la presencia del grupo coliformes y una reacción
positiva indica su posible presencia. Y como resultado consiste en el Número más probable
(NMP). Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento y
aparición de gas en la campana de fermentación. La ausencia de gas se considera como
prueba negativa.

La prueba de confirmación de coliformes totales consiste en que se someten a prueba los

tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva y para esto se hace
transfiriendo una azada de cada tubo a otro y sembrar por estría.
 Imagen N° X: Representación gráfica de la dilución
de la muestra. Del tubo 10-1, 10-2 y 10-3 parten tres
tubos más por cada uno.

PROCEDIMIENTO

Para cualquier proceso realizado en el laboratorio se requiere de todo material esterilizado

y en medio, con presencia del mechero. Así mismo, cada alumno con sus implementos de
higiene y seguridad.

Para determinar el número más probable (NMP) en agua:

1) Preparar caldo peptonado: 1.1 gr de peptona diluir en 110 ml de agua destilada y

esterilizar durante 15 minutos
2) Pesar caldo lauril sulfato 3,026 gr y diluir en 85 ml en agua destilada, mezclar en
una botella esterilizada.

Foto N° X: Preparación del caldo lauril sulfato en medio estéril

3) En 9 tubos llenar 9 ml de caldo lauril sulfato y en cada tubo colocar campana de

durham.
 Foto N° X: Los 9 tubos con caldo lauril y campanas durham en medio estéril

4) En una botella añadir 90 ml de caldo peptona y en 2 tubos añadir 9 ml de caldo

peptona a cada tubo
5) Para la solución madre unir 90 ml del caldo peptonado más 10 ml de la muestra
(agua de cebada).

Foto N° X: Preparación de la solución madre.

6) Esterilizar los 11 tubos por 30 minutos

Foto N° X: Preparación del caldo lauril sulfato en medio estéril

 7) Enfriar e incubar por 48 h a 37°C

Foto N° X: Enfriamiento de los tubos con caldo lauril sulfato

Para la prueba de confirmación de coliformes totales:

1) Retirar luego de 48 h los tubos, observar.

Foto N° X: Tubos con presencia positiva de coliformes luego de 48 h

2) Sembrar en Agar Mac Conkey los tubos positivos, comprueba la presencia de gas.
3) Incubar por 48 h a 37°C
4) Leer las placas sembradas y observar la presencia bacteriana.

Foto N° X: Placas sembradas con presencia objetiva de coliformes

 VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES

MUESTRA Agua de cebada

LUGAR DE RECOLECCIÓN Av. Dos de mayo – Cercado de Lima
FECHA Y HORA Viernes 25/05/2018 -18:00 horas
MÉTODO Número Más Probable (NMP)
Caldo Peptonado – Caldo Lauril Sulfato
MEDIO DE CULTIVO
– Para la siembra: Agar Mc Conkey
FECHA Y HORA DE LA SIEMBRA Lunes 28/05/2018 – 11:30 am
TEMPERATURA DE INCUBACIÓN
37°C
(siembra)
TIEMPO Y FECHA DE INCUBACIÓN
48 horas – Miércoles 30/05/2018
(siembra)

LECTURA DE TUBOS:

1. Después de realizar el Método del Numero

Más Probable, e incubar las muestras por un
período de 72 horas (límite excedido) se
observó lo expuesto en la tabla de a
continuación:

Posterior a 72 horas:

NÚMERO
DILUCIÓN DE
1° TUBO 2° TUBO 3° TUBO DE TUBOS
TUBOS
POSITIVOS
10-1 X X 2
10-2 X 1
10-3 X 1

- De esta lectura, por el Método NMP se obtuvo la siguiente relación según la

tabla del Numero Más Probable de Mc Grady:

LÍMITES DE
TUBOS POSITIVOS INDICE
CONFIANZA
DEL NMP
3 tubos de 3 tubos de 3 tubos de
POR 10 ml Inferior Superior
10 ml 1 ml 0.1 ml
2 0 1 14 3 44
2 0 2 20 89
 2 1 3 26
2 1 0 15 3
2 1 1 20 7 47
2 1 2 27 150
2 2 3 34
2 2 0 21 4

Por lo tanto, en la relación 2/1/1 se obtuvo 20 por índice del NMP.

- Cuyo factor de dilución (FD) es: 10
- Mediante la siguiente formula, obtendremos la POBLACIÓN total expresada en
coliformes por milímetros.

POBLACIÓN = NMP*FD

POBLACIÓN = 20*10=200
coliformes/ml

SIEMBRA:

Se realizó la siembra, para la duplicación por cada dilución de tubo positivo ante el Método
del NMP.

- Utilizando el Agar Mc Conkey.

CANTIDAD DE TUBOS
DILUCIÓN
SIEMBRA POSITIVOS
4 2 10-1
2 1 10-2
2 1 10-3

- Resultados tras la incubación por 48 horas a 37°C.

DILUCIÓN 10-1

Primer tubo positivo Tercer tubo positivo

 DILUCIÓN 10-2

Segundo tubo positivo

DILUCIÓN 10-3

Segundo tubo positivo

VII. CONCLUSIONES:

- La normativa del consumo de agua, indica que el agua es potable y se considera

para consumo humano si contiene >2 NMP/100mL de organismos coliformes
totales.
- La cantidad de tubos positivos por cada dilución se basó en la producción de
gases dentro de la campana Durham y/o turbidez de la solución dentro del tubo.
- En los tubos de dilución 10-2, se observa mayor presencia de la bacteria
Escherichia coli.
 FICHA DE ANALISIS Y RESULTADOS MICROBIOLOGICOS

10-1 (IV)
PLACA 10-2 (I)
10-3 (I Y II)
MEDIO DE CULTIVO AGAR MC CONKEY
METODO DE SIEMBRA POR ESTRIAS
FECHA Y HORA DE SIEMBRA EN
Lunes 28/05/2018 – 11:30 am
PLACA
T° Y TIEMPO DE INCUBACIÓN 37°C – 48 Horas
CCATAMAYO LA TORRE, ROXANA
NOMBRE DEL ANALISTA
MARILUZ

 Resultados a las 48 horas:

CCATAMAYO LA TORRE, ROXANA

NOMBRE DEL ANALISTA
MARILUZ
FECHA Y HORA DE LA LECTURA MIERCOLES 30/05/2018 – 11:30 am

MORFOLOGÍA PLACAS 10-3 (I) 10-3 (II) 10-2 (I) 10-1 (IV)
Circular X X X
Irregular X
FORMA
Redondeada
Rizoide
Aplanado
ELEVACION Elevado X X X X
Cóncavo
Liso
Rugoso
SUPERFICIES
Mate X X X X
Brillante
Entero X X X
Ondulado X
BORDES Lobulado
Dentado
Irregular
COLOR Rosado Intenso
Transparente X X
OPACIDAD
Opaco X X
Seco
CONSISTENCIA Mucoide X X
Membranosa X X
Escasa X
CONTAMINACION
Regular X X X
 ANÁLISIS
MUESTRA Agua de cebada
LUGAR Av. dos de mayo
CONDICIONES DE LUGAR Zona contaminada por transporte de vehículos
y comensales
FECHA Y HORA DE TOMA DE MUESTRA 25/mayo/18 – 20:30 pm
PLACA Dilución 10-1
MEDIO DE CULTIVO Agar Mac Conkey
METODO DE SIEMBRA Estrías
FECHA Y HORA DE SIEMBRA EN PLACA 28/mayo/18 – 11:30 am
T° Y TIEMPO DE INCUBACIÓN 37°C - 48 h
RESULTADOS A LAS 48 HORAS
MUESTRA DE LA PLACA 10-1 (iv)
FECHA Y HORA DE LA LECTURA 30/mayo/18 – 11:30 am
NOMBRE DEL ANALISTA Berrocal Allccaco, Nazaret Mariadely
CARACTERÍSTICAS
FORMA Redondeada
ELEVACIÓN Elevado
SUPERFICIES Mate
BORDES Ondulado
OPACIDAD Transparente
CONSISTENCIA Escasa mucosidad
CONTAMINACIÓN Regular
DESCRIPCIÓN
El color amarillezco del medio se debe a la
presencia de los coliformes y estos a su vez
desprenden su ácido, producido por la
fermentación de la lactosa presente en el agar
Mac Conkey. Esto confirma la presenta de los
coliformes con un grado de contaminación
Foto N° X: Muestra de la placa 10-1 (IV) regular.
 ANÁLISIS
MUESTRA Agua de cebada
LUGAR Av. dos de mayo
CONDICIONES DE LUGAR Zona contaminada por transporte de vehículos
y comensales
FECHA Y HORA DE TOMA DE MUESTRA 25/mayo/18 – 20:30 pm
PLACA Dilución 10-3
MEDIO DE CULTIVO Agar Mac Conkey
METODO DE SIEMBRA Estrías
FECHA Y HORA DE SIEMBRA EN PLACA 28/mayo/18 – 11:30 am
T° Y TIEMPO DE INCUBACIÓN 37°C - 48 h
RESULTADOS A LAS 48 HORAS
MUESTRA DE LA PLACA 10-3 (I)
FECHA Y HORA DE LA LECTURA 30/mayo/18 – 11:30 am
NOMBRE DEL ANALISTA Alarcón Dauney, Milagros Martina
CARACTERÍSTICAS
FORMA Circular
ELEVACIÓN Elevado
SUPERFICIES Mate
BORDES Entero
OPACIDAD Opaco
CONSISTENCIA Membranosa
CONTAMINACIÓN Escasa
DESCRIPCIÓN
Por fermentación de la lactosa, disminuye el
pH alrededor de la colonia. Esto produce un
viraje del color del color del indicador de pH
(rojo neutro), la absorción en las colonias, y la
precipitación de sales biliares. Esto confirma la
presenta de los coliformes con un grado de
Foto N° X: Muestra de la placa 10-3 (I) contaminación regular.

VIII. CONCLUSIONES:

- El color amarillo en Agar Mc Conkey, se encuentra en medio acido debido a la

formación de ácido.
- El color rojo del agar dado en los resultados de las placas Petri, es a
consecuencia del Indicador ROJO NEUTRO.
 - En la placa 10-3 (I), presenta una población de coliformes escasa, donde destaca
una coliforme elevada, rosada con halo, opacos, de forma circular y que
representaría a una Escherichia Coli.

- En la placa 10-3 (II), presenta una población de coliformes regular, con bordes
enteros, de superficie mate, y con una forma circular.

- En la placa 10-2 (I), presenta población regular, con bordes enteros, son
transparentes, con elevación ligera, y de forma circular.

- En la placa 10-1 (IV), presenta población regular, con bordes ondulados, son
transparentes, con elevación ligera, y de forma circular.

ACTIVIDADES
1. Clases de Coliformes
El grupo coliforme abarca los géneros Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y
Serratia. Cuatro de estos géneros (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter y Serratia) se
encuentran en grandes cantidades en el ambiente (fuentes de agua, vegetación y suelos)
no están asociados necesariamente con la contaminación fecal y no plantean ni
representan necesariamente un riesgo evidente para la salud (ALLEN, 1996). Las bacterias
coliformes, no deben estar presentes en sistemas de abastecimiento, almacenamiento y
distribución de agua, y si así ocurriese, ello es indicio de que el tratamiento fue inadecuado
o que se produjo contaminación posterior. Se ha demostrado que las especies de
Enterobacter y Klebsiella colonizan con frecuencia las superficies interiores de las cañerías
de agua y tanques de almacenamiento (a menudo llamado "rebrote") y crecen formando
una biopelícula cuando las condiciones son favorables, es decir, presencia de nutrientes,
temperaturas cálidas, bajas concentraciones de desinfectantes y tiempos largos de
almacenamiento (ALLEN, 1996).

Coliformes pueden estar presentes en: heces fecales de animales de sangre caliente,
pájaros, tierra.

TIPOS DE E. COLI

E. coli enterotoxigénico (ETEC)

• Causante de la diarrea del viajero
• Dosis infecciosas altas z
Vehículo: agua o alimento
contaminado con aguas usadas

E. coli enteropatogénico (EPEC)

• Mecanismo de virulencia
probablemente por la producción
de una verotoxina (Shiga-like
toxin) .Alimentos implicados son
carne molida y pollo.
E. coli enterohemorrágico (EHEC) E.
Coli
• Es habitante normal de los
intestinos de todos animales
incluyendo los humanos.
Producción de una verotoxina
.Dosis tan bajas como 10
organismos.
E. coli enteroinvasivo (EIEC)
• Parte de la flora intestinal normal
de los humanos y otros primates
.Dosis infecciosa 10 organismos.
Produce “bacillary dysentery” .Se
confunde con shigellosis.

2. Medios para detectar coliformes:

Medios Medio
LST Lauryl Sulfate Tryptose Broth - BGLB
Prueba presuntiva para coliformes. Se
informa como “presumptive
coliforms/g” Ingredientes
• Lauryl Sulfate: Algunas
bacterias no pueden crecer -
Selectivo
• Lactosa: Producción de gas
Diferencial w/durham tubo
• NaCl – Aumenta razón de
reproducción Tryptona –
Fuente de Nitrógeno z Incube a
35°C por 48 horas
Medio
– EMB Agar
• Eosine Methylene Blue Agar
• Placas ya servidas
• Estriado para aislar del MPN
Ingredientes Diferencial Peptona
• Proteína
• Lactosa
• Producción de ácido
• Tinte
• Eosine
• Inhibitorio
• Azul de metileno
Indicador de pH
Brilliant Green Lactose Bile
 Incube a 35 °C por 48 horas
 Producción de gas –Positivo
Ingredientes
• Oxgall forma de bilis
• Brilliant Green Dye –Inhibe
Gram +
• Resultados son coliformes
confirmados
• No utilize BGLB directamente
• Altamente inhibitorio
Método Sólido
VRBA (Violet Red Bile Agar)
• Peptona – Fuente de
nitrógeno
• Lactosa – Producción de
ácido
• Rojo neutral – Indicador (6.8
rojo, 8.0
• amarillo)
• Cristal Violeta – Inhibe Gram
+
• NaCl – Aumenta razón de
crecimiento
• Sales biliares
  Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables.
Es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades
formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos de microorganismos viables
se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas
con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales
determinadas. Para la dilución se suele utilizar agua de peptona tamponada o Ringer 1/4.

 Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo

estadístico del número de células viables.
Se basa en la determinación de presencia o ausencias de un determinado tipo de m.o. (en
función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio), en
cantidades decrecientes de muestra. La muestra de alimento se procesa como en el caso
anterior en tres diluciones proporcionales seriadas sembradas en 9 a 15 tubos del medio
adecuado, para el método de los 3 ó 5 tubos respectivamente.

 Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células

viables con capacidad reductora
Está basado en el uso de colorantes que pasan por un proceso de reducción. Al alimento
adecuadamente preparado se añaden soluciones patrón de azul de metileno o de
resarzurina y se observa el proceso de la reducción del colorante (de azul a blanco para el
azul de metileno; de azul apizarrado a rosa o blanco para la resarzurina). El tiempo
necesario para que se produzca la reducción del colorante está relacionado con el número
de microorganismos de la muestra.

• Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para
las no viables.
Se prepara en portaobjetos corrientes o especiales, se practican extensiones de la muestra
de alimento (o diluciones bajas de él), se tiñen con un colorante adecuado y se cuentan las
células microbianas (aisladas o en grupos) de un determinado número de campos
microscópicos. Con estos datos se calcula el número de microorganismos por gramo
usando el factor del microscopio.

• Método de detección de coliforme fecales

Para el recuento de y coliforme también se utiliza la técnica de placas Petrifilm EC, el cual
contiene nutrientes de Bilis Rojo Violeta (VRB), un agente gelificante soluble en agua fría y
un indicador que facilita la enumeración de las colonias.

 Para realizar prueba de coliforme se usan dos procedimientos:

A. El de filtración a través de la membrana (MF)

B. El del número más probable (MPN) o bien el método de tubos múltiples. Este
método se basa en determinar la presencia o ausencia de un terminado MO
Este método se analiza en forma paralela por triplicado o quintuplicadas
proporciones de la muestra cada vez menores en un medio líquido Ejemplo: Se
 utiliza un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra
0.1g de muestra, en tres 0.01g y en los otros tres 0.001g. Estos se incuban, se
observan y cuenta el número de tubos positivos. Ocasionalmente, es necesario
subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a placa, o a
otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo.

3. Pruebas presuntivas y confirmativas para coliformes:

A. PRUEBA PRESUNTIVA
Consiste en un procedimiento de criba en el que una reacción negativa excluye la presencia
del grupo coliforme y una reacción positiva indica su posible presencia. Dispondremos de
un matraz con 50 ml y dos series de tubos conteniendo 10 y 1 ml respectivamente de caldo
MacConkey, y provistos de una campana de recogida de gases (campana Durham).
Mediante pipetas estériles, se siembran el matraz y las dos series de tubos con un volumen
igual de agua ya homogeneizada debido a ello el medio deberá prepararse a doble
concentración. Después de la siembra, será necesario una buena homogenización de los
tubos que se llevaran a incubar durante 24 h a 37ºC. Lectura e interpretación de los
resultados. Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observe viraje del
indicador debido a la acidificación del medio, y aparición de gas en la campana Durham.

B. PRUEBA DE CONFIRMACION DE COLIFORMES TOTALES

Es un procedimiento mediante el cual, una reacción negativa excluye la presencia del grupo
coliforme, mientras que una reacción positiva indica su presencia inequívoca. Deben
someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba
presuntiva. A partir de ellos y tras homogenizar su contenido, se procederá a sembrarlos
mediante asa en estría, sobre la superficie de placas Petri conteniendo medio de agar-
lactosa-eosina-azul de metileno
(medio de Teague Levine ó EMB).

A continuación, se incubarán las

placas a 37ºC durante 24h. Las
bacterias fermentadoras de lactosa
crecen sobre este medio dando
colonias opacas y pigmentadas en
rosa, azul violeta oscuro con ó sin
brillo metálico, mientras que las
colonias que aparezcan distintas a
las descritas pertenecerán a
bacterias no fermentadoras de
lactosa. Posteriormente, de cada
placa, seleccionaremos una colonia
de cada uno de los diferentes
aspectos descritos como característicos y se resiembra mediante hilo ó asa sobre agar
nutritivo inclinado y a continuación y sin recargar se resiembra un tubo de caldo MacConkey,
con campana Durham, incubándose a 37ºC durante 24 h. Al término de la incubación, se
comprueba la producción de gas en el tubo lactosado y en el caso de que sea positiva, se
toma mediante asa ó pipeta Pasteur una porción del cultivo desarrollado sobre el agar
inclinado y se le practica la prueba de la oxidasa. O bien se siembra la bacteria en agua de
peptona y se le realiza la prueba del indol. Esta prueba sirve para medir la producción de
indol a partir de triptofano debido a la acción de la enzima Triptofanasa. Esta enzima
degrada el triptofano hasta indol y pirúvico, el cual es utilizado como fuente de energía. El
indol por el contrario se acumula en el medio y puede ser puesto de manifiesto con el
reactivo de Kovacs el cual va a extraer el indol que va a reaccionar con el
paradimetilaminobenzaldehido dando lugar en medio acido a un complejo de color rojo
denominado Rosindol el cual queda concentrado en forma de un anillo en la parte superior
del tubo, ya que el alcohol amílico no se mezcla con el agua y al ser menos denso que esta,
se queda por encima. 16 Lectura e interpretación de los resultados. Si en la placa de medio
EMB no se desarrollan colonias ó bien las aparecidas no son fermentadoras de lactosa con
producción de gas la prueba de confirmación es negativa. En el caso de que la colonia
aislada sea fermentadora de la lactosa con producción de gas y oxidasa negativa ó indol
positiva, la presencia de coliformes totales se considera confirmada. Si la reacción de la
oxidasa es positiva, ó la del indol es negativa, la presencia de coliformes totales se
considerará negativa, aunque la colonia aislada haya fermentado la lactosa con producción
de gas. Para el cálculo del NMP de coliformes totales se contabilizarán como positivos
aquellos tubos de la serie que hayan dado una prueba de confirmación positiva.

COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS EMPLEADO

 AGUA DE PEPTONA
• Peptona 1%
• NaCL 0.5%
• pH 7.2
• CALDO DE MacConkey
• Bilis de buey 5g/l
• Peptona 20g/l
• Lactosa 10g/l
• Púrpura de bromocresol 0.01g/l
• Agua destilada 1000ml
• pH 7.3
 AGAR CON EOSINA Y AZUL DE METILENO (Teague-Levine) EMB
• Peptona 10g/l
• Lactosa 5g/l
• Sacarosa 5g/l
• Fosfato di potásico 2g/l
• Agar 14g/l
• Eosina amarilla 0.4g/l
• Azul de metileno 0.065g/l
 • Agua destilada 1000ml
• pH 7.2
 REACTIVO DE KOVACS
• Alcohol amílico 150ml
• p-dimetil aminobenzaldehido 10g
• HCL concentrado 50ml
• Prueba presuntiva
• Caldo Lauril Triptosa (CLT).
• Caldo Mc. Conkey.
• Caldo lactosa.
• Medio EC.
• Prueba confirmativa:
• Medio EC.
• Medio bilis lactosa (BLVB)

4. Fundamento del método número más probable:

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar
la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h,
utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.

Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase
presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite
la recuperación de los microorganismos dañados que se Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón,
M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Durante la fase confirmativa se emplea como
medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el
verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta
en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son
incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h. La búsqueda de
Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran
por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul
de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las
colonias típicas.
 Figura 2: método del Número más probable

5. Test de Eijman:
Prueba de Eijkman o prueba de coliformes diferenciales o confirmación de Escherichia coli
Es una prueba utilizada para la identificación de bacterias coliformes de animales de sangre
caliente basada en la capacidad de las bacterias para producir gas cuando se cultivan en
medios de glucosa a 46 ° C ( 114.8 ° F). La prueba para determinar si las bacterias
coliformes provienen de animales de sangre caliente. Mediante esta prueba se puede
establecer fácilmente si el agua ha sido contaminada por defecación humana y animal que
contiene bacilos de coli. La prueba fue presentada por Christiaan Eijkman (1858-1930) en
su artículo en 1904.

6. Descripcion de formulaciones y preparación y usos de medios de

cultivo:
Uso (medio ) Formulación Preparación
Caldo nutritivo
Método de preparación:
Extracto de carne con Fórmula: Ingredientes por
1) Disolver 8 g en 1 litro de agua
NaCl. Se puede litro.
destilada o desmineralizada.
suplementar con Extracto de
2) Distribuir en tubos.
extracto de levadura, carne..........................3g
3) Esterilizar en autoclave por
peptonas, glucosa, etc. Peptona...................5g
15 minutos a 15 libras de
Para microorganismos pH final: 6.8 ± 0.2 a 25 °C.
presión (121 °C).
no exigentes
Peptona bacteriológica
Formulación Suspender 15 g de polvo en 1
Usado como medio de Triptona.......................10, litro de agua destilada. Mezclar
cultivo, manufactura o 0 Sodio Cloruro bien y distribuir. Esterilizar en
fabricación de toxinas, ..............5,0 autoclave a 121°C durante 15
vacunas y otros pH: 7,2±0,2 minutos.
productos biológicos.
Método de preparación:
Fórmula: Ingredientes por 1) Suspender 23 g en 1 litro de
Agar nutritivo
litro. Extracto de agua destilada o
Medio rico para el cultivo
carne................................ desmineralizada.
de microorganismos en
3g 2) Calentar a ebullición para
general, crecen una gran
Peptona............................ disolver completamente.
mayoría, excepto
5g 3) Esterilizar en autoclave por
algunos muy exigentes
Agar.................................. 15 minutos a 15 libras de
15 g pH final: 6.8 ± 0.2 a presión (121°C).
25 °C. 4) Distribuir en la forma
deseada.
Caldo Mac Conkey
Aislamiento de bacterias Formulación
Disolver 35 g de medio
gram negativas Oxgall ……………5,0
deshidratado en un litro de agua
(enterobacterias). El Peptona………. 20,0 g
destilada y
colorante cristal violeta Lactosa…………10,0 g
mezclar. Distribuir y esterilizar a
inhibe las gram Púrpura de bromocresol
121°C durante 15 minutos.
positivas. Las sales 0,01 g
Enfriar
biliares inhiben las gram Agua destilada c.s.p. 1000
a temperatura ambiente antes
positivas y algunas gram mL
de su utilización.
negativas). pH final 7,3 ± 0,2

Caldo Brilla
Medio selectivo
Formulación:
recomendado para la
Bilis de buey Disuelva 40 gr del medio en un
prueba confirmatoria en
deshidratada ……………. litro de agua purificada hasta
la detección del grupo
20.0 que este uniforme ,caliente con
coliforme en aguas,
lactosa agitación frecuente para disolver
leche, derivados lácteos
…………………..10.0 , distribuya en tubos de
y otros productos de
peptona………………….. fermentación , en autoclave
importancia sanitaria,
10.0 121°Cno más de 15 mnts.
mediante la
Verde brillante……. 0.013
determinación del NMP
3
Caldo Lauril Sulfato Preparación
Formulación
El caldo lauril sulfato se • Disuelva 35.6 g del
Triptosa……………..
utiliza para la detección medio en un litro de
20,00 g
de bacterias coliformes agua purificada.
Lactosa……………….
en agua y aguas • Mezcle bien.
5,00 g
residuales en un entorno • Prepare caldo con doble
Cloruro sódico …….5,00 g
de laboratorio. El caldo concentración para
Fosfato dipotásico 2,75 g
lauril sulfato no está evaluar muestras de 10
Fosfato monopotásico
destinado a ser utilizado mL. Distribuya en tubos
2,75 g
en el diagnóstico de de ensayo que
 enfermedades u otras Lauril sulfato sódico 0,10 contengan tubos
condiciones en g Durham invertidos.
humanos. (Fórmula por litro) Autoclave a 121°C durante 15
pH final: 6,8 ± 0,2 minutos.

Caldo lactosa Formulación Suspender 13 g del medio en un

El caldo de lactosa se Ingredientes por litro. litro de agua purificada. Calentar
utiliza para el cultivo de Extracto de carne 3 g con agitación suave hasta su
Salmonella y bacterias Peptona 5g completa disolución y hervir
coliformes de alimentos, Lactosa 5 g durante un minuto. Dispensar en
lácteos y productos de pH final: 6.9 ± 0.2 a 25 °C. tubos con campanas de Durham.
agua en un entorno de Esterilizar en autoclave a 121°C
laboratorio. (15 libras de presión) durante 15
minutos. Dejar enfriar lo más
pronto posible.
Agar manitol Formulación Disolver 111 g de medio en 1 litro de
El agar sal manitol en una Extracto de carne bovina 1,0 g agua destilada.
fórmula diseñada por Digerido pancreático de Calentar hasta ebullición, agitando
Chapman para la caseína 5,0 para su disolución.
diferenciación de Digerido péptico de tejido Autoclavar a 121 ºC durante 15
estafilococos (+) a la animal 5,0 minutos.
coagulasa (por Cloruro sódico 75,0
ejemplo,Staphylococcus D-manitol 10,0
aureus) de los Rojo fenol 0,025
estafilococos negativos a Agar 15,0
la coagulasa. pH 7,4 ± 0,2

Agar Baird Parker Formulación Disolver 58 g de medio en 1 l

Medio de alta Bacto trytone 10g de agua destilada. Calentar
especificidad diagnóstica, Bacto beef extract 5.0 hasta ebullición agitando para
selectivo y diferencial Bacto yeast extract 1.0 su completa disolución.
para el aislamiento y Cloruro de litio 5.0 Autoclavar a 121 ºC durante
recuento de estafilococos glicina 12Piruvato sódico 10 15 minutos. El color final del
coagulasa positiva en Telúrito potásico 0.1 medio es crema.
alimentos y otros Agar 20
materiales de importancia Emulsión de yema de huevo 50.ml
sanitaria. PH: 6.5-7.1
Agar EMB Formulación Rehidratar 36 g del medio en
Digerido pancreático de gelatina 10,0 un litro de agua destilada.
Este medio es utilizado g Reposar 10 a 15 minutos.
para el aislamiento Lactosa 5,0 Calentar agitando
selectivo de bacilos Gram Sacarosa 5,0 frecuentemente hasta el
negativos de rápido Fosfato dipotásico 2,0 punto de ebullición durante 1
desarrollo y escasas Agar 13,5 minuto para disolverlo por
exigencias nutricionales. Eosina 0,4 completo. Esterilizar en
Permite el desarrollo de Azul de metileno 0,065
todas las especies de la pH 7,2 +/- 0,2
familia
Enterobacteriaceae.
Agar Plate Count
El Plate Count Agar ( Agar
para Standard Methods),
es un medio utilizado para
la enumeración de
bacterias aeróbicas en
aguas, aguas residuales y
alimentos.
Agar Mac Conckey
Este medio se utiliza para
el aislamiento de bacilos
Gram negativos de fácil
desarrollo, aerobios y
anaerobios facultativos.
Permite diferenciar
bacterias que utilizan o
no, lactosa en muestras
clínicas, de agua y
alimentos. Todas las
especies de la familia
Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo.
AGAR SS
Es un medio selectivo y de
diferenciación para el
aislamiento de bacilos
entéricos patógenos, en
especial los
pertenecientes al género
Salmonella, a partir de
muestras clínicas.
MEDIO EC
Es utilizado para la
detección de bacterias
coliformes a 37°C y
Escherichia coli a Fosfato Dipotásico 4 g
autoclave a 121ºC (15 lbs de
presión) durante 15 minutos.
Enfriar aproximadamente a
45ºC. Vaciar en cajas de Petri
estériles. Conservar a
temperatura ambiente.
Disolver 23,5 gramos de
Formulación medio en 1 litro de agua
Hidrolizado pancreático de caseína bidestilada. Calentar,
(Triptona) 5.0 g agitando, hasta ebullición,
Extracto de levadura 2.5 g para la total
Glucosa 1.0 g homogeneización. Repartir
Agar 15.0 g en tubos o en frascos.
pH : 7,0+/- 0,2 Autoclavar durante 15
minutos a 121 ºC. El color
final del medio es blanco-
crema.
Digerido pancreático de gelatina Suspender los ingredientes
17,0 g en el agua destilada. Calentar
Digerido pancreático de caseína 1,5 g agitando
Digerido péptico de tejido animal 1,5 g frecuentemente y dejar hervir
Lactosa 10,0 g hasta disolver
Mezcla de sales biliares 1,5 g completamente. Esterilizar
Cloruro de en autoclave a 121ºC (15 lb
sodio 5,0 g de presión) durante 15
Agar 13,5 g minutos. Se debe evitar el
Rojo neutro 30,0 mg sobrecalentamiento. Enfriar
Cristal violeta 1,0 mg entre 45ºC y 50ºC, colocar 20
Agua destilada 1.000 mL mL
pH final 7,1 ± 0,2 de medio por cada placa y
dejar solidificar.
Fórmula por litro de agua purificada Disolver 63 g de medio en 1
Extracto de carne bovina 5,0 g litro de agua destilada.
Digerido pancreático de caseína 2,5 Calentar agitando hasta
Digerido péptico de tejido animal 2,5 ebullición para su disolución.
Lactosa 10,0 Mantener la ebullición durante
Sales biliares 8,5 2 minutos. Autoclavar 116 ºC
Citrato sódico 8,5 durante 5 minutos. El color
Tiosulfato sódico 8,5 final del medio es rojo-
Citrato férrico 1,0 naranja.
Rojo neutro 0,025
Agar 13,5
Verde brillante 0,330 mg
Fórmula / Litro 1. Disuelva 37 g del medio en
Triptosa 20 g un litro de agua purificada.
Lactosa 5 g 2. Mezcle completamente.
Mezcla de Sales Biliares 1,5 g 3. Distribuya dentro de los
tubos Durham que contienen
Fosfato Monopotásico 1,5 g fermentación invertida.
elevadas temperaturas
(44,5°C y 45,5°C).
TRIPTONA
Es un medio utilizado para
propósitos generales,
favorece el desarrollo y
aislamiento de una gran
variedad de
microorganismos
aerobios, y anaerobios
facultativos y estrictos.
AGAR TSI
Se utiliza como medio en
placa, se emplea para la
diferenciación de
Enterobacteriaceae, en
especial Salmonella de
otras bacterias entéricas.
AGAR LIA
Es un medio de cultivo
ampliamente utilizado
para la diferenciación de
bacilos Gram negativos
entéricos, especialmente
miembros del género
Salmonella con capacidad
de fermentación de
lactosa, sobre la base de
la producción de H2S y la
actividad de la enzima
Lisina decarboxilasa.
AGAR CITRATO
Es un medio de cultivo
para la diferenciación de
bacterias gram negativas
mediante la utilización de
citrato.
Cloruro de Sodio 5 g
pH Final: 6,9 ± 0,2 a 25°C
Fórmula (en gramos por litro)
Tripteína 1 5.0
Peptona de soja 5.0
Cloruro de sodio 5.0
Agar 15.0
pH final: 7.3±0.2
Fórmula por litro de agua purificada
Digerido pancreático de caseína 10 g Agar
Digerido péptico de tejido animal 10 g presuntiva de una placa de
Cloruro sódico 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso de amonio 0,2g
Tiosulfato sódico 0,2 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
pH 7,3 ± 0,2
Composición (gramos / litro):
Extracto de levadura 3.00
Digesto pancreático de gelatina 5.00 Calentar, agitando, hasta
Dextrosa 1.00
L-lisina HCL 10.00
Citrato de Amonio Ferrico 0.50
Tiosulfato de sodio 0.04
Púrpura de Bromocresol 0.02
Agar Bacteriológico 13.50
pH final medio de cultivo listo para el
uso: 6.5 +/- 0.2
Fórmula aproximada por litro de agua
purificada
Fosfato de amonio dihidrogenado 1g
Fosfato dipotásico 1,0 g
Cloruro sódico 5,0 g
Citrato sódico 2,0 g
4. Autoclave a 121°C durante
15 minutos.
Disolver 40 g del polvo en 1
litro de agua purificada.
Mezclar y dejar reposar 5
minutos. Calentar agitando
suavemente y hervir durante
1 o 2 minutos hasta su
disolución total. Distribuir en
recipientes apropiados y
esterilizar en autoclave a 121
ºC durante 15 minutos.
Distribuir en placas de Petri
estériles en condiciones
asépticas controlado por
monitoreo ambiental. Cada
placa de Petri es sellada con
parafilm previamente
esterilizado por óxido de
etileno.
Inocular BD Triple Sugar Iron
con una colonia
aislamiento primario o con un
asa llena de medio del caldo
de enriquecimiento de
Salmonella. Incubar en
atmósfera aerobia a 35 – 37
°C durante 18 – 24 h.
Disolver 29,5 gramos en 1
litro de agua bidestilada.
ebullición, para la total
homogeneización. Autoclavar
a 121 ºC durante 10 minutos.
Preparar tubos inclinados con
pico corto.
Disolver 69,5 gramos en 1
litro de agua destilada. Agitar
calentando hasta ebullición.
No autoclavar, sobrecalentar.
El color final del medio es
rosa pálido, traslúcido, con un

AGAR UREA
Es un medio diferencial,
no selectivo, en especial
para las Enterobacterias
según su capacidad para
producir Ureasa.
AGAR CITRATO DE
SIMMONS
Es un medio de cultivo
utilizado para diferenciar
las bacterias Gram
negativas en función de
su capacidad de utilizar el
Citrato como única fuente
de Carbono.
MEDIO MR VP
Es un medio diferencial
para Enterobacterias,
basado en la reacción del
Rojo Metilo (MR) y del
Acetilmetilcarbinol ( VP,
Voges-Proscauer)
AGAR SAUBORAUD
Este medio de cultivo es
utilizado para cultivo de
mohos y levaduras
patógenas y no
patógenas.
Sulfato magnésico 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul de bromotimol 0,08 g
COMPOSICION POR LITRO DE
MEDIO EN AGUA PURIFICADA
Hidrolizado pancreático de gelatina 1 g
Dextrosa 1,0 g
Cloruro sódico 5,0 g
Fosfato potásico 2,0 g
Urea 20,0 g
Rojo Fenol 0,012 g
Agar 15,0 g
pH= 6,8 +/- 0,1
COMPOSICION POR LITRO
MEDIO EN AGUA PURIFICADA
Citrato Sódico 2,0 g
Cloruro Sódico 5,0 g
Fosfato Amónico 1,0 g
Fosfato dipotásico 1,0 g
Sulfato Magnésico 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul de Bromotimol 0,08 g
pH= 6,8 +/- 0,2
COMPOSICION POR LITRO
MEDIO EN AGUA PURIFICADA
Mezcla de Peptonas 7,0 g
Fosfato dipotásico 5,0 g
Dextrosa 5,0 g
pH= 6,9 +/- 0,2
Composición
Digerido enzimático de caseína 10 g deshidratado en un litro de
Dextrosa 40 g
Agar 15 g
Agua destilada c.s.p. 1000 mL
pH final 5,6 ± 0,2
fino precipitado de
desoxicolato.
Suspender 22,5 gramos del
polvo en 1 litro de agua
destilada. Dejar 5 a 10
minutos a temperatura
ambiente. Llevar a ebullición
durante unos minutos
agitando de vez en cuando.
Esterilizar 20 minutos a
115ºC. Enfriar a 50-65 °C y
agregar 50 ml de una solución
estéril de urea al 40%,
esterilizada por filtración o
cloroformo. Mezclar y
dispensar en tubos estériles,
dejar enfriar en posición
inclinada.
DE 1.Suspenda 24.2g del medio
en un litro de agu
2.Caliente con agitación
frecuente y hierva durante 1
minuto para disolver
completamente el medio
3.Dispense en tubos y
autoclave a 121°C durante 15
minutos
4.Luego de autoclavar,
permita que el medio se
solidifique en una posición
inclinada
DE Suspender 17g del medio en
1 litro de agua purificada.
Calentar con agitación suave
hasta su completa disolución
y hervir durante 1 minuto.
Dispensar en tubos de vidrio,
tapar y esterilizar en
autoclave a 118-121°C
Suspender 65 g de medio
agua destilada. Calentar
agitando frecuentemente y
dejar hervir durante 1 minuto
para disolver completamente
los ingredientes. Evitar el
sobrecalentamiento.
Esterilizar a 121°C durante 15
minutos. Distribuir y enfriar a
 temperatura ambiente antes
de su utilización.

IX. RECOMENDACIONES
- Al momento de obtener o retirar la muestra del agua (cebada) tener cuidado ya
que se puede contaminar.
- Realizar el método de siembra cuidadosa y detalladamente, en este caso por
estrías, para obtener una clara visión de las colonias.

X. ANEXOS

Fig.1 Sujetar el pico de la botella con pabilo para calentar en

baño maría el agar Mac Conkey.
Fig.2 Análisis y descripción de las colonias en el agar Mac
Conkey en placas Petri.

Fig.3 Pipetear el caldo verde brilla en tubos de ensayo

XI. BIBLIOGRAFÍA

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CE – CCA – 001 / 89.
Goez López, M; Vázquez García, M. J.; Pena Caamaño, P. (1996).
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 http://coli.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html
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NMP_6529.pdf
 http://www.ugr.es/~cjl/colimetria.pdf
 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2199795/
 https://issuu.com/sandralucia.71/docs/manual_preparacion_de_medios_de_cul
 http://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
 https://es.scribd.com/doc/111643713/Preparacion-de-Medios-de-Cultivo-y-
Siembra-de-Bacterias-en-Medios-de-Cultivo
 http://www.lamolina.edu.pe/facultad/ciencias/cbiologia/boletin/INFORME_BIO_EXP
_2012-I.pdf
 http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Prepa
raci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf