Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Mitohondrijska DNK
1.1. Mitohondrije
1
Mitohondrijske kriste su mesta na kojima se nalaze enzimi transportnog lanca
elektrona. Enzimi transportnog lanca učestvuju u procesu oksidativne fosforilacije i grupisani
su u pet proteinskih kompleksa. Svaki kompleks sastavljen je od većeg broja subjedinica.
Najveći je kompleks I koga čine 40 proteinskih subjedinica. Kompleksi I, III i IV „pumpaju”
protone kroz unutrašnju membranu mitohondrija, što dovodi do stvaranja elektrohemijskog
gradijenta (~150mV), dok ATPaza (kompleks V) sintetiše adenozin-trifosfat (ATP) od
adenozin-difosfata (ADP) i neorganskog fosfata.U mirovanju, prosečnom odraslom muškarcu
potrebno je 3x1018 molekula ATP-a u sekundi. Procenjuje se da telo odrasle osobe
proizvede oko 70 kg ATP-a dnevno a da 70% stvorenog ATP biva utrošeno za moždane
funkcije. Ćelije koje u svom funkcionisanju zahtevaju veću količinu energije poseduju i veći
broj mitohondrija. Tako, gotovo 80% volumena citoplazme fotoreceptora čepića i preko 40%
volumena kardiomiocita čine mitohondrije. Pored uloge u procesu ćelijskog disanja,
mitohondrije imaju ulogu u metabolizmu aminokiselina, lipida, holesterola, prekursora polnih
hormona i nukleotida, a predstavljaju i mesta produkcije slobodnih radikala. U
mitohondrijama se odvija i sinteza brojnih molekula neophodnih za funkcionisanje
eukariotskih ćelija, kao što su hem i ubikvitin. Mitohondrije se smatraju i centralnim
organelama u procesu regulisane (programirane) ćelijske smrti po tipu apoptoze indukovane
unutrašnjim signalima, odnosno oštećenjima u jedarnom genomu.
2
mtDNK zavisi od potreba ćelija za energijom. Sintetski aktivne ćelije karakteriše veći broj
mitohondrija, pa samim tim i veći broj molekula mtDNK. Zrele oocite poseduju preko 100.000
molekula mtDNK. Najmanji broj molekula mtDNK (oko 10) nalazi se u spermatozoidima.
Svi molekuli mtDNK vode poreklo od ženki. Molekuli mtDNK poreklom od mužjaka
prenose se na potomstvo samo u retkim slučajevima kada dolazi do ukrštanja vrsta.
3
Tabela 1. Razlike u genetičkom kodu mtDNKsisara, kvasca i biljaka
kodon jedarna DNK mtDNK sisara mtDNK kvasca mtDNK biljaka
UGA Stop kodon Trp Trp Stop kodon
AGA, AGG Arg Stop kodon Arg Arg
AUA Ile Met Met Ile
AUU Ile Met Met Ile
CUU, CUC, Leu Leu Thr Leu
CUA, CUG
CUU, CUC,
CUA, CUG
Sisarske mtDNK prepisuju se u jednu dugu policistronsku RNK čijom obradom nastaju
mitohondrijske iRNK, tRNK, rRNK i ncRNK. Kod kvasca i biljaka mtDNK prepisuje se u
monocistronske iRNK. Monocistronske iRNK prepisane sa mtDNK biljaka poseduju
samoiskrajajuće introne, i to kako introne grupe I, tako i introne grupe II, i podležu procesu
obrade. Pokazano je da se određeni broj transkripata u mitohondrijama biljnih ćelija i edituje
dezaminacijom citidina (C) u uridin (U).
Veličina mtDNK čoveka iznosi 16569 bp (slika 2a). Sekvenca mitohondrijske DNK
čoveka publikovana je 1981. godine, kada je utvrđen i GC sastav koji iznosi 44%.
Sekvenciranje mtDNK čoveka izvršeno je Sangerovom metodom sekvenciranja od strane
njegovog naučnog tima sa Univerziteta u Kembridžu. Na osnovu flotacione gustine, utvrđeno
je da je jedan lanac lakši od drugog, tako da se jedan lanac mtDNK čoveka definiše kao laki
4
lanac (lanac L), a drugi kao teški lanac (lanac H). Lanac H kodira dve rRNK (12S i 16S), 14
tRNK i 12 proteina, dok lanac L kodira osam tRNK i jedan protein. Oko 70% kodirajućeg
dela mtDNK čine protein-kodirajuće sekvence. Intergenske sekvence su svedene na
nekoliko bp a pojedini geni se preklapaju (na primer, geni za ATPazu 8 i ATPazu 6) (slika
2b).
5
Slika 3. Kompleksi enzima respiratornog lanca su u genetičkom smislu hibridnog
porekla. Mitohondrijska DNK kodira sedam proteina kompleksa I, jedan protein kompleksa
II, tri proteina kompleksa IV i dva proteina kompleksa V (plavom bojom su označene
subjedinice kompleksa koje su kodirane jedarnim genomom).
Danas se zna da je preko 1500 proteina mitohondrija kodirano jedarnom DNK. Pored
enzima transportnog lanca to su proteini neophodni za replikaciju i transkripciju mtDNK, za
translaciju mitohondrijskih iRNK, kao i proteini koji učestvuju u formiranju mitohondrijskih
membrana i u membranskom transportu. Svi proteini mitohondrija koji su kodirani jedarnim
genima sintetišu se na ribozomima u citoplazmi i na svojim N-krajevima sadrže presekvence
za sortiranje u mitohondrije na osnovu kojih bivaju uvezeni u mitohondrije.
Geni mtDNK čoveka ne sadrže introne, neki od njih se preklapaju, a osim jednog
regulatornog regiona, intergenske sekvence su odsutne ili svedene na nekoliko bp. Kod
ćelija čoveka (kao i drugih vertebrata) koje su metabolički aktivne, mtDNK sadrži kratke
trolančane strukture koje se nazivaju D-petlje (eng. desplacement loop), i u kojima kratki
nukleotidni lanac, komplementaran lancu L, zamenjuje lanac H. Veličina D petlje kod čoveka
iznosi 1121 bp. Region D-petlje ograničen je genima za tRNK za fenilalalnin (Phe) i tRNK za
prolin (Pro) i evoluirao je kao glavno kontrolno mesto za replikaciju i ekspresiju mtDNK.
Takođe, sadrži oridžin replikacije teškog lanca i glavne promotore za transkripciju oba lanca
(slika 4).
6
u istočnoj Africi pre 200000 godina, odakle je prvim migracijama ljudi počelo naseljavanje
drugih delova naše planete.
Oridžin replikacije teškog lanca (OH) lociran je u D-petlji nekodirajućeg regiona (slika
4), dok je oridžin replikacije lakog lanca (OL) dve trećine genomske distance udaljen od
OH. Replikacija mtDNK je bidirekcioni proces (slika 5). Replikacija lanca H odvija se u pravcu
kazaljke na satu. Kada replikaciona viljuška prođe OL, dolazi do inicijacije sinteze lanca L
koja se odvija pravcem suprotnim od replikacije lanca H.
7
Slika 5. Replikacija mtDNK je bidirekcioni proces. Replikacija otpočinje sintezom ćerke
lanca teškog lanca sa oridžina replikacije lanca H koji se nalazi u okviru D-petlje. Kada
replikaciona viljuška prođe oridžin replikacije lanca L, otpočinje sinteza ćerke lakog lanca
koja se odvija u suprotnom smeru od sinteze ćerke teškog lanca.
8
označene kao U6 i koja se nalazi 16 - 18 nukleotida nizvodno od G-kvadripleks regiona
(G6AG8).
Tokom transkripcije lakog lanca, RNK polimeraza transkribuje region CSBII zahvaljujući
aktivnosti mitohondrijskog transkripcionog elongacionog faktora (TEFM). Na taj način, TEFM
efikasno prevenira terminaciju transkripcije odnosno sintezu prajmera neophodnog za
replikaciju teškog lanca mtNDK.
Slika 6. Proteini koji učestvuju u replikaciji mtDNK sisara. DNK polimeraza γ započinje
sintezu DNK elongacijom prajmera koji je sintetisan od strane mtRNK polimeraze. Nakon
otpočinjanja replikacije, prajmer biva uklonjen aktivnošću RNaze H1. Aktivnošću proteina
Twinkle, nizvodno od mesta aktivnosti DNK polimeraze γ, dolazi do raskidanja vodoničnih
veza u molekulu mtDNK koji se replikuje, a jednolančani molekul DNK biva obavijen
proteinima mtSSB. Topoizomeraze u replikaciji mtDNK imaju istu ulogu kao i kod replikacije
jedarne DNK.
Transkripciju oba lanca mtDNK vrši mitohondrijska RNK polimeraza (MTRPOL), koja
pokazuje strukturnu sličnost sa RNK polimerazom bakteriofaga klase T7/T3. MTRPOL je
DNK-zavisna RNK polimeraza izgrađena iz samo jedne subjedinice (eng. single-subunit
polymerase), na čijem se C-kraju nalazi katalitički domen, a na N-kraju sekvenca odgovorna
za sortiranje u mitohondrije.
Kao i kod jedarne DNK, za inicijaciju procesa transkripcije mtDNK neophodna je aktivnost
transkripcionih faktora. U procesu inicijacije transkripcije mtDNK kod čoveka učestvuju dva
transkripciona faktora: mitohondrijski transkripcioni faktor A (TFAM) i mitohondrijski
transkripcioni faktor B2 (TFB2M) (slika 7). Generalno, uloga transkripcionih faktora u
9
transkripciji mtDNK slična je ulozi sigma faktora tokom transkripcije u prokariotskim ćelijama.
Proteini MTRPOL, TFAM i TFB2M kodirani su jedarnim genomom.
Pored uloge u procesu transkripcije, TFAM ima ulogu i u procesima inicijacije replikacije
mtDNK i regulacije broja kopija mtDNK. Poslednja istraživanja pokazuju da ovaj protein ima
sposobnost stvaranja homodimera koji učestvuju u formiranju DNK petlji, i na taj način
učestvuje u procesu pakovanja mtDNK (slika 8c).
10
Slika 8. Mitohondrijski transkripcioni faktor A (TFAM). a) Tokom inicijacije trankripcije
učestvuje u regrutovanju MTRPOL i TFB2M na promotor; b) Inhibira transkripciju blokirajući
vezivanje MTRPOL i TFB2M na promotor; c) U formi dimera indukuje formiranje DNK petlji i
na taj način učestvuje u procesu pakovanja mtDNK.
Molekul mtDNK poseduje tri promotora, dva za lanac H (HSP 1 iHSP2) i jedan za lanac L
(LSP) (eng. strand promoter, SP). Promotor LSP nalazi se u okviru D-petlje. Transkripcijom
lakog lanca mtDNK prepisuje se policistronska RNK koja nosi informacije za jedan protein
11
(NADH dehidrogenaza 6, ND 6), osam molekula tRNK i RNK prajmer za replikaciju mtDNK
koja otpočinje sa oridžina replikacije teškog lanca. Na teškom lancu, promotor HSP1 nalazi
se ~150 bp uzvodno od LSP i sa njega otpočinje transkripcija dva gena za tRNK i dva gena
za rRNK. Na teškom lancu, ~60 bp uzvodno od HSP1 (2bp uzvodno od 5’ kraja gena za 12S
rRNK) nalazi se promotor HSP2 sa koga otpočinje transkripcija policistronske RNK koja nosi
informaciju za 12 tRNK i 12 proteina: NADH dehidrogenazu 1 (ND1), NADH dehidrogenazu 2
(ND2), citohrom C oksidazu I (COXI), citohrom C oksidazu II (COXII), ATPazu 8, ATPazu 6,
citohrom C oksidazu III (COXIII), NADH dehidrogenazu 3 (ND3), NADH dehidrogenazu 4L
(ND4L), NADH dehidrogenazu 4 (ND4), NADH dehidrogenazu 5 (ND5) i citohrom B (CytB)
(slika 9).
12
terminacioni faktor mtTERF1 učestvuje i u inicijaciji transkripcije koja počinje sa promotora
HSP2. Terminacija transkripcije inicirana sa promotora HSP2 je manje proučen proces, a
pretpostavlja se da region H2, bogat AT parovima, koji se nalazi uzvodno od gena koji kodira
tRNK za aminokiseliu fenilalanin (Phe) predstavlja region terminacije transkripcije.
Endonukleaza RNaza P (EC 3.1.26.5) vrši isecanje 5’-kraja tRNK. Isecanje 3’-kraja
tRNK vrši se na različite načine, delovanjem endonukleaza, egzonukleaza ili kombinacijom
ova dva mehanizma. Jedan od enzima koji vrši ovo isecanje je enzim RNaza Z (tRNaza Z;
EC 3.1.26.11). Maturacija mitohondrijskih tRNK kompletira se dodavanjem tripleta CCA na
3’-kraj molekula aktivnošću enzima ATP(CTP):tRNK nukleotidil transferaze.
13
(MRP), kodirani su genima koji se nalaze u jedarnoj DNK. Mitoribozomi različitih vrsta
poseduju različit broj ovih proteina. U sisarskim ćelijama malu subjedinicu mitoribozoma
gradi 29, a veliku oko 50 MRP. Iako više od polovine ovih proteina pokazuje homologiju sa
proteinima bakterijskih ribozoma, mitoribozomi u sisarskim ćelijama se definišu kao
„proteinima-bogati“ ribozomi.
14
Faza elongacije translacije u mitohondrijama je slična fazi elongacije translacije kod
prokariota i zahteva prisustvo elongacionih faktora translacije. Tokom translacije, sve
aminokiseline bivaju aktivirane “uvezenim” enzimima aminoacil-tRNK sintetazama iz
citoplazme. Kada se tokom elongacije stop kodon (UAA ili UAG) nađe u mestu A
mitoribozoma započinje proces terminacije translacije. Stop kodon u mestu A biva prepoznat
od strane terminacionog faktora mtRF1a koji indukuje GTP-zavisnu hidrolizu i oslobađanje
polipetidnog lanca.
Mitohondrije sisara mogu posedovati identične kopije molekula mtDNK i ova pojava se
definiše kao homoplazija. Kako mtDNK ima visoku stopu mutabilnosti, u mitohondrijama je
češća pojava da su neke kopije mtDNK mutirane. Kako mitohondrije formiraju mitohondrijsku
mrežu preko koje molekuli mtDNK imaju sposobnost prelaska iz jedne mitohondrije u drugu,
različite mitohondrije iste ćelije poseduju različit broj kopija mutirane mtDNK. Ova pojava
naziva se heteroplazija. Heteroplazija može biti intraćelijska ali i interćelijska. Drugim
rečima, u okviru iste ćelijske populacije ili tkiva, ćelije mogu, ali i ne moraju da poseduju
mutirane kopije mtDNK. Tokom deobe ćelije, ćerke nasleđuju mitohondrije, a time i molekule
mtDNK. U slučaju pojave heteroplazije, deobom ćelija nasleđuju se i molekuli mutirane
mtDNK.
15
transkripcije i translacije mtDNK i proteine koji učestvuju u složenim procesima
„komunikacije“ jedarnog i mitohondrijskog genoma.
Pojam mitohondrijske bolesti obuhvata veliku grupu različitih oboljenja koja dovode
do patoloških izmena u različitim tkivima i organima, i čiji se simptomi javljaju u različitoj
životnoj dobi. Dosadašnje epidemiološko-genetičke studije pokazale su da je većina bolesti
koja se dijagnostikuje kod odraslih posledica mutacija u mtDNK, dok je većina bolesti koja se
javlja kod dece posledica mutacija u genima jedarne DNK koji kodiraju za mitohondrijske
proteine. Ukupna učestalost mitohondrijskih bolesti u opštoj populaciji je jedan oboleli na
9.000 osoba. Pojedine mitohondrijske bolesti su dosta češće i javljaju se kod jedne u
nekoliko stotina osoba opšte populacije.
Do sada je registrovano preko 200 tačkastih mutacija i 120 različitih delecija u mtDNK
koje mogu biti uzrok mitohondrijskih bolesti. Ove mutacije su detektovane kako u genima za
proteine tako i u genima za tRNK.
Tokom mitoze, ćerke ćelije nasleđuju i mitohondrije. Ćelije koje se intezivno dele, a
koje karakteriše pojava heteroplazije, serijom mitoza mogu se osloboditi mutiranih kopija
mtDNK. Tako nakon deobe, jedna ćerka ćelija može imati samo neizmenjene (wt) kopije
mtDNK, dok druga ćerka ćelija može posedovati daleko veći broj mutiranih kopija mtDNK u
16
odnosu na broj mutiranih kopija kod majke ćelije. Ova pojava naziva se mitotička
segregacija mutiranih molekula mtDNK (slika 11). Do sada nije otkrivena nikakva
pravilnost u odvijanju procesa mitotičke segregacije mutiranih molekula mtDNK, pa se veruje
da se ona odvija nasumično. Kao posledica nasumičnog odvijanja mitotičke segregacije, broj
mutiranih kopija mtDNK u ćerkama ćelijama može se kretati u rasponu od 0 do 100%.
Slika 11. Mitotička segregacija mutiranih molekula mtDNK. Tokom mitoze, ćerke ćelije
mogu naslediti različit broj mutiranih kopija molekula mtDNK od majke ćelije. Nakon serije
deoba, neke ćelije mogu posedovati samo neizmenjene kopije mtDNK, naročito u tkivima u
kojima se ćelije intenzivno dele. Suprotno tome, ćelije koje se ne dele obično mnogo lakše
akumuliraju mutacije u molekulima mtDNK.
17
germinativnim ćelijama i oogonijama, zrele jajne ćelije mogu imati različit broj mutiranih
kopija mtDNK. To je razlog što se mitohondrijske bolesti nasleđuju na ne-Mendelovski način.
Majka može imati blage ili nikakve simptome dok njena deca mogu imati izražene simptome
mitohondrijske bolesti i obrnuto. Takođe, žene sa mitohondrijskim bolestima mogu imati
zdravo potomstvo.
Slika 12. Mitohondrijsko usko grlo. Oogenezu karakteriše serija deoba tokom kojih od
primordijalnih germinativnih ćelija nastaju zrele jajne ćelije. Primordijalne germinativne ćelije
imaju mali broj mitohondrija (10) i njihov broj raste do preko 100.000 mitohondrija u zrelim
jajnim ćelijama. Mitotičke deobe tokom oogeneze karakteriše i pojava segregacije mutiranih
kopija mtDNK, zbog čega se mitohondrijske bolesti nasleđuju ne-Mendelovski.
18
Ključni koncepti
19
za replikaciju mtDNK. Na teškom lancu, promotor HSP1 nalazi se ~150 bp uzvodno
od LSP i sa njega otpočinje transkripcija dva gena za tRNK i dva gena za rRNK.
Uzvodno od HSP1 nalazi se promotor HSP2 sa koga otpočinje transkripcija
policistronske RNK koja nosi informaciju za 12 tRNK i 12 proteina. Za terminaciju
transkripcije neophodno je učešće mitohondrijskih terminacionih faktora transkripcije
(mtTERF). Najmanje dva proteina imaju ulogu aktivatora transkripcije u
mitohondrijama.
20
Pitanja
21
Literatura
22