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Medicina PUCRS
Célula em interfase
Apenas cromatina = DNA enrolado em proteínas (histonas) para uma condensação que faça com que ele
caiba no núcleo
Desenrolado
Cada dupla hélice dá dias voltas ao redor das histonas
Cada duas voltas = nucleossomo (primeiro nível de compactação do DNA)
Nucleossomos se torcem um sobre o outro para se compactarem mais = diminui em 500x o tamanho dessa
dupla hélice
No núcleo: diversos pedaços de dupla-hélice = diversos cromossomos
46 dupla-hélices (cromossomos) condensados (23 dupla-hélices + par sexual)
Nucleotídeos: A, T, G, C
Hemácia: célula anucleada
O que é um gene?
Sequência de nucleotídeos que codifica algo
Pedaço da dupla-hélice, sequência de nucleotídeos, que tem um código que gera uma mutação
Uma sequencia de nucleotídeos que não codifica nada é apenas DNA, não é gene
Para ser gene tem que codificar algo
A posição de cada gene é sempre a mesma
Todo mundo tem todos os genes, o que podemos ter é versões diferentes do mesmo gene (alterações na
sequencia que fazem com que a proteína gerada seja diferente)
Todas as células têm todos os genes
Cromossomo Y é acrocêntrico
Corante para corar o cromossomo: giemsa. Ele se liga mais nas regiões de heterocromatina e menos nas regiões de
eucromatina
Heterocromatina: não expressa, gene de DNA repetitivo e sem função, não codifica nenhuma proteína
Eucromatina: cromatina que expressa algo, região transcricionalmente ativa, grande concentração de genes,
está mais frouxa (para as enzimas conseguirem se ligar nelas)
Mais de 50% do cromossomo Y é heterocromatina
3p14 = cromossomo 3, braço p, lócus 14 aqui tem algo que, quando alterado, faz a pessoa desenvolver câncer
renal
Lócus: posições fixas. A investigação de dados genético de qualquer pessoa é realizada através da comparação entre
diferentes locais do DNA (a denominação de local/locais, em genômica utiliza o termo em latim lócus/loci , ou
apenas lócus em português), que variam entre as pessoas da população. As diferentes formas que o DNA pode
apresentar para um mesmo lócus são chamadas alelos, e cada indivíduo possui dois alelos para cada lócus: um de
origem materna e o outro de origem paterna.
Pode haver mais um gene ativo em um lócus
Cada gene tem o seu lócus
Informações:
22 pares de cromossomos AUTOSSOMOS (numerados de 1 a 22)
Um par de cromossomos SEXUAIS X e Y: Mulheres XX; Homens XY
Somatório: 44 autossômicos + 2 sexuais = 46 cromossomos
Padrão: Mulheres: 46, XX Homens: 46, XY
ALELO: O Alelo é uma das diferentes versões do lócus/gene. Quando um segmento que ocupa um lugar no genoma
(lócus), tem versões diferentes, dá-se o nome de ‘alelo’ a cada uma dessas diferentes versões. Um alelo é formado
sempre que uma sequência original de um segmento sofre algum tipo de mutação (mudança) aleatória que não é
eliminada ou corrigida, ficando, portanto, presente na espécie. Imagine originalmente a sequência de DNA de um
lócus passando sempre de forma idêntica de geração em geração; em determinado momento, pode ocorrer uma
mutação (que seria uma mudança qualquer num zigoto, ou num gameta, por exemplo), que acaba por modificar a
sequência original do lócus. Se essa mutação não for corrigida, ou se ela não for responsável pela morte do indivíduo
onde ela ocorreu (sendo assim eliminada), ela poderá ser passada para os descendentes deste indivíduo. É desta
forma que se formam os alelos dos lócus/genes. Alelo é, então, uma de várias formas alternativas de um gene ou
sequência de DNA em uma posição específica do cromossomo (lócus). Para cada lócus autossômico um indivíduo
diploide possui dois alelos: um herdado do pai e um da mãe. Mesmo que para um determinado lócus existam mais
de dois alelos diferentes na espécie [por exemplo, os do grupo sanguíneo ABO, onde existe o alelo ‘A’, o alelo ‘B’ e o
alelo ‘O’], cada indivíduo normal herda sempre apenas dois.
Homo e heterozigotos:
Alelo dominante: é o que se expressa no heterozigoto (o DNA do recessivo até é transcrito, mas não vemos a
sua expressão)
Haplótipo
Região do cromossomo que sempre passa em blocos de uma geração pra outra
Cromossomos Y é, praticamente, um grande aplótipo (passa os mesmos alelos de pai pra filho)
Débora Dettmer – ATM19
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Indivíduo Diploide
Para um lócus autossômico (ou do cromossomo X em mulheres): Alelo herdado do pai é igual ao alelo
herdado da mãe → Indivíduo HOMOzigoto. Alelo herdado do pai ≠ Alelo herdado da mãe → Indivíduo
HETEROzigoto
Usa-se HEMIzigoto para lócus do cromossomo X e Y nos homens, pois estão em dose única
Genoma nuclear: mais de 26 mil genes, 3,2x109 pares de bases ou 3 Gb, um pouco mais de 1% codificante de
proteínas
3 Gb distribuídos em 24 tipos diferentes de moléculas lineares de DNA dupla-fita
Em média, 41% de pares G+C
DNA associado a proteínas histonas e não-histonas
2 cópias na maioria das células somáticas (diploides)
Variação na distribuição de eucromatina e heterocromatina constitutiva entre os cromossomos
Variação também no número de genes entre os cromossomos
Distrofia muscular de Duchene: vem pelo X
Gene distrofina: maior gene humano em pares de bases pq tem íntrons enormes e enxós pequenos
Pseudogenes: não são mais transcritos
Tamanho médio de uma proteína: 430 aa’s (cada aa tem 3 nucleotídeos)
Pseudogene: tem toda a sequencia de um gene que é transcrito, mas ele não é mais por alguma mutação ao
longo da evolução
DNA satélite: centrômero
Famílias gênicas:
Similaridade de sequência e estrutura dos produtos proteicos, gerados por duplicação gênica, incluindo
cópias que perderam a função (pseudogenes)
Superfamílias gênicas:
Sequências de DNA cujos produtos possuem estruturas e funcionalidades relacionadas porém com pouca
homologia de sequência
Transposons/retrotransposons
Sequências que saem de um lugar e se religam em outro
Quase todo DNA repetitivo não codificante disperso no genoma é derivado de transposons.
São sequências móveis de DNA que podem migrar para diferentes regiões do genoma
Retrotransposons: SINE (família Alu) e LINE
Transposons de DNA: sequência de DNA excisada e reinserida em outro local
Retrotransposons e doenças:
LINE - pacientes esporádicos com hemofilia A - diversos Kb de tamanho inseridos em um exon do gene do
fator VIII, inativando o gene
Alu - hipercolesterolemia familiar - presente nos íntrons do gene do receptor de LDL gerando duplicação de
enxós;
Débora Dettmer – ATM19
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Genes de RNA
MicroRNA’s
- pequena sequência de RNA que tem função no mecanismo de regulação da expressão
- Anela-se ao RNAm no citosol e impede que ele codifique uma proteína
- miRNA
- >1000 diferentes, citoplasmáticos
- regulam a expressão de conjuntos selecionados de genes-alvo pelo pareamento de bases com os
transcritos - inibe a tradução.
Histonas responsáveis pelo nível mais básico de compactação, o nucleossomo, que reduz em 1/3 o comprimento
inicial do DNA
DNA compactado porém de uma forma que esteja prontamente disponível
Compactação de ~10.000 vezes - cromossomo mitótico
~500 vezes - interfásico
cromossomo interfásico é dinâmico
Cada cromossomo interfásico tende a ocupar seu próprio e discreto território no núcleo
Posição alterada quando um gene é muito expresso
Ambientes bioquímicos distintos dentro do núcleo
REPLICAÇÃO
Desnaturação e renaturação
Se colocarmos o DNA em ambiente com alta temperatura, a fita desnatura, logo ocorre a separação (quebra
das pontes de hidrogênio).
No momento em que ocorre o resfriamento as fitas voltam a se anelar, ocorre a ‘renaturação’.
O aumento de ph também pode causar a desnaturação.
Início da replicação:
Obs: ver vídeo que está no moodle
Regiões chamadas de origem da replicação - múltiplas em cromossomos eucarióticos
Direção de crescimento: 5’è3’
A replicação é semi-conservativa e semi-descontínua
Replicação:
1) Ocorre a quebra das pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas essa quebra começa em ligações A-
T, pois possuem somente duas pontes de H a enzima que efetua a separação das hélices é a helicase após
ocorrer a separação é necessário que proteínas SSB (proteínas ligantes de fitas simples) se liguem na fita que
está separada para impedir que ela volte a se unir, e assim manter as fitas de DNA separadas para que
ocorra a replicação.
2) Quando as fitas já estão separadas, chega a enzima DNA polimerase que tem como função polimerização de
nucleotídeos da ligação fosfodiester com a finalidade de produzir uma fita complementar do DNA. Para que
a DNA polimerase consiga agir o primeiro nucleotídeo já tem que estar ligado no DNA.
Débora Dettmer – ATM19
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a) Esse primeiro nucleotídeo é inserido pela enzima PRIMASE que se anela ao DNA simples fita e
coloca uma molécula de primer de RNA (sequencia iniciadora) que irá servir de sinalizador para
que a DNA polimerase possa começar seu trabalho e sintetizar uma nova a fita.
b) Após a síntese pela DNA polimerase, ocorre substituição do primer de RNA (sinalizador) por
nucleotídeos de DNA. Essa substituição é feita pela enzima DNA polimerase 1.
c) DNA polimerase somente consegue adicionar o nucleotídeo na extremidade OH, logo ela
trabalha SEMPRE no sentido 3->5
3) . Na outra fita ocorre a síntese através de fragmentos de okazaki, que são fragmentos de DNA através de
primers, só que no sentido inverso. No final, todos esses fragmentos irão formar uma fita continua. A ligação
entre os fragmentos é feita pela enzima ligase.
4) Início da replicação
a) A replicação sempre começar por regiões chamadas de ‘origem da replicação’ – são múltiplas
em cromossomos eucarióticos
Expressão Gênica
Fatores de transcrição: sequência regulatória ou região promotora / partes codificantes e não codificantes (exons e
introns) / RNA vai ser copiado a partir do exon nucleotídeo +1.
A sequência regulatória são sequencias de DNA que são reconhecidas por enzima/fatores de transcrição (proteínas
auxiliares) que irão ativar a RNA polimerase, nessa parte os nucleotídeos são numerados em -1,-2,-3 (estão antes das
regiões codificantes que tem início no nucleotídeo +1) ....
Débora Dettmer – ATM19
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Transcrição:
Fatores de transcrição: proteínas auxiliares que reconhecem regiões promotoras dos genes;
RNA polimerase: enzima que realiza a síntese do RNA
- TAATTAT – tata box uma das regiões promotoras, está relacionado com a posição -28; são sequencias
que serão reconhecidas para efetuar a transcrição.
- Se ocorrer mutações nas sequências promotoras, isso pode silenciar aquele gene, logo ele não poderá ser
expresso. Se for um gene importante, a célula sofrerá prejuízos.
- Até onde vai a transcrição não se sabe... Não se conhece ainda uma estrutura fixa para indicar o termino.
Processamento do DNA
Débora Dettmer – ATM19
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Processamento do RNA
Adição do CAP o Nucleotídeo modificado que bloqueia a ação das nucleases. Adicionado na porção 5. É uma
molécula sinalizadora.
Inserção da cauda poliA
o Na extremidade 3, ocorre a síntese de cauda poli A, 200 adeninas que servem para proteger a
ação de nucleases.
Remoção dos introns
o Encadeamento (splicing), retirada dos introns e união dos exons.
Débora Dettmer – ATM19
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MUTAÇÕES
anemia falciforme é um
exemplo de mutação de sentido trocado
Débora Dettmer – ATM19
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Mutação espontânea
Aumenta o número de repetições em um e diminui no outro
Débora Dettmer – ATM19
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Metilações inativa
Mutação induzida
Luz UV, radiação ionizante, agentes químicos (provocando alterações químicas nas bases nitrogenadas,
análogos de base, ligação de grupamentos químicos, intercalantes de dupla-fita)
Luz UV produz dímeros de timina duas timinas da mesma fita pareiam entre só DNApolimerase não
consegue ler aquilo ou ele para de ler, ou ele apenas pula aquela sequência
Isso ocorre antes de termiar a fase G2 e começar a mitose/meiose (no final da G2, antes da mitose/meiose)
Entre essas duas fases há uma parada para correção de erros se o mecanismo de reparo não é capaz de corrigir
isso, a célula é induzida a apoptose
TÉCNICAS MOLECULARES
PCR
Para fazer essa reação in vitro iremos precisar de:
DNA molde
Enzima Taq polimerase
Tampão de reação
Nucleotídeos livres (dNTP = dATP, dCTP, dGTP e dTTP)
Cloreto de magnésio (cofator da enzima)
Primers específicos para a região a ser amplificada
Água estéril
Equipamento termociclador
Enzima Taq polierase faz a síntese do DNA
Equipamento: termociclador
DNA polimerase pega os nucleotídeos livres e estende a fita desnaturação a 94ºC
Eletroforese em Gel
É uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel (matriz) de acordo com sua
massa e carga
Pode ser utilizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como lipoproteínas, proteínas, RNA e
DNA
O PCR é a técnica APENAS de amplificação
- Pré-técnica para detectar mutações (ex: SNPs)
- Presença/ausência do DNA ou do genoma de um vírus (insere-se primers específicos para o genoma
daquele organismo, se houver amplificação no tubinho é porque aquela pessoa tinha o organismo presente)
- Deleções e inserções mutações do tipo INDEL
O princípio da eletroforese para separação de DNA baseia-se:
- na carga do DNA (ele vai do polo - para o polo +)
- No tamanho da molécula
Brometo de etídeo corante de DNA - molécula que se intercala na duplahélice e, quando ligada ao DNA e
exposta a luz UV, fluoresce na cor alaranjada.