ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

DR. JUAN GUILLERMO CÁRCAMO

INSTITUTO DE BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

ENZIMOLOGIA DIAGNOSTICA

- Comprender la utilidad de las mediciones

enzimáticas.
- ¿Qué información proporciona la medición de la
actividad enzimática?
- Familiarizarse con los fundamentos del ensayo
enzimático para el diagnóstico clínico.

Refs:
Clinical Laboratory Medicine. Kenneth D. McClatchey. Capítulo 11, pp: 259 - 286
Clinical Chemistry. Lawrence A. Kaplan & Amadeo Pesce. Capítulos 27, 31 y 54
Medical Biochemistry. John Baynes & Marek Dominiczak

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 ENZIMAS:

- Catalizadores biológicos. Muy eficientes.

- Son proteínas, susceptibles de desnaturación.
- Especificidad de sustrato.
- Parcialmente específicas de tejidos u órganos.
- Normalmente, son intracelulares.
- Su aparición o disminución en la sangre indica
daño (célula, membrana o muerte celular).
- Su medición permite evaluar extensión del daño.

CINÉTICA ENZIMATICA

Fase de agotamiento de
sustrato (depleción)
C B
Absorbancia 340 nm

Fase lineal

m = velocidad

Fase de
retardo (lag)

0 Tiempo (min) 0 Tiempo (min)

Conceptos:
- Velocidad inicial, velocidad de reacción
- Tipos de ensayo (punto final, “cinético”; ventajas....)
- Efecto cantidad de enzima (mayor o menor “actividad”)

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 Dependencia de v0 en función de la [S]

Conceptos: -Orden de reacción (exceso de [E] ó de [S])

-Condiciones y supuestos en Michaelis-Menten
-Gráficas cinéticas y de Michaelis
-Km y Vmax

UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (UI)

DEFINICION: es la cantidad de enzima necesaria para

transformar un micromol (µmol) de sustrato en producto por
minuto y bajo condiciones estándares de pH y temperatura.

UI= µmol/min

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 Absorbancia y Ley de Lambert y Beer

A = log I0/I = ε l C (Ley de Lambert-Beer)

A=εlC

Absorbancia de luz UV por aminoácidos aromáticos

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 Ensayos de laboratorio

Pueden ser:
- de punto final (a tiempo fijo), o
- cinético (desarrollo en el tiempo)

En el primer caso las variables pueden ser [S] o

[E] o incluso el tiempo de reacción (t). En el
segundo caso (cinético) las variables pueden ser
[S] o [E].

Puede variar

0 S1 S2 S3 S4 S5 , a tiempo fijo Fundamento en la determinación de metabolitos (glucosa)

S = sustrato
E = enzima Fundamento en la determinación de enzimas (****)
0 E1 E2 E3 E4 E5 , a tiempo fijo
t = tiempo

0 t1 t2 t3 t4 t5 Situación aplicable al ensayo cinético

a tiempos variables

Intensidad del color es proporcional

a la concentración del Producto
Se obtiene 0 ∆A1 ∆A2 ∆A3 ∆A4 ∆A5

Ensayo de punto final

MÉTODO DE PUNTO FINAL PARA ENZIMAS.

Se ponen en contacto los reactivos (que aportan el

sustrato) y la muestra biológica (que aporta la enzima) y
tras un período de incubación que supere el periodo de
retardo se mide la absorbancia.
Al cabo de un tiempo establecido se detiene la reacción y
se vuelve a medir absorbancia. No es frecuente este tipo
de técnica, pues presenta los inconvenientes de suponer
que la reacción es lineal y la cinética de orden cero, para
que la velocidad no dependa de la concentración de
sustrato, lo que no siempre ocurre.

0 E1 E2 E3 E4 E5 , a tiempo fijo Fundamento en la determinación de enzimas (****)

Se obtiene el valor de ∆A/min

dividiendo el valor de absorbancia
medido por el tiempo de reacción. No
Se obtiene 0 ∆A1 ∆A2 ∆A3 ∆A4 ∆A5 se tiene una visualización del
a tiempos variables desarrollo de la reacción.
Intensidad del color es proporcional a la
concentración del Producto

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 Ensayo cinético
Ensayo en una sola cubeta y registro
continuo de la reacción (absorbancia….).
Producto (mM)
Tiempo (mseg)
Actividad específica (A.E.): Señala la relación entre
las Unidades y las proteínas totales (mg).
A.E.= U/mg =
Es un criterio de pureza de la muestra enzimática
MÉTODO CINÉTICO PARA ENZIMAS.
Consiste en medir la absorbancia de forma continua en el
tiempo (gracias a la utilización de instrumentos
adecuados: espectrofotómetros). Esta técnica permite
comprobar realmente que se está en la zona ideal para la
determinación. Si se detectan desvíos de la linealidad se
pueden despreciar los intervalos de medidas de
absorbancia (A) fuera de la linealidad. Los “kit”
comerciales normalmente indican intervalos de tiempo y
concentraciones adecuadas para cumplir con las
restricciones.
µmoles/min
mg de proteína
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 La Actividad total es similar (Nº de esferas rojas)

Mayor actividad específica

(Nº esferas rojas / Nº total de esferas)

Conceptos: “Actividad” versus Actividad específica

Factores que afectan la actividad enzimática

•pH y composición del tampón (pH óptimo y buffer reactante)

•Concentración del o los sustratos (….orden cero)

•Temperatura (temperatura óptima)

•Concentración de inhibidores y activadores (condiciones de ensayo)

•Cofactores
Actividad

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 Enzimas como reactivos en el análisis de metabolitos.

La determinación cuantitativa de D-glucosa se

realiza utilizando glucosa oxidasa (obtenida de
Aspergillus niger) y peroxidasa de rábano.

glucosa oxidasa
D-glucosa + H2O + 02 → H2O2+ D-glucuronolactona

peroxidasa
H2O2 + colorante reducido → colorante oxidado + H2O + 1/2 O2

Conceptos: Ensayos acoplados, ensayo de 1er orden, enzimas auxiliares

Condiciones de ensayo (componentes, T y pH óptimos)
Ensayos “comparables” ; ensayo de referencia (lab. de referencia).

MD
Oxalacetato + NADH + H+ L-Malato + NAD+

Conceptos: Cofactores y coenzimas

Fluoróforos
Sustratos artificiales

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 CLASIFICACION GENERAL DE ENZIMAS PLASMATICAS

Enzimas plasma específicas (funcionales): Se encuentran normalmente en

circulación ya que es allí donde desempeñan su función. Normalmente sintetizadas
en el hígado y constantemente liberadas al torrente sanguíneo. Tienen importancia
clínica cuando sus niveles séricos disminuyen, permitiendo en algunos casos
determinar función hepática.
Ej.: - Lipoproteínlipasa
- Enzimas involucradas en la coagulación

Enzimas no plasmáticas (no funcionales): Presentan normalmente niveles

séricos muy inferiores al que existe en los tejidos (hasta 103 -106 veces). Por tanto,
aumentos séricos de estas enzimas se asocian generalmente a daño tisular.
Pueden dar especificidad tisular para aquellos tejidos más ricos en ellas
(isoenzimas, isoformas).
Ej.: -a) Enzimas de secreción (exocrinas: amilasa;
fosfatasas ácida y alcalina)
-b) Enzimas del metabolismo intermediario (Intracelulares:
LDH, CK)

Alteraciones de la concentración enzimática en suero.

1. Aumentos de la actividad enzimática

(a). Incremento patológico de la permeabilidad de membrana

(b). Muerte y destrucción celular

(c). Inducción de la expresión

(d). Proliferación celular

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 Alteraciones de la concentración enzimática en suero.......

2. Disminuciones de la actividad enzimática

(a). Intoxicaciones (apoptosis, necrosis, disfunción celular…*)

(b). Enfermedades crónicas (idem anterior)

(c). Alteraciones del estado nutritivo (principalmente disfunción celular…*)

* En algunos casos también se observan aumentos de actividad enzimática

FACTORES QUE AFECTAN LOS VALORES ENZIMÁTICOS DE REFERENCIA

Edad (diferentes etapas de maduración de órganos)

Fosfatasa alcalina
 135 - 270 UI/l 6 meses - 10 años
 90 - 320 UI/l 10 - 18 años
 4 - 100 UI/l adultos

Género (diferente masa de tejido)

 Creatina quinasa (CK) es mayor en sexo masculino
(masa muscular, conc. Hormonas)

Ejercicio y ambulatorios.....

Raza ......Valores de referencia para CK son más altos en la raza Afro

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TIEMPO DE RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

No existe un ritmo circadiano para la liberación de enzimas, por

tanto esta variable no es importante en la determinación de los
valores de referencia. Pero adquiere importancia en la detección de
condiciones o estados agudos y crónicos o tiempo post evento
patológico.

Ej. en infarto:
CK-MB  6h CK total  18h
AST  24h LDH  48h

Algunas enzimas de interés diagnóstico

Perfil hepático:
Fosfatasa alcalina
Aminotransferasas (AST, ALT)
γ-Glutamil transferasa
5’ Nucleotidasa

Perfil cardiaco:
Creatina quinasa (CK)
Aspartato aminotransferasa (AST)
Lactate deshidrogenasa (LDH)
Troponinas cardiacas T e I (proteínas estructurales)
Mioglobina (proteína de unión de oxígeno)s
Otras:
Amilasa y lipasa (pancreatitis)
Fosfatasa ácida (carcinoma prostático)

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 Fosfatasa alcalina, EC 3.1.3.1
El Comité de Enzimas (EC) de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular
clasifica a las enzimas en grupos, dependiendo del tipo de reacción ...

O O
R O P O- + H2O R OH + HO P O-
O- O-

Hidroliza con baja especificidad fosfomonoésteres, a un pH alto

(de ahí el nombre). No se conoce con certeza cuál es su función
metabólica. Aparece en gran cantidad de tejidos.

DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE FOSFATASA ALCALINA (FAL o ALP)

ALP
p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenóxido + H2PO4-
(p-NPP) pH 10,3 (p-nitrofenolato, p-NP)
(Tampon AMP)

AMP: 2-amino-2-metil-1-propanol

Incoloro Amarillo, λmax 404 - 415 nm

Conceptos: Sustratos artificiales, tampón sustrato...

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La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas.:

Las isoenzimas FALs son codificadas por diferentes

genes estructurales (isoenzimas):

1. Tejido inespecífica (isoformas: ósea, hepática y renal)

2. Intestinal

3. Placenta

4. Células germinales (isoformas: testis, timo y pulmón HMW).

Conceptos: Isoenzimas e isoformas...

Actividad plasmática de FAL como una función de la edad y sexo.

URL = límite superior en adultos del valor de referencia.

El rango normal en adultos es de 44 a 147 UI/L …..

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Los niveles de fosfatasa alcalina superiores a los normales pueden indicar:

•Embarazo (último trimestre)

•Fractura de hueso en recuperación
•Enfermedades hepáticas
•Obstrucción biliar
•Hepatitis
•Enfermedad ósea
•Enfermedad de Paget (ósea)
•Cáncer óseo osteoblástico
•Osteomalacia
•Raquitismo
•Enfermedades del esqueleto
•Anemia
•Leucemia
•Infección de la glándula tiroides
•Hiperparatiroidismo
•Consumo crónico de alcohol

TRANSAMINASAS
Catalizan la interconversión reversible de aminoácidos y cetoácidos.

Glutamato α-cetoácido α -cetoglutarato α -aminoácido

Transaminasas existen para todos los aminoácidos, excepto

para treonina y lisina. Los compuestos más comúnmente
asociados a las reacciones de transaminación como par
donante/aceptor son el glutamato y el α-cetoglutarato.

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 Aminotransferasas (Transaminasas)

Utilizan piridoxal 5´-fosfato (P5´P) como coenzima, normalmente el

suero contiene cantidades adecuadas por lo que no es necesario
coenzima adicional.
Salvo en pacientes con una deficiencia de vitamina B6 o en aquellos
que sufren diálisis renal, los que producirán falsamente valores
séricos disminuidos de aminotransferasas. A menos que P5´P sea
agregado como un reactivo en la determinación.

Su papel es importantísimo en el metabolismo de

aminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:

- Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)

- Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)

Aspartato aminotransferasa, (AST, GOT)

EC 2.6.1.1

COO- COO-
COO- COO- +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH2 CH2
CH2 CH2
COO- COO-
COO - COO-

Aspartato α-Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Aparece en citosol y mitocondrias (2 isoformas) de tejidos

metabólicamente muy activos. Su nivel se eleva en el suero ante
afecciones hepáticas y miocárdicas.

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 Determinación de AST:

AST
L-Aspartato + α-Cetoglutarato L-Glutamato + Oxalacetato

MD
Oxalacetato + NADH + H+ L-Malato + NAD+

Viene en la muestra
AST + MD

L-Aspartato + α-Cetoglutarato + NADH + H+ L-Glutamato + L-Malato + NAD+

MD = malato deshidrogenasa

Conceptos: Etapa limitante de la velocidad total

de reacción y enzimas en exceso.

Alanina aminotransferasa, (ALT, GPT)

EC 2.6.1.2
COO- COO-
COO- COO- +
+ C O H3N CH
H3N CH C O
+ CH2 + CH2
CH3 CH3
CH2 CH2
COO - COO-
Alanina Piruvato
α-Cetoglutarato Glutamato

Enzima citosólica, de elevada concentración en el parénquima

hepático. Se considera casi específica de lesión hepática.

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 Determinación de ALT:

ALT
L-Alanina + α-Cetoglutarato Piruvato + L-Glutamato

LDH
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

Viene en la muestra
ALT + LDH
L-Alanina + α-Cetoglutarato + NADH + H+ L-Glutamato + Lactato + NAD+

Conceptos: Etapa limitante de la velocidad total

de reacción y enzimas en exceso.

¿Cuáles son las causas más frecuentes de su

elevación?
Causas hepáticas Causas extrahepáticas

Consumo excesivo de alcohol Enfermedad celíaca

Medicamentos Miopatías hereditarias o adquiridas

Hepatitis vírica (B y C) Ejercicio intenso

Hígado graso Sarcoidosis
Hepatitis autoinmune Enfermedades de vías biliares
Hemocromatosis Neoplasias con metástasis
Enfermedad de Wilson
Déficit de α1- antitripsina

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 Marcadores cardiacos
Moléculas liberadas en infartos o isquemias celulares miocárdicas

CLASIFICACIÓN
Enzimas Cardiacas enzymes
Creatina quinasa (CK)
Aspartato aminotransferasa (AST)
Lactato deshidrogenasa (LD)

Proteínas estructurales
Troponina cardiaca T (cTnT)
Troponina cardiaca I (cTnI)

Proteínas de unión de oxígenobinding proteins

Mioglobina

Creatina quinasa, (EC 2.7.3.2, CK

o CPK, Creatina fosfoquinasa)
CH3 CH3 O
ATP ADP
N CH2 COOH N CH2 CO O P O-
HN C HN C
NH2 O-
NH2

Creatina Creatin fosfato

La creatina fosfato es una forma de almacenamiento

de enlaces ricos en energía en el tejido muscular. Es
el prototipo de los compuestos conocidos como
fosfágenos.

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 CK es un dímero de 2 subunidades posibles : B y M

De ese modo, se encuentran tres isoenzimas específicas

de tejido:

- Forma MM (Músculo esquelético)

- Forma MB (Músculo miocárdico, músculo esquelético)
- Forma BB (Cerebro, Pulmón, Vejiga)

La isoenzima MB es un marcador precoz de infarto de

miocardio. Niveles muy elevados es de mal pronóstico.

Las isoenzimas se distinguen electroforéticamente y por

métodos inmunológicos. (Western Blot, Elisa, Dot-blot)

LAS TROPONINAs
Troponina, es un complejo proteíco globular de gran tamaño (78,000 Da)

Este complejo proteico formado por tres subunidades:

- troponina T (TnT; 40.000 D), fijadora de tropomiosina.

- troponina I (TnI; 29.000 D), inhibidora de la interacción
actina-miosina.
- troponina C (17.000 D), fijadora de calcio.

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 APARICIÓN Y DESCENSO DE TROPONINA SÉRICA

Troponina-T Troponina- I
cardiaca cardiaca
(cTnT) (cTnI)
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Aumento:* 4-6 hrs 4-6 hrs

Peak: 10-24 hrs 10-24 hrs

Retorno a normal: 10-15 days 5 days

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*Intervalo: 3 - 8 horas; no es previo a CK-MB

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