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11 Enzimología Diagnóstica

Alan H. B. Wu

Las enzimas desempeñan un papel vital en la catalización de las reacciones bioquímicas necesarias
para el crecimiento humano normal, la maduración y la reproducción. La enzimología diagnóstica
implica la medición de enzimas en fluidos corporales para el diagnóstico de la enfermedad. En la
mayoría de los casos, los niveles séricos o sanguíneos son los más útiles, aunque a veces son
importantes los niveles de orina, cerebroespinal y líquido extracelular.

Este capítulo se centra en los aspectos analíticos y la importancia clínica de las enzimas
importantes que se miden con fines de diagnóstico. El mayor énfasis se pone en el uso de estas
enzimas para el diagnóstico de cáncer y de enfermedades que afectan al hígado, el miocardio, el
músculo esquelético, el páncreas, la próstata y el hueso. En el caso del infarto de miocardio,
también se discuten los marcadores que no son enzimas, como la mioglobina y la troponina.

CONCEPTOS BÁSICOS PARA LA ENZIMOLOGÍA DE DIAGNÓSTICO

Rol patológico de las enzimas en la sangre

La mayoría de las enzimas que se utilizan con fines de diagnóstico no tienen un papel fisiológico
directo en la sangre. Su presencia en circunstancias normales es el resultado del envejecimiento
natural y la renovación de las células. Las enzimas liberadas en la sangre normalmente se eliminan
de la circulación mediante el metabolismo dentro del sistema reticuloendotelial, aunque algunas
son eliminadas por los riñones (por ejemplo, amilasa). El nivel normal de actividad de estas
enzimas en el suero es una función de la tasa de liberación y eliminación. Las vidas medias de estas
enzimas varían mucho, desde aproximadamente 2 horas para la isoenzima BB de la creatina
quinasa hasta 170 horas para la fosfatasa alcalina placentaria.

Los niveles altos de enzimas en la sangre pueden indicar un aumento en el recambio celular y la
necrosis tisular causada por la enfermedad. Esto fue demostrado por primera vez por LaDue et al.
en 1954, cuando observaron que la actividad aspartato aminotransferasa aumentó después de un
infarto agudo de miocardio (1). En estudios posteriores que utilizaron lesión hepática inducida por
tetracloruro de carbono en ratas, estos investigadores demostraron que los altos niveles de
enzimas en suero eran causados por fugas de los hepatocitos dañados. Una vez liberadas de las
células, las enzimas pueden pasar directamente a la sangre (si el tejido es altamente vascular y no
hay obstrucción al flujo) o llegar al torrente sanguíneo a través de un drenaje linfático más lento.
El origen subcelular juega un papel en la facilidad con que aparecerá una enzima en la sangre. Las
enzimas citoplásmicas solubles pasan a través de un conjunto de membranas, mientras que las
enzimas mitocondriales también deben pasar a través de un segundo conjunto de membranas.

Una causa igualmente importante y ampliamente ignorada de los altos niveles de enzimas en la
sangre es la síntesis de nuevas enzimas en los tejidos que se produce en respuesta a la
enfermedad, la inducción por diversos fármacos y la carcinogénesis (2). Por ejemplo, en la
enfermedad hepática obstructiva, el fosfato alcalino hepático se incrementa en gran medida
debido al aumento de la síntesis debido a la presión intracanalicular anormal. El fenobarbital y
varias otras drogas inducen la producción de enzimas microsómicas que conducen a una síntesis
aumentada de y-glutamiltransferasa. Además, las enzimas normalmente ausentes en el suero
pueden aparecer como resultado de un proceso neoplásico.

Factores en el desarrollo del análisis enzimático


CINÉTICA ENZIMÁTICA Y CONCENTRACIÓN DE SUBESTACIONES

Las enzimas (E) son catalizadores biológicos que se combinan con sustratos (S) para formar
complejos intermedios (ES) que conducen a la formación del producto (P) y a la restauración de la
enzima original (3). Las reacciones que implican un sustrato exhiben la siguiente cinética:

S + E → [ES] → P + E
La amilasa y la lipasa son ejemplos de enzimas de este esquema. Pero la mayoría de las otras
enzimas catalizan reacciones más complejas en las que hay dos o más sustratos que forman
productos múltiples.

La velocidad de reacción es una función de varios factores, que incluyen la concentración de


sustrato y enzima, la temperatura, el pH y la presencia de cofactores, coenzimas, activadores e
inhibidores. Las ecuaciones de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas fueron
desarrolladas por Michaelis y Menten en 1993 después de la observación empírica de que la
velocidad de reacción es proporcional a la concentración del sustrato a valores relativamente
bajos (3). A altas concentraciones, la velocidad de reacción se maximiza. Este comportamiento se
muestra en la Figura 11.1. En la región donde la velocidad de reacción es directamente
proporcional a la concentración del sustrato, la reacción se denomina de primer orden con
respecto al sustrato. A una alta concentración de sustrato, y la reacción se denomina orden cero
con respecto al sustrato. La constante de Michaelis-Menten, Km, se define como la concentración
de sustrato que corresponde a la mitad de la velocidad de reacción máxima.

En enzimología de diagnóstico, el objetivo es la medición de la actividad o concentración de la


propia enzima. Por lo tanto, las condiciones de prueba se eligen de modo que la velocidad de
reacción dependerá únicamente de la cantidad de enzima presente en la muestra a medir. La
concentración de sustrato debe estar en la región de orden cero, y todos los demás factores que
influyen en la velocidad de reacción deben ser optimizados y controlados.

SELECCIÓN DE OTRAS CONDICIONES DE REACCIÓN

Se deben considerar muchos parámetros al desarrollar una formulación de reactivo para medir
enzimas. La mayoría de las enzimas funcionan de manera óptima dentro de un estrecho rango de
pH. Los valores superiores o inferiores a este rango pueden inactivar las enzimas alterando la
estructura terciaria del sitio activo o desnaturalizando la proteína. El pH también puede influir en
la dirección de la reacción, tal como para lactato deshidrogenasa, para la cual la conversión de
lactasa en piruvato se favorece a pH alcalino, mientras que la reacción inversa se favorece a pH
fisiológico. El amortiguador específico elegido para mantener el pH también puede ser importante,
ya que algunos tampones participan en la reacción y aumentan su velocidad. Por ejemplo, para
fosfatasa alcalina, el reactivo 2-amino-2-metil-1-propanol actúa como un amortiguador y como un
aceptor de grupo fosfato.
Cofactores y coenzimas no presentes en la muestra o suministrados por el amortiguador también
deben agregarse a la mezcla de reacción para asegurar una actividad óptima. El fosfato de
piridoxal es una coenzima necesaria tanto para el aspartato como para la alanina
aminotransferasa, mientras que el magnesio es un cofactor necesario para la fosfatasa alcalina.
Otras sustancias que se necesitan para mejorar la actividad se llaman activadores y también se
agregan a la mezcla de reacción. Por ejemplo, la N-acetil cisteína se usa para activar la creatina
quinasa.

La temperatura utilizada para la reacción debe controlarse estrictamente porque las velocidades
de reacción generalmente se duplican con cada 10°C que aumenta la temperatura. Las altas
temperaturas pueden desnaturalizar muchas proteínas y enzimas. Por convención, la mayoría de
las enzimas se analizan a 37°C. Aunque esta elección es algo arbitraria, tener una temperatura
estándar facilita la comparación de los resultados de la prueba de un laboratorio a otro.

INHIBIDORES

Los inhibidores son sustancias que pueden disminuir la tasa de reacción catalizada por enzimas.
Ellos interactúan con la enzima de varias maneras. Los inhibidores competitivos compiten con el
sustrato por la unión al sitio activo de la enzima. El efecto de un inhibidor competitivo es
aumentar Km sin afectar la velocidad máxima, Vmax. El aumento de la concentración de sustrato
contrarresta el efecto de un inhibidor competitivo. Los inhibidores no competitivos disminuyen la
velocidad de reacción al interactuar con la enzima sin afectar directamente la unión enzima-
sustrato. Vmax se reduce sin efecto en Km. En este caso, el efecto no puede contrarrestarse
aumentando la concentración de sustrato. Los inhibidores no competitivos interactúan con el
complejo enzima-sustrato, lo que impide la formación del producto. Tanto Vmax como Km están
alterados.

Los inhibidores juegan un papel importante en la enzimología diagnóstica. Los inhibidores se usan
para eliminar selectivamente la actividad de isoenzimas específicas, proporcionando un medio
para detectar otras isoenzimas. El tartrato, por ejemplo, se usa para inhibir algunas isoenzimas de
la fosfatasa ácida, mientras que la dibucaína se usa para detectar la presencia de variantes
genéricas de la colinesterasa sérica.

Procedimientos de análisis enzimático

Las mediciones de enzimas han usado tradicionalmente ensayos cinéticos para determinar la
actividad. Sin embargo, se han desarrollado nuevos análisis que miden las concentraciones de
proteína (masa). Ambos tipos de análisis se discuten en esta sección.

ANÁLISIS CINÉTICOS DE UN SOLO REACTIVO

La Figura 11.2 ilustra una reacción típica catalizada por enzimas para un análisis cinético de
reactivo único. La reacción se controla a una longitud de onda a la que el producto de reacción
absorbe la luz. La fase de retraso inicial es causada por el tiempo necesario para que la enzima se
active por completo mediante cofactores y coenzimas agregadas a un reactivo. Generalmente, es
necesario un retraso de 30 a 120 segundos antes de que las lecturas de absorbancia tengan
sentido. Después de la fase de latencia, la reacción comienza la fase lineal, caracterizada por una
velocidad constante de cambio en ausencia. La reacción se controla tomando lecturas a intervalos
regulares durante 2 a 5 minutos después de la fase de retraso.

Si la reacción tiene lugar lo suficiente, la concentración de sustrato se vuelve limitante y la


reacción entra en una fase de primer orden. Cuando el sustrato se agota, la reacción se detiene.
Las muestras con una actividad enzimática muy alta pueden agotar el sustrato incluso antes de
que se tome la primera lectura analítica. En este caso, se pueden obtener resultados falsamente
bajos (figura 11.3A), y la muestra puede parecer la misma que la que tiene poca o ninguna
actividad enzimática (figura 11.3B). Los analizadores de enzimas deben ser capaces de detectar
muestras con alta actividad enzimática. Como se muestra en la figura 11.3, se puede usar una gran
diferencia en la absorbancia entre el punto de tiempo cero y la primera lectura para detectar la
presencia de una muestra que ha agotado el sustrato. Cuando ha ocurrido, la actividad de la
enzima en estas muestras se obtiene por dilución.

INICIO DE ENSAYOS DE ACTIVIDAD DE REACTIVOS

Ciertos diseños de ensayos enzimáticos requieren la adición secuencial de dos reactivos. El


primero incluye la muestra de suero, que contiene todos los reactivos excepto uno de los
sustratos. La incubación de estos reactivos permite tanto la activación de la enzima como
reacciones secundarias independientes del sustrato que, cuando están presentes, contribuyen
erróneamente a la actividad aparente de la enzima. La reacción analítica de interés se
desencadena por la adición del sustrato (a veces denominado "reactivo inicial") después de un
período de incubación apropiado, por lo general de 5 minutos. La figura 11.4 ilustra la velocidad de
reacción en función del perfil de tiempo para un ensayo de reactivo de inicio. El análisis de la
alanina aminotransferasa (ALT), por ejemplo, mejora con el uso del sistema reactivo de inicio,
porque las altas concentraciones de piruvato (que pueden aparecer en algunas muestras de suero)
producirán un consumo aparente de NADH que no depende de la actividad ALT. Tenga en cuenta
que en la figura 11.4, la absorbancia se muestra disminuyendo a medida que avanza la reacción, lo
que indica que se está siguiendo el consumo de velocidad de un reactivo.

CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La actividad de la enzima puede expresarse en unidades por litro o nanokatales por litro. Una
unidad internacional se define como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la conversión
de un micromol de sustrato por minuto. La unidad SI correspondiente es la cantidad de enzima
que catalizará la conversión de un nanomol de sustrato por segundo (nanokatales). Debido a que
la ley de Beer establece que la concentración es proporcional a la absorbancia, la actividad de la
enzima puede determinarse a partir del cambio en la absorbancia por unidad de tiempo. La tasa
de cambio en la absorbancia se multiplica por factores para tener en cuenta la absortividad molar
del producto o sustrato que se está monitoreando, la longitud del camino celular y la dilución de la
muestra por los reactivos en la mezcla de reacción:
∆A/ min × TV
Actividad (U/litro) = ∈ ×b × SV
× 1000

donde ∆A/min es el cambio en absorbancia versus el tiempo,

TV = volumen total (en μl),

SV = volumen de muestra (en μl),

∈ = absorción micromolar (en litros / milimol * cm),

Y b = longitud de la trayectoria (en cm).

Como ejemplo, si una enzima produce NADH (absorbancia milimolar = 6.3) con un ΔA / min de
0.046, y si los volúmenes total y de muestra son 300 y 5 μl, respectivamente, y se usa una longitud
de trayectoria de 1 cm, la actividad (en U / L) se calcula como:
0.046 × 300
Actividad = 6.3 × 1 × 5
× 1000 (U/litro)

MEDICIONES DE MASA

El desarrollo de inmunoensayos ha permitido la medición de la concentración de la enzima en


lugar de la actividad. Estos ensayos son particularmente útiles para el análisis de isoenzimas, ya
que los antisueros pueden dirigirse hacia isoenzimas, isoformas o subunidades específicas. Los
estudios han demostrado que para la detección de enfermedades, las enzimas no necesitan estar
presentes en forma activa en la sangre, y las mediciones de masa son equivalentes a los ensayos
de actividad enzimática en la eficacia del diagnóstico y en ocasiones se prefieren. La concentración
de la enzima se determina a partir de una curva de calibración. Las mediciones de masa también
se usan para medir la concentración de marcadores proteicos (por ejemplo, mioglobina) que no
poseen actividades enzimáticas. Los inmunoensayos específicos para enzimas se discuten con más
detalle bajo ejemplos específicos.

ENFERMEDADES DEL HÍGADO


Las enzimas alanina y aspartato aminotransferasa, fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa, y-
glutamiltransferasa y 5'-nucleotidasa se miden comúnmente para la evaluación de la función
hepática. Los primeros cuatro de estos se incluyen típicamente en perfiles de química integral.
Ninguno de estos marcadores es específico para un solo trastorno hepático. Esta sección cubre la
disfunción hepática, describe enzimas hepáticas individuales y su medición de laboratorio, y
explica cómo los patrones de datos de enzimas hepáticas se pueden utilizar para ayudar en el
diagnóstico de enfermedades hepáticas.

Lesión Hepatocelular Aguda


HEPATITIS VIRAL

La hepatitis viral aguda es una causa común de lesión hepatocelular. El aislamiento y la


caracterización de agentes virales específicos en los últimos años, junto con el desarrollo de
marcadores serológicos específicos, ha resultado en el diagnóstico definitivo de estas infecciones.
Una descripción más completa de la virología, etiología, epidemiología y serología relevante de los
tipos de hepatitis A, B, C y D se puede encontrar en el Capítulo 54. También se describen en esta
sección las otras causas virales de hepatitis como Epstein-Barr virus, herpesvirus, citomegalovirus
y coxsackieviruses necrosis. Las características de la inflamación hepática viral aguda incluyen la
infiltración de monocitos y la hiperplasia de hepatocitos parenquimatosos, a menudo descrita
como degeneración de globo. Hay destrucción hepatocelular activa y daño celular, lo que lleva a
un grado variable de obstrucción biliar. Sin embargo, el hígado tiene una capacidad de reserva
considerable para el metabolismo de la bilirrubina, y los pacientes a menudo solo presentan una
leve ictericia. La fase aguda de la enfermedad generalmente dura de 3 a 6 meses. Los marcadores
enzimáticos que son más útiles para la necrosis hepatocelular aguda son la aspartato
aminotransferasa (AST) y la ALT.

INSUFICIENCIA HEPÁTICA AGUDA

La insuficiencia hepática aguda se caracteriza por una necrosis hepatocelular extensa y una
mortalidad muy alta; tiene una serie de etiologías. Una es la progresión a la hepatitis fulminante,
que se ve con mayor frecuencia con la hepatitis B. La hepatitis tóxica también es una causa
importante. La Tabla 11.1 enumera varias sustancias que pueden producir insuficiencia hepática
aguda. Las manifestaciones clínicas incluyen disfunciones metabólicas como encefalopatía y
desequilibrio de agua y electrolitos, anomalías de la coagulación, hipoglucemia, insuficiencia
respiratoria e insuficiencia renal. Al igual que con la enfermedad hepatocelular, la insuficiencia
hepática aguda se caracteriza por grandes aumentos de AST y ALT en suero.

Enfermedades hepáticas colestásicas

La colestasis es la supresión del flujo biliar y puede ser de origen extrahepático o intrahepático. La
delimitación entre estos tipos no es posible únicamente sobre la base de las pruebas de enzimas,
aunque ciertos patrones de actividades enzimáticas favorecen una forma sobre la otra.
Morfológicamente, la presencia de pigmentos biliares en los hepatocitos define esta condición.
Los niveles séricos de enzimas hepáticas y bilirrubina son anormales en la colestasis. Sin embargo,
debido a la capacidad de reserva del hígado para el metabolismo y la excreción, estas enzimas y
sales aumentan en el suero solo cuando se ha deteriorado más del 80% de la capacidad funcional
hepatocelular. El capítulo 8 describe el papel de la bilirrubina conjugada y no conjugada en la
enfermedad colestásica. Los marcadores enzimáticos de obstrucción incluyen fosfatasa alcalina, y-
glutamiltransferasa, 5'-nucleotidasa y leucina aminopeptidasa.

OBSTRUCCIÓN INTRAHEPATICA

La colestasis intrahepática a menudo es el resultado de cirrosis o hepatitis, pero la administración


de ciertos medicamentos como clorpromazina, estrógenos y esteroides anabólicos también puede
inducir colestasis. El mecanismo puede incluir la precipitación de sales biliares que dificulta el flujo
de la bilis. La ictericia idiopática intrahepática familiar también se observa en el tercer trimestre de
algunos embarazos sin complicaciones. Esta condición es relativamente benigna pero puede
reaparecer en futuros embarazos. Otros trastornos congénitos asociados con la obstrucción
intrahepática incluyen el síndrome de Dubin-Johnson y el síndrome de Rotor.
OBSTRUCCIÓN EXTRAHEPATICA

La colestasis extrahepática suele ser el resultado de una obstrucción mecánica del conducto biliar
común o del conducto hepático. Las etiologías comunes de este trastorno incluyen colelitiasis y
carcinoma de la punta del páncreas, papila de Vater o conducto biliar común. Estos procesos
conducen a la dilatación del árbol ductal inmediatamente arriba de la obstrucción. Los procesos
inflamatorios es la colangitis esclerosante también puede producir colestasis extrahepática.

Enfermedades crónicas del hígado


HEPATITIS CRÓNICA

La hepatitis crónica es una enfermedad con etiologías diversas, que incluyen causas virales,
autoinmunes y lupoide. En causas virales, alrededor del 5 al 10% de los pacientes con hepatitis B y
hasta el 50% de los pacientes con hepatitis C desarrollan esta enfermedad recurrente. La forma
activa se caracteriza por la infiltración de monocitos y la necrosis hepática. La hepatitis activa
crónica comúnmente conduce a la alteración de la arquitectura lobular y la fibrosis y puede
progresar a cirrosis hepática. En contraste, la hepatitis persistente crónica es un trastorno más
leve que raramente progresa a cirrosis y fibrosis. En contraste, la hepatitis persistente crónica es
un trastorno más leve que raramente progresa a cirrosis y fibrosis. Los resultados de las enzimas
hepáticas tienden a ser más elevados en la forma activa; sin embargo, la diferenciación se logra
mejor al realizar una biopsia hepática.

CIRROSIS

La enfermedad hepática crónica que conduce a un aumento de la fibrosis difusa y la progresión


hacia una arquitectura nodular define la cirrosis. Algunos de los factores etiológicos para la cirrosis
son el daño hepático secundario al consumo de drogas, las infecciones de hepatitis crónica, la
obstrucción biliar y las enfermedades metabólicas (como la enfermedad de Wilson, la
hemocromatosis y la deficiencia de a1-antitripsina). La cirrosis alcohólica es muy prevalente en los
Estados Unidos y Europa occidental, mientras que la cirrosis por infecciones crónicas activas de
hepatitis B es más común en Asia y África. Los niveles de enzimas hepáticas en la cirrosis son
variables y pueden ser normales durante las etapas terminales de la enfermedad.

La cirrosis biliar primaria se caracteriza por la alteración de la excreción biliar y se ha relacionado


con un proceso autoinmune. Afecta a las mujeres con más frecuencia que a los hombres. La
inflamación y la destrucción de los conductos biliares se observan en este trastorno. Se esperan
elevaciones en la fosfatasa alcalina y aminotransferasas junto con altos títulos de anticuerpos
antimitocondriales.

CÁNCER DE HÍGADO

Los carcinomas primarios hepatocelulares y colangiocelulares a menudo se presentan en pacientes


con infecciones de hepatitis B de larga duración y cirrosis hepática. El diagnóstico es ayudado por
tomografía computarizada, ultrasonido, escaneos nucleares y niveles de a-fetoproteína en la
sangre. El cáncer de hígado primario es especialmente prevalente entre los machos orientales y
afroamericanos. La enfermedad hepática metastásica es muy común en los Estados Unidos,
particularmente de los tumores que se originan en el colon, pulmón, seno y piel. Los niveles de
enzimas en el cáncer primario y secundario generalmente son elevados; esto es causado por la
destrucción de los tejidos normales circundantes y la obstrucción de la arquitectura normal por
estos tumores "ocupantes de espacio".

Enzimas útiles en la enfermedad hepática


FOSFATASA ALCALINA (EC 3.1.3.1)

Las fosfatasas son una colección de sialoproteínas localizadas principalmente dentro de la


membrana celular. Funcionan para transportar fosfato inorgánico de moléculas donadoras a
receptoras. Las fosfatasas con actividad catalítica a un pH de 10.0 y superior componen la
colección de fosfatasa alcalina (ALP, ácido ortofosfórico monoester fosfohidrolasa).

Medida de la actividad total de ALP

Debido a la naturaleza heterogénea de la enzima, y debido a que no se ha identificado un único


sustrato fisiológico, todos los métodos analíticos para ALP utilizan sustrato sintético. El sustrato
más común es el p-nitrofenilfosfato (p-NPP), que se convierte en p-nitrofenóxido (p-NP) y fosfato
inorgánico:

ALP
p-NPP + H2O → PO4-3 + p- nitrofenóxido

Como la p-NPP es incolora, la reacción se controla mediante el aumento de la absorbancia de p-NP


a 404 nm. El pH de la reacción se controla a 10,3 mediante tampón 2-amino-2-metil-1-propanol
(AMP), que también actúa como un aceptor de fosfato para facilitar la acción fosfatasa de la
enzima. Una sal de magnesio también es parte de la enzima. En otros procedimientos, como esa
parte de la formulación de reactivo y actúa como un activador de la enzima. En otros
procedimientos, como el recomendado por la Federación Internacional de Química Clínica, se
agregan iones de zinc junto con N-hidroxi-EDTA para mantener la proporción precisa de Mg2 + /
Zn2+ necesaria para una activación óptima. La absortividad milimolar de p-NP es 18.75 litros /
mmol-cm.

El rango de referencia para la fosfatasa alcalina depende de la edad y se relaciona con las
diferentes etapas del crecimiento óseo y la desmineralización durante la vida. La figura 11.5 ilustra
esta dependencia. Los niños tienen rangos de referencia más altos que los adultos,
particularmente durante la adolescencia. Las poblaciones más viejas tienen un rango de referencia
de fosfatasa alcalina creciente, lo que refleja un aumento en la incidencia de osteoporosis en esta
población.

Isoenzimas ALP

La fosfatasa alcalina está ampliamente distribuida por los tejidos del cuerpo. Entre los que tienen
la actividad relativa más alta están las glándulas suprarrenales, la placenta, el tracto
gastrointestinal, los huesos, los riñones y el hígado. En adultos normales no embarazados, sin
embargo, la mayor parte de la ALP sérica se origina en el hueso y el hígado. Para pacientes con
altos niveles de ALP, la medición de las isoenzimas de fosfatasa alcalina es útil para diferenciar
entre las fuentes de los huesos y el hígado. Sin embargo, debido a las dificultades técnicas con la
electroforesis zonal y el uso creciente de marcadores enzimáticos más específicos para la
obstrucción hepática, como la y-glutamiltransferasa, la necesidad clínica de isoenzimas ALP es
rara, y la mayoría de los laboratorios no ofrecen fraccionamiento rutinario.

Los métodos analíticos para las isoenzimas ALP incluyen la inhibición química selectiva, como con
la fenilalanina, la inactivación por calor, la electroforesis y el enfoque isoeléctrico. La incubación de
suero a 56 ° C durante 15 minutos puede proporcionar una estimación del contenido de isoenzima
ALP. La isoenzima placentaria y las formas placentarias como la isoenzima Regan son muy estables
y permanecerán activas después de la incubación a esta temperatura. La fracción hepática
retendrá del 25 al 50% de la actividad residual, mientras que la fracción ósea será en gran parte
inactiva después de esta incubación.

La electroforesis zonal ha sido ampliamente estudiada y producirá bandas para las fracciones (a)
placentaria, (b) intestinal y (c) ósea, hepática y renal. Hay diferentes grados de superposición entre
las isoenzimas ALP de los tejidos del último grupo, dependiendo del medio de soporte de
electroforesis. Las isoenzimas ALP del hueso, el hígado y el riñón se originan a partir de una sola
expresión génica que ha sido modificada post-sintéticamente. Es posible mejorar la resolución
entre las fracciones ósea y hepática tratando cualquiera de los soportes de electroforesis con
lectina de germen de trigo o tratando las muestras con neuraminidasa. Los estudios
electroforéticos también han demostrado una nueva fracción de isoenzima migrante anódica a la
fracción hepática. La isoenzima, denominada "¨a" o fracción hepática rápida, se observa en
trastornos hepatobiliares y puede ser un marcador útil para el cáncer de hígado.

Es posible realizar una evaluación más definitiva de las isoenzimas ALP con isoelectroenfoque
(IEP). La figura 11.6 ilustra un ensayo de isoenzima de fosfatasa alcalina disponible
comercialmente por IEF. Se pueden identificar al menos 12 bandas distintas de ALP con pl’s que
van desde 3.01 para la última fracción hepática hasta 4.86 para la ALP intestinal. Antes del
desarrollo de este ensayo, el uso rutinario del enfoque isoeléctrico se ha limitado en gran medida
a las aplicaciones de investigación debido a la complejidad del procedimiento analítico.

y-GLUTAMILTRANSFERASA (EC 2.3.2.2)

La y-glutamiltransferasa (GGT, y-glutamil-péptido: aminoácido y-glutamiltransferasa) cataliza la


transferencia de grupos y-glutamil entre las moléculas donante y aceptante. GGT se encuentra en
la membrana celular de casi todas las células y tejidos humanos, y funciona para transportar
aminoácidos a la célula. GGT tiene dos subunidades: una fracción hidrófila ligera, donde se
encuentra el sitio activo, y un sitio hidrofóbico pesado, que ancla la enzima a la membrana. No
tiene isoenzimas como se define por formas separadas codificadas genéticamente, pero hay
modificaciones postraduccionales que se han identificado y medido por electroforesis. La utilidad
clínica de estas isoformas, sin embargo, no está establecida (4).

La mayoría de los métodos analíticos comerciales para GGT utilizan uno de los dos substratos
sintéticos: y-L-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida. El sustrato carboxi es actualmente preferido
debido a una mayor solubilidad y debido a que la hidrólisis del sustrato no ocurre
espontáneamente. Sin embargo, el sustrato no sustituido más antiguo se usa más ampliamente.
Las reacciones de ambos se muestran a continuación:
GGT
y-glutamil-p-nitroanilina + glicilglicina →
y-glutamilglicilglicina + p-nitroanilina
GGT
y-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina→
p-nitroanilina + 5 amino-2-nitrobenzoato
Cualquiera de las reacciones puede controlarse siguiendo la absorbancia creciente del producto
respectivo a 405 nm. Tris y glicilglicina se usan como tampones para mantener un pH de 8.0. Los
iones de magnesio se agregan cuando se usa γ-nitroanilina para mejorar la solubilidad. Las
absorbancias milimolares son 9.9 litros / mmol * cm para p-nitroanilina a 405 nm y 7.9 litros /
mmol * cm para 5-amino-2-nitrobenzoato a 410 nm. Los rangos de referencia a 37 ° C son de 9 a
50 para los hombres y de 8 a 40 U / litro para las mujeres. Aunque la mayor parte de la enzima se
origina en el hígado, se libera una pequeña cantidad de GGT de la próstata, lo que puede explicar
por qué los hombres tienen valores ligeramente más altos que las mujeres.

5'-NUCLEOTIDASA (EC 3.1.3.5)

La 5'-nucleotidasa (5'NT, 5'-ribonucleótido fosfohidrolasa) es una enzima citosólica unida a la


membrana que hidroliza los ésteres de 5'-fosfato de los nucleótidos. Aunque la 5'NT se encuentra
en todo el cuerpo, el aumento de la actividad en el suero refleja enfermedades hepatobiliares. Los
métodos para el análisis 5'NT implican el uso de adenosina-5'-monofosfato como sustrato:

5’NT
Adenosina-5'-monofosfato+ H2O →

Adenosina + fosfato

La reacción se controla midiendo el fosfato, usando métodos convencionales. Debido a que el


sustrato también se hidroliza mediante fosfatasa alcalina en la muestra de suero, la actividad total
observada es la suma de las actividades 5'-NT y ALP. La reacción se repite con la adición de iones
de níquel, que inhiben selectivamente 5'NT, midiendo así solo la actividad de ALP. Este número se
resta del total para dar una medida de 5'NT solo. Otros iones inorgánicos usados en la mezcla de
reacción son manganeso, para activar 5'NT y cobre, para acelerar el desarrollo del color.

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (EC 2.6.1.1) Y ALENINA AMINOTRANSFERASA (EC 2.6.1.2)

Aunque la alanina aminotransferasa (ALT, L-alanina: 2oxoglutarato aminotransferasa) se


encuentra en una variedad de tejidos humanos, la medición de ALT es clínicamente más útil en la
evaluación de enfermedades hepáticas. ALT se encuentra en el citoplasma y solo se encuentra una
isoenzima en el suero. Las interpretaciones de los niveles de ALT en estos trastornos generalmente
se realizan junto con los niveles de aspartato aminotransferasa (AST, L. aspartato: 2oxoglutarate
aminotransferasa). A diferencia de ALT, sin embargo, AST también es útil en la evaluación de
infarto agudo de miocardio y enfermedades del músculo esquelético. La AST tiene isoenzimas
citosólicas y mitocondriales que aparecen en el suero.

Mediciones analíticas

La alanina aminotransferasa cataliza la transferencia del grupo amino de alanina a a-cetoglutarato


para formar piruvato y L-glutamato. La AST cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato
al a-cetoglutarato para formar malato. Dado que ninguno de los reactivos o productos de
cualquiera de estas reacciones absorben en la región ultravioleta o visible del espectro, deben
estar acoplados a reacciones indicadoras para el análisis. ALT requiere lactato deshidrogenasa
(LDJ), mientras que AST requiere malato deshidrogenasa (MDH):

ALT
L-alanina + a-oxoglutarato →
piruvato + L-glutamato
LDH
piruvato + NADH → lactato + NAD +
LDH
L-aspartato + a-oxoglutarato →
oxaloacetato + L-glutamato
MDH
oxaloacetato + NADH → L-malato + NAD +
Las reacciones se controlan siguiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm cuando se
consume NADH en la reacción. Se necesita piridoxal-5'.fosfato (P5'P) como coenzima para las
reacciones ALT y AST. Normalmente, el suero contiene cantidades adecuadas de P5'P y no es
necesaria una coenzima adicional. Sin embargo, los pacientes con deficiencia de vitamina B6 o
sometidos a diálisis renal tienen una concentración de P5'P disminuida, lo que producirá niveles de
aminotransferasa sérica falsamente bajos a menos que la concentración de P5'P, que producirá
niveles de aminotransferasa sérica falsamente bajos a menos que P5'P se agregue a la formulación
del reactivo.

Rangos de referencia

El rango de referencia adulto para AST y ALT es de aproximadamente 10 a 40 U/litro cuando se


mide a 37°C. Aunque los hombres tienen valores ligeramente más altos que las mujeres, la
mayoría de los laboratorios utilizan un único rango para ambos sexos.

Isoenzimas de Aspartato Aminotransferasa

La principal actividad de AST en el suero se debe a la isoenzima citosólica. Los estudios de


pacientes con infarto agudo de miocardio han demostrado que la AST mitocondrial (mAST) se
libera más lentamente en la circulación que la forma citosólica, presumiblemente porque tiene
que pasar a través de dos juegos de membranas. La medición de mAST puede ser muy útil en el
diagnóstico del alcoholismo crónico. Aunque no está en uso rutinario en laboratorios clínicos, la
AST mitocondrial puede medirse por electroforesis y técnicas de inmunoprecipitación selectiva.
Patrones de enzimas hepáticas para la interpretación de la enfermedad

A diferencia de algunos trastornos como la pancreatitis aguda y el infarto de miocardio, para los
cuales existen marcadores enzimáticos que se usan principalmente para un trastorno y tienen una
alta eficiencia diagnóstica, no existen marcadores enzimáticos que sean específicos para una
enfermedad hepática individual. Al evaluar estos trastornos, por lo tanto, es apropiado considerar
un panel de marcadores, a veces llamado prueba de función hepática (LFT). A través del uso
común, este término se ha convertido en un grupo de pruebas que generalmente incluye
bilirrubina, AST, ALT. ALP, y algunas veces GGT y 5'NT. Sin embargo, el término es un nombre
inapropiado, porque si bien estas pruebas pueden reflejar diversos procesos de enfermedad en el
hígado, no reflejan la reserva hepática para la síntesis y las funciones metabólicas. La Tabla 11.2
enumera algunos marcadores tanto para la función hepática como para la enfermedad.

ENFERMEDADES DEL HEPÁCULO HEPATOCELULARES VERSUS OBSTRUCTIVAS

Lesión aguda

Los marcadores enzimáticos más útiles de la lesión hepatocelular aguda son ALT y AST. Otros
marcadores, como lactato, glutamato, isocitrato y malatodeshidrogenasas, presentan elevaciones
secundarias a la necrosis hepatocelular, pero no son tan sensibles ni tan específicos como la
combinación de AST y ALT y, por lo tanto, rara vez se utilizan con fines de diagnóstico.

Los niveles absolutos más altos de ALT y AST se observan después de la hepatitis aguda, ya sea
viral o tóxica. Los valores que exceden 1000 U/litro se ven comúnmente durante las primeras fases
de estas enfermedades. En la hepatitis tóxica, como con las sobredosis de paracetamol, los niveles
de ALT y AST aumentan unas pocas horas después de la exposición y permanecen altos durante
varios días o semanas. Desafortunadamente, la extensión de las elevaciones de ALT y AST no
refleja la gravedad de la enfermedad, ni puede correlacionarse con el pronóstico del paciente. En
la hepatitis A aguda, la ALT es uno de los primeros marcadores que se eleva, generalmente de 3 a
4 semanas después de la infección. Los niveles vuelven a la normalidad en 8 a 12 semanas. En la
hepatitis B aguda, la fase de incubación preclínica es más prolongada y la ALT y la AST pueden
permanecer normales durante 2 a 6 meses. En la hepatitis B aguda, ALT y AST vuelven a la
normalidad en 2 a 3 meses, y se observa un curso similar en la hepatitis C. En la hepatitis crónica
activa, los niveles de enzimas se elevan de 5 a 10 veces, dependiendo de la etapa de la
enfermedad. Elevaciones similares también se observan en la lesión hepatocelular aguda
secundaria a la mononucleosis. En la enfermedad hepática en etapa terminal, los niveles de
enzimas vuelven a niveles normales o subnormales a medida que los hepatocitos se agotan de
contenido de enzima.

Por el contrario, los niveles de ALP, GGT y 5'NT no son tan marcadamente elevados en estos
trastornos. Los niveles de estas enzimas generalmente no exceden de 2 a 3 veces el límite superior
de lo normal. Por lo tanto, un aumento desproporcionado de ALT y AST en relación con ALP y GGT
favorece el diagnóstico de necrosis hepatocelular en lugar de la obstrucción hepática. La relación
de estas enzimas en la enfermedad hepática hepatocelular se resume en la figura 11.7 (5).
Colestasis

Los mejores marcadores para la colestasis intrahepática y extrahepática son ALP, GGT y 5'NT. Las
elevaciones más grandes (de 4 a 10 veces) de ALP se observan típicamente en obstrucción debido
a cálculos biliares o malignidad, y en la cirrosis biliar. La fuente de ALP en tumores malignos puede
ser la obstrucción de la arquitectura hepática en cánceres hepáticos primarios o secundarios, pero
deben descartarse otras causas de elevaciones de ALP (ver Fosfatasa Alcalina Ósea, más adelante).
La enfermedad hepática obstructiva como causa de las elevaciones de ALP puede confirmarse
midiendo GGT o 5'NT. También se esperan aumentos en estas enzimas en colestasis, pero estos
ensayos son más específicos porque, si bien la enfermedad ósea puede producir elevaciones de
ALP en el mismo intervalo esperado para enfermedad hepática obstructiva, no se encuentran GGT
y 5'NT en el hueso. La medición de la bilirrubina total y directa también es importante para hacer
el diagnóstico de ictericia obstructiva.

LA RELACIÓN DE RITIS (AST / ALT)

Se ayuda a una mayor diferenciación de enfermedades hepáticas específicas calculando la


proporción de niveles de AST a ALT (6). Aunque existe una considerable superposición de valores
dentro de un diagnóstico dado, la relación De-Ritis puede dar una indicación general de si un
trastorno es agudo o crónico, y si es de origen intrahepático o extrahepático. Los valores de estas
relaciones son más útiles cuando se utilizan ensayos estándar de AST y ALT. Cuando se utilizan los
ensayos recomendados por la Federación Internacional de Química Clínica, la proporción de De-
Ritis es normalmente de aproximadamente 1,15. La figura 11.8 ilustra los resultados de la relación
de De-Ritis de pacientes con una variedad de enfermedades hepáticas.

Enfermedades hepáticas agudas versus crónicas

Los trastornos hepáticos agudos, como la hepatitis viral aguda y la mononucleosis infecciosa,
generalmente tienen valores más altos de ALT en relación con AS, y la relación De-Ritis es inferior
a 1,0. En el síndrome de Reye, en el que hay un inicio agudo de encefalopatía, la relación de De-
Ritis también es menor que 1 en la mayoría de los casos. Se ha postulado que las elevaciones en
ALT se observan antes de elevaciones en AST en procesos hepáticos agudos porque AST incluye
isoenzimas mitocondriales, y se necesita más tiempo para que estas enzimas pasen a través de un
segundo conjunto de membranas para alcanzar la circulación. De hecho, los trastornos crónicos
como la hepatopatía alcohólica, la cirrosis posnecrótica y la hepatitis crónica activa tienen
proporciones de Ritis mayores que 1. Aunque esta es una forma conveniente de recordar esta
relación, la fracción mitocondrial de AST en realidad contribuye solo con un pequeño porcentaje
de la AST total y es insuficiente para disminuir significativamente la relación de De-Ritis (figura
11.8). Los pacientes con hepatitis crónica persistente tendrán un nivel de aminotransferasas
normal o ligeramente elevado, lo que refleja el curso clínico leve de esta enfermedad.