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DETERMINACION DE CLOROFILA

INTRODUCCIÓN

La fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque convierte la

energía de la radiación solar en energía química que puede ser usada por todas las formas
de vida. La fotosíntesis comprende dos reacciones globales diferenciadas. En la primera
se realiza la transducción de energía, y en la segunda la reducción y fijación del carbono.
Los pigmentos fotosintéticos son los únicos que tienen la capacidad de absorber la energía
de la luz solar y hacerla disponible para el aparato fotosintético. Los cloroplastos de las
plantas superiores contienen siempre varios pigmentos, clorofila a, clorofila b, algunas
xantofilas y carotinas. Todos estos pigmentos son insolubles en agua, pero se disuelven
fácilmente en algunos solventes orgánicos. Además de las clorofilas y carotenoides,
muchas plantas poseen otros pigmentos, tales como antocianos, flavonoles, etc.

Los Pigmentos biológicos, también conocidos como pigmentos o biocromos son

sustancias producidas por microorganismos que tienen un color resultante de la
absorción selectiva de la luz. Los pigmentos biológicos incluyen pigmentos vegetales y
animales. Muchas estructuras biológicas, como la piel, ojos, plumas y cabello contienen
pigmentos como la melanina en las células especializadas llamadas cromatóforos.

Los colores pigmentarios difieren del color estructural ya que los primeros son los mismos
indistintamente del ángulo de visión mientras que el color estructural es el resultado de
la reflexión selectiva de la luz o iridiscencia.

PIGMENTOS EN PLANTAS

La función principal de los pigmentos en las plantas es la fotosíntesis, que utiliza la

clorofila, pigmento verde junto con varios pigmentos rojos y amarillos los que ayudan a
captar la mayor cantidad de energía de luz como sea posible. Otras funciones de los
pigmentos en las plantas incluyen la atracción de los insectos a las flores que fomentan la
polinización. Los pigmentos vegetales incluyen una variedad de diferentes tipos de
moléculas, incluyendo porfirinas, carotenoides, antocianinas y betalaínas. Todos los
pigmentos biológicos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz
mientras que reflejan otras. La luz que es absorbida puede ser utilizada por la planta para

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alimentar las reacciones químicas, mientras que las longitudes de onda reflejadas de la
luz determinan el color del pigmento que aparecerá a la vista.

LOS PRINCIPALES PIGMENTOS SON:

 La clorofila es el pigmento principal en las plantas; es una clorina que absorbe

longitudes de onda amarillas y azules de la luz mientras que refleja verde. Es la
presencia y abundancia relativa de clorofila la que da a las plantas su color verde.
Todas las plantas terrestres y las algas verdes poseen dos formas de este pigmento:
clorofila a y la clorofila b. Laminarias, diatomeas, y otros organismos fotosintéticos
contienen clorofila c en lugar de b, mientras que las algas rojas sólo poseen clorofila
a. Todas las clorofilas sirven como medio principal que las plantas utilizan para
interceptar la luz con el fin de impulsar la fotosíntesis.

 Los carotenoides son de color rojo, naranja o amarillo.

 Las antocianinas (literalmente "flor azul") son pigmentos flavonoides

hidrosolubles que aparecen de color rojo a azul, de acuerdo con el pH. Disponible.

 Las betalaínas son pigmentos rojos o amarillos.

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METODOS PARA DETERMINAR CLOROFILA

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LAS CLOROFILAS

INTRODUCCION

La fotosíntesis, consiste en la reducción de C02 atmosférico por medio de los protones

del agua obtenidos con la energía proveniente del sol. Así la planta almacena energía
electromagnética como energía potencial en los compuestos orgánicos.

Los compuestos carbonados ricos en energía, obtenidos de esta manera, son usados
después como fuente de energía por la propia planta y por otros organismos que son
incapaces de fabricar sus propios alimentos, pero que si pueden aprovechar
la materia vegetal.

El organismo vegetal ha desarrollado un sistema para capturar un fotón de luz y utilizar

la energía para elevar el nivel energético de un electrón determinado que posteriormente
regresa a su nivel basal; cuando esto sucede, el exceso de energía es liberada en diferentes
formas.

Los organismos fotosintéticos atrapan la luz solar formando ATP y NADH, que utilizan
como fuente de energía para formar lúcidos y otros componentes orgánicos a partir de
bióxido de carbono y agua de forma simultánea liberan oxigeno molecular. El bióxido de
carbono formado en la respiración de los heterótrofos regresa a la atmósfera para volver
a ser utilizado por los organismos fotosintéticos. De este modo la energía solar
proporciona la fuerza motriz para la circulación continua del bióxido de carbono y
oxigeno molecular atmosféricos a través de la biosfera y proporciona los substratos
reducidos (combustible).

La evolución de la vida vegetal ha logrado a través de mecanismos bioquímicos, desviar

del retorno del electrón a su nivel primitivo y utilizar el exceso de energía para
sintetizar carbohidratos. Las plantas superiores contienen también un complemento de

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enzima, semejante a los de la levadura, que son capaces de convertir

la glucosa en alcohol etílico y bióxido de carbono. Esta conversión, se produce cuando las
plantas están privadas de oxígeno.

Permanecen vivas durante periodos variables de tiempo que dependen del tipo de planta,
el grado de crecimiento. Etc.

En estas condiciones invariablemente producen bióxido de carbono y forma alcohol

etílico en sus tejidos. Un gran número de productos intermedios o fragmentos
carbohidratos se producen en el proceso principal de oxidación (respiración aeróbica) de
la glucosa a bióxido de carbono y agua, en el proceso alternativo, fermentación alcohólica
(respiración anaerobia).

La capacidad de capturar el fotón y convertir en la energía luminosa en

energía química es propiedad exclusiva de las plantas verdes.

Las substancias que absorben la energía radiante, que incide en la planta, es la clorofila.
Una molécula de clorofila se compone de una cabeza y una cola. La cabeza contiene cuatro
anillos de carbono nitrógeno unidos formando un anillo mayor en el centro de este anillo
hay un átomo de magnesio y tiene un pigmento color verde con estructuras policiclicas
planas. La cola es una cadena de carbonos enlazados unidos a la cabeza.

En todos los casos la fotosíntesis está asociada con corpúsculos verdes aislados, llamados
cloroplastos, que están suspendidos en el citoplasma de la célula. Es posible romper
la célula de la hoja en varias fracciones triturándolas con una solución amortiguadora.
Este tratamiento rompe los cloroplastos en fragmentos más pequeños llamados grana. Se
recuperan tres fracciones principales: A) el citoplasma, una solución transparente de
color café rojizo, B)los grana sólidos (verde) y C)las paredes celulares mezcladas
con células integras.

Los granas, que son todavía capaces de llevar a cabo la fotosíntesis contienen, referido al
residuo seco aproximadamente, el 40% de proteínas, 35% de lípidos, el 7% de minerales y

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el 5% de pigmento verde llamado clorofila. Esta molécula de pigmento se encuentra

incluida en la unidad estructural fotosintética llamada cuantosoma que corresponde a
una parte del tilacoide. Los pigmentos más importantes que absorben luz en las
membranas de los tilacoides son las clorotila.

Además en el cloroplasto de las plantas superiores, hay otros grupos de pigmentos que
son los carotenoides y de las xantótilas. La clorofila a es de color verde debido a que
absorbe preferentemente la luz roja y azul y transmite la verde. Y se distingue de la
clorofila B ya que esta tiene un grupo CH3.

OBJETIVO

Calcular la cantidad de clorofila que se encuentra en una determinada porción de extracto

por una determinación cuantitativa.

MATERIALES

 1 Mortero
 1 Embudo de Buchner
 1 Matraz de filtración
 1 Matraz aforado de 50 mil
 Probeta de 100 ml
 Vaso de precipitados de 200ml.
 Tubos de ensayo
 1 Pipeta de 5ml.
 1 Embudo
 Pipeta Pasteur, mechero, tripie y rejilla
 Espectrofotómetro y celdas
 2 Discos de papel filtro
 Gradilla
 1 gr de hojas frescas de espinacas.
 Arena

REACTIVOS

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 Acetona al 80% (v/v)

METODOLOGIA

1.- Coloque en el mortero 1 g de hojas de espinacas, sin las venas grandes, cortadas en
pequeños tamaños.

2.-Agregue arena y 4 ml de acetona al mortero, para moler el tejido y obtener una pasta
fina. Adicione 20ml más de acetona.

3.-Transfiera cuidadosamente el extracto resultante al embudo de Buchner provisto de

papel filtro, y filtre al vacío.

4.- Agregue otros 50ml de acetona a la pulpa de las hojas y reanude la molienda y el
filtrado. Este segundo extracto agréguelo al primero. El tejido debe de quedar sin
clorofila, de lo contrario repita el proceso con otros 20ml de acetona y reúna todos los
filtrados.

5.- Lave el mortero y el embudo con 50ml de acetona que se incorporara al filtrado. En
todo el proceso no debe de usar más de 100ml de acetona se aconseja aforar a 50ml en un
matraz.

6.- Lea la densidad óptica (D) a 645. 652.663 nm del extracto. Usando como blanco el
acetona. Anota las densidades medidas.

DISCUSIÓN

La fotosíntesis es un proceso que transforma en carbono orgánico el gas carbónico

tomado del aire o disuelto en el agua. En el proceso interviene un pigmento, la clorofila,
que es una sustancia capaz de absorber las radiaciones luminosas. Esta captación de
energía luminosa se realiza en una primera etapa en la fotosíntesis, en la cual se produce
energía química en forma de moléculas de adenosintrifosfato (ATP) y se
desprende oxígeno, que produce de la escisión de una molécula de agua. En una segunda
etapa, que se denomina fase obscura porque puede tener lugar en ausencia de luz, el
dióxido de carbono se combina con una pentosa para formar glucosa a través de una serie

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de reacciones químicas. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja
la verde.
La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis, ya que el espectro de absorción de
la clorofila es más amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece
de acción sobre este proceso.
Lo anterior nos explica porque cuando llevábamos la solución de clorofila a la luz del sol
esta cambiaba a un color rojo.
Cabe mencionar que no todas las soluciones obtenidas en la práctica por los demás
equipos tenían la misma tonalidad de verde, esto es porque no todas las hojas de
espinacas tenían la misma frescura, esto es que entre más frescas se encuentren las hojas
mayor contenido de clorofila.

CONCLUSIÓN

Sabemos que la clorofila es un factor importante en la fotosíntesis y que es capaz de

absorber la energía luminosa y gracias a ello puede promover la serie de reacciones que
conducen al almacenamiento de dicha energía en un compuesto de alto poder calórico.
La luz roja es la de mayor eficacia para la fotosíntesis, ya que el espectro de absorción de
la clorofila es más amplio en la zona del rojo. En cambio la luz verde carece de activación
sobre este proceso.

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EFECTO TIEMPOS Y PROCESOS DE COCCIÓN EN EL CONTENIDO DE

CLOROFILA DE VARIOS VEGETALES

INTRODUCCION

El propósito del presente trabajo, fue evaluar la posible pérdida de este pigmento presente
naturalmente el los vegetales de hoja verde por efecto de diferentes tiempos y procesos de
cocción mediante la técnica colorimétrica de Goodwin. Los resultados mostraron que el
mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes α y β se presenta en la
espinaca al registrarse valores de 62.78, 49.68 y 20.83 mg/g respectivamente. El salteado
fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido de clorofila en los vegetales de
hoja verde. Combinando tiempos y procesos, los valores de clorofila total más altos se
presentaron en espinaca procesada al vapor.

MATERIALES

Se adquirieron muestras de acelga, espinaca, verdolaga y berro directamente del súper

mercado, se separó la lámina foliar libre de nervaduras de cada vegetal y se sometieron a
los diferentes procesos y tiempo de cocción.

METODO

1.- Cuantificación de clorofila α, β y total acelgas, espinacas, verdolagas y

berros, cocinados a vapor a 1,3 y 5 minutos.

 Se tomó una muestra de material vegetal fresco.

 Se cocinó a vapor a 100 °C durante 1, 3 y 5 minutos para cada tratamiento
respectivamente, utilizando una estufa con control de temperatura.
 Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño con agua
helada por 30 segundos para cortar la cocción.
 Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de líquido.
 Se determinaron clorofila α, β y total.

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2.- Análisis del contenido de clorofila α, β y total acelgas, espinacas,

verdolagas y berros, cocinados mediante salteado a 1,3 y 5 minutos.

 Se tomó una muestra de material vegetal fresco.

 Se cocinó mediante salteado en una plancha eléctrica con control de temperatura,
durante 1, 3 y 5 minutos a 200 °C para cada tratamiento respectivamente.
 Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño en agua
helada por 30 segundos para cortar la cocción.
 Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de agua.
 Se determinó clorofila α, β y total.

3.- Determinación de la cantidad de clorofila α, β y total en acelgas,

espinacas, verdolagas y berros, cocidos mediante el hervido a 1,3 y 5 minutos.

 Se tomó una muestra de material vegetal fresco.

 Se cocinó en agua hirviendo durante 1, 3 y 5 minutos para cada tratamiento
respectivamente.
 Al finalizar el tiempo establecido se pasaron inmediatamente a un baño con agua
helada por 30 segundos para cortar la cocción.
 Se colocaron sobre papel secante para eliminar el exceso de líquido.
 Se determinaron clorofila α, β y total.

4.- Determinación del contenido de clorofila α, β y total en acelgas,

espinacas, berros, y verdolagas mediante la técnica de Goodwin.

 Se pesó por triplicado 0.5 g de cada una de las muestras sometidas a los diferentes
procesos de cocción y se maceraron en una solución de acetona-agua al 80% v/v.
 El extracto obtenido se pasó a través de un embudo buchner con papel filtro
Whatman No. 1.
 El filtrado se aforo a 10 mL con la misma solución.
 Se leyó absorbancia en un espectrofotómetro SEQUOIA-TURNER 690 a una
longitud de onda de 648 y 663 nm.

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La cuantificación de clorofila α, β y total se realizó de acuerdo a las siguientes ecuaciones.

mg/g peso fresco de CLOROFILA TOTAL = (20.2) (A 648) + (8.02) (A

663)
mg/g peso fresco de CLOROFILA α = (12.7) (A 663) + (2.69) (A 648)
mg/g peso fresco de CLOROFILA β = (22.9) (A 648) - (4.68) (A 663)
A= Absorbancia a 648 y 663 nm según corresponda.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La comparación múltiple de medias entre las muestras y los diferentes procesos aplicados
nos demuestra que los valores de clorofila total más altos se presentan en espinaca
procesada al vapor registrando 67.58 mg/g cifra que es estadísticamente diferente a la
obtenida con los otros procesos. Por el contrario en berro y verdolaga el valor más alto se
presentó con el proceso de salteado obteniéndose 62.62 mg/g y 28.89 mg/g
respectivamente, siendo estos contenidos diferentes estadísticamente a los valores
obtenidos en vapor y hervido, un estudio de las pérdidas de clorofila durante el escaldado
y el secado de okra realizado por Shivhare et al. (2000), reportó que el método de
escaldado influye más que la temperatura de secado en la misma. Asimismo, Schmalko y

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Alzamora (2001) estudiaron la pérdida de color y clorofilas en el procesamiento industrial

de hojas de yerba mate encontrando que el 80% de la pérdida de las clorofilas tenía lugar
en el hervido, mientras que con cocción seca se tenía una pérdida menor (10%). El calor
húmedo hace que la clorofila se pierda mayormente que el calor seco, figura 1.

La comparación de medias para cada una de las muestras en relación al tiempo de

aplicación de los diferentes procesos nos demuestra que en acelga y verdolaga el mayor
contenido de clorofila se presenta en el control con 67.60 mg/g y 23.88 mg/g cifras
estadísticamente diferentes a las obtenidas en el resto de los tiempos. Por el contrario en
espinaca y berro la mayor cantidad de clorofila se presenta a los 5 minutos con 67.19 mg/g
en espinaca y 60.26 en berro; lo cual concuerda con el estudio realizado por Ahmed et al.,
(2002), en el cual concluye que el color de las espinacas, hoja de mostaza y el puré de
ambas hojas, definitivamente se fue degradando durante el proceso térmico, siendo
mayormente afectado el puré. El comportamiento general de estos resultados se presenta
en la Figura 2.

En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos al analizar la interacción de procesos

y tiempos para cada una de las muestras. De acuerdo a estos tenemos que existen

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diferencias estadísticamente significativas con la formación de al menos dos grupos

estadísticamente diferentes para cada conjunto de datos. En acelga con el proceso de
vapor se forman dos grupos estadísticamente diferentes siendo con el control el valor mas
alto (76.53 mg/g) y es el que marca estas diferencias; con el proceso de hervido se
presentan tres grupos estadísticamente por un lado el control con 77.86 mg/g y por otra
parte los tratamientos de 3 y 5 minutos con 50.04 mg/g y 38.64 mg/g respectivamente.

CONCLUSIONES

En conclusión, el mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes α y

β se presenta en la espinaca al registrarse valores de 62.78, 49.68 y 20.83 mg/g
respectivamente. El salteado fue el proceso de cocción que mejor conserva el contenido
de clorofila en los vegetales de hoja verde. El tratamiento de 5 minutos de cocción,
mantuvo la máxima concentración de clorofila, siendo ligeramente menor a la cantidad
obtenida en el control. Combinando tiempos y procesos, los valores de clorofila total más
altos se presentaron en espinaca procesada al vapor.

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BIBLIOGRAFÍA

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spinach, mustard leaves, and mixed puree. Journal of Food Science Vol. 67, No. 3,
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Complex Formation with the Carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 506 – 514.
 CHERMONOSKY, S., SEGELMAN, A., PORETS, R., 1999. Effect of dietary
chlorophyll derivatives on mutagenesis and tumor cell growth. Teratogen
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 DASHWOOD, RH., BREINHEIT, V., BAILEY, GS., 1991. Chemopreventive
properties of chlorophyll in inhibition of aflatoxin B1 (AFB1)-DNA binding in vivo
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Salmonella mutagenicity assay. Carcinogenesis;12:939-942.
 GOODWIN, T.W., 1976. Chemistry and biochemistry of plant pigments. Vol. 1
& 2. Academic Press Inc. New York. U.S.A..
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in vivo: inhibition of dibenzo (a,1) pyrene-DNA adducts in rainbow trout liver.
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de Pigmentos en Frutas Sometidas a Tratamiento con Energía de Microondas.
Información Tecnológica. Vol. 15 N° 3, pp. 61-66.
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chlorophyllin derived from a traditional Chinese medicine Bombyx mori excreta
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(a,1)pyrene, 2-amino-1-methyl-6- phenylimidazo-[4,5-b]pyridine, and aflatoxin
B1 across Caco-2 cell monolayers. Toxicology 196, pages 117-125.

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TÉCNICAS ANALÍTICAS BÁSICAS EN FISIOLOGÍA VEGETAL

DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

La fotosíntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que
necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en
las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica.

Entre los distintos métodos que existen para separar y obtener esos pigmentos se
encuentra el de la cromatografía, que es una técnica que permite la separación de las
sustancias de una mezcla y que tienen una afinidad diferente por el disolvente en que se
encuentran. De tal manera que al introducir una tira de papel en esa mezcla el disolvente
arrastra con distinta velocidad a los pigmentos según la solubilidad que tengan y los
separa, permitiendo identificarlos perfectamente según su color.

PIGMENTO COLOR

Clorofila A Verde azulado

Clorofila B Verde amarillento

Carotenos Naranja

Xantofilas Amarillo

La técnica que se describe a continuación se puede realizar sin ningún problema.

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MATERIALES

 Hojas de espinaca o de cualquier planta cortadas en porciones.

 Alcohol de 96º (sirve el que utilizamos para desinfectar las heridas)
 Un mortero
 Dos filtros de café
 Un embudo
 Un vaso
 Una pinza de la ropa

PROCEDIMIENTO

 Se coloca en el mortero las hojas que se hayan elegido, se añade un poco de alcohol
y se trituran hasta que el alcohol adquiera un tinte verde intenso.
 Se filtra el líquido utilizando el embudo en el que se ha puesto el filtro de café.
 Se recortan unas tiras de papel del otro filtro y se introducen en el vaso hasta que
toquen su fondo procurando que se mantengan verticales con la ayuda de la pinza
 Se esperan 30 minutos y aparecerán en la parte superior de la tira de papel unas
bandas de colores que señalan a los distintos pigmentos.

OTROS MÉTODOS
MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS EN DUNANIELLA VIRIDIS

Extracción de acetona a partir de precipitados y medida espectrofotométrica.

Materiales:

 Espectrofotómetro
 Centrífuga de mesa

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 Tubos
 Acetona

MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y MEDIDA

1. Tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min

2. Guardar sobrenadante para medir fosfato con método verde malaquita

3. Resuspender el precipitado en 4ml de acetona para extraer pigmentos

4. Mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada

5. Centrifugar 1min

6. Medir la absorbancia del sobrenadante resultante

7. Posibles resultados:

-750nm turbidez

-664nm máximo de absorción de la clorofila A

8. Cálculos:

-para clorofila A: multiplicar resultados por factor de 10,3 (mg /ml)

MÉTODO DE LICHTENTHALER Y WELBURN (1983)

MATERIALES

 1gr de hojas
 Éter dietilico
 Crisoles
 Kitasato
 Espectrofotómetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz
 Placas Petri

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 Embudo
 Matraz

PROCEDIMIENTO

1. En un mortero se homogeniza 1 gr de hojas con éter dietílico en frío.

2. El homogeneizado obtenido se filtra a través de un crisol con placa filtrante nº 3
(Pobel), acoplado, mediante una junta de goma, a un embudo con filtro de vidrio
poroso nº 3 (Pobel).
3. El conjunto va encajado a su vez, en un kitasato con un tubo de ensayo sumergido
en hielo, donde se recogió el filtrado.
4. Sobre la placa del primer crisol se colocó una capa de celulosa nativa en polvo de 1
cm de espesor, para eliminar el agua del extracto.
5. A este sistema se le conecta una corriente de nitrógeno que se adapta mediante un
embudo invertido a la boca del crisol.
6. En el interior del kitasato se realiza vacío para acelerar la filtración y evaporar el
disolvente, con lo que se arrastra el nitrógeno y se crea una atmósfera inerte que
evita la oxidación de los pigmentos.
7. El homogeneizado se lava con éter dietílico hasta que éste sale incoloro y,
finalmente, se enrasa a un volumen de 25 ml. Durante todo el proceso la muestra
se mantuvo en penumbra y sumergida en hielo, para evitar la destrucción de los
pigmentos fotosintéticos.

A continuación se midió la absorbancia de la muestra a 600, 644 y 662 nm en un

espectrofotómetro Perkin Elmer 550 SE de doble haz. El contenido en clorofilas se
determinó según las fórmulas:

Cl a: 10, 5 x Abs (662) – 0,166x Abs (644)

Cl b: 16, 37 x Abs (644) – 3, 14 x Abs (662)

Cl total: 100,5 x Abs (600)

Los resultados se expresan en mg de clorofila /gr

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COMPARACIÓN DE LA ESTIMACIÓN DE LA CLOROFILA-a MEDIANTE

LOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICO Y FLUOROMÉTRICO

RESUMEN

En cuatro ecosistemas acuáticos de montaña del altiplano Cundiboyacense, Colom- bia,

se compararon mediante un análisis de regresión los datos de clorofila-a obteni- dos a
partir de los métodos espectrofotométrico (fórmula tricromática) y fluorométri- co
(método de Welschmeyer). El análisis demostró que el método espectrofotométrico
sobreestimó la concentración de clorofila-a, pero se puede utilizar con precaución en
ambientes de baja trofia. Se halló una ecuación que permite relacionar las medidas de
clorofila-a obtenidas con las dos metodologías.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras se tomaron en el lago Guatavita, Colombia, (L. Guatavita), y en tres hume-
dales del altiplano Cundiboyacense, Colombia, (H. Llano Grande, H. Briceño y H. Si-
beria), durante campañas realizadas entre abril y agosto de 2003 (Tabla 1). El lago de
Guatavita está ubicado en el municipio de Sesquilé, presenta un diámetro de 400 m, una
profundidad máxima de 30 m, es monomíctico, no tiene afluentes ni efluentes su-
perficiales, y la cuenca hace parte de una pequeña reserva forestal.

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L. H. Llano H. H.
Ubicación geográfica 4°58’50’’ 4°59’28’’ N 4°43’40’’ 4°58’14’
Guatavit Grande Briceño Siberia
N 74°06’06’’ W N ’N
a
73°47’43’’ 74°11’40’’ 73°57’10
W W ’’ W
Municipio Sesquilé Tenjo Briceño Facatati
vá

Cond. (µS cm-1) 9,7 23,9 170,6 658,6

16% 11% 42% 53%

O2 (mg l-1) 6,2 2,7 1,4 0,5

12% 56% 98% 169%

NH4 (µmol l-1) 5,9 44,4 1471,9 2508,9

40% 123% 249% 60%

NT (µmol l-1) 22,3 1747,2 7632,0 3883,0

95% 166% 137% 73%

PRS (µmol l-1) 1,1 0,26 15,4 27,6

94% 40% 137% 95%
Cl. a (mg m-3) 10,6 8,1 151,6 132,2

Fluorometría 45% 144% 129% 148%

Cl. a (mg m-3) 12,8 9,9 376,1 363,3

Espectrofotometría 49% 151% 230% 280%

Tabla 1. Ubicación geográfica, valores promedio y coeficiente de variación de las

variables físicas, químicas y de la clorofila-a de los ecosistemas acuáticos estudiados.

NT: nitrógeno total; O2: oxígeno; NH4: amonio disuelto; PRS: fósforo reactivo
soluble; Cl: cloro.

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RESULTADOS

La Cl.a presentó un promedio de 30,1 mg m-3 con el método fluorométrico y 66,2 mg m-

3 con el método espectrofotométrico. De las 200 muestras incluidas en el análisis, el
76% presentaron registros más altos con el método espectrofotométrico. Los valores
obtenidos con el método fluorométrico oscilaron entre 0,6 y 845,1 mg m-3 y con el
método espectrofotométrico entre 0,9 y 4158,8 mg m-3. Los datos promedio de Cl.a para
cada ecosistema se presentan en la tabla 1. Al establecer la diferencia entre los datos
hallados por espectrofotometría y fluorometría, se observaron promedios de la diferencia
más bajos para el H. Llano Grande (1,8 mg m-3) y la L. Guatavita (2,6 mg m-3), mientras
que en los otros humedales el promedio de la diferencia fue superior a 40 mg m-3. El
porcentaje de diferencia absoluta con respecto al método fluoro- métrico fue de 66% en
H. Siberia, 36% en H. Briceño, 27% en L. Guatavita y 22% en

H. Llano Grande. Al calcular el porcentaje del número de muestras cuya medición de

clorofila por el método espectrofotométrico presenta un valor más alto (sobreesti-
mación) o más bajo (subestimación) que el obtenido por el método fluorométrico, se
encontró que en el 100% de los datos espectrofotométricos de H. Llano Grande so-
brestimaron el valor de clorofila. En L. Guatavita y H. Briceño el porcentaje de sobre-
estimación fue aproximadamente del 70%, mientras en H. Siberia el porcentaje de
sobreestimación fue igual al de subestimación (50%).

Los modelos de regresión lineal simple (con excepción del modelo para H. Siberia),
presentaron relaciones significativas con r > 0,87 (Tabla 2). Los humedales Llano Grande
y Briceño presentaron el r más alto y el valor más bajo se obtuvo con los da- tos de
Guatavita. El modelo desarrollado con todos los datos presentó un r = 0,93 (Fig. 1).
Cuando se excluyeron los datos de H. Siberia la correlación del modelo se incrementó (r
= 0,96) y la relación de las dos variables se describió mediante la ecuación:

arcoseno H (log10 Cl.aespectro.) = 0.1338 + 0.9192 x arcoseno H (log10 Cl.afluorom.)

(E.1)

La DS fue baja y no superó 0,1 en los modelos significativos. El valor más bajo se pre-
sentó en el grupo de datos de la L. Guatavita que no incluyeron las muestras del hipo-
limnio y en el modelo para el H. Llano Grande. El valor más alto se presentó en el modelo

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que incluyó los datos de todos los ecosistemas. La m de los modelos significa- tivos osciló
entre 0,63 y 1,04. Una m > 1 solo se presentó en el H. Briceño (Tabla

2). Tabla 2. Principales parámetros obtenidos en modelos de regresión lineal simple

realizados entre la clorofila-a estimada mediante los métodos espectrofotométrico y
fluorométrico.

Grupo de Coeficiente Desviació Pendie n

datos de n nte (m)
incluidos correlación estándar
(r) (DS)

L. Guatavita 0,900* 0,052 0,750* 15

Guatavita sin 0,870* 0,042 0,630* 12
5,
H.hipolimnio
Siberia 0,020 n.s. 0,267 0,020 n.s. 14,
7,
00
H. Briceño 0,980* 0,066 1,040* 14,
0000
0
H. Llano Grande 0,990* 0,045 0,940* 00
00
13,
Todos 0,930* 0,097 0,870* 020
00

Todos sin H. 0,960* 0,059 0,910* 018

0,

Siberia 00
4,
0
00
El modelo realizado para establecer en qué concentraciones de nutrientes se cuan-
0
tifican con mayor exactitud los valores de Cl.a estimados espectrofotométricamente
presentó un r = 0,93 (n = 172; DS = 0,1; p < 0,0001). Al utilizar el procedimiento gráfico
con los residuales del modelo y la concentración de nutrientes (Fig. 2), se estableció que
la dispersión de los datos de Cl.a fue menor cuando el NH4 < 2000

µmol L-1, el NT < 1400 µmol L-1 y el PRS < 2,6 µmol L-1. Es decir, en ambientes como
la L. Guatavita y el H. Llano Grande, los residuales no superaron dos veces la DS del
modelo. Estas condiciones de nutrientes ocurrieron cuando la concentración de Cl.a fue
generalmente < 60 mg m-3 (este criterio se cumple en todos los casos para el H. Llano
Grande y la L. Guatavita).

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DISCUSIÓN

La sobreestimación de los valores de Cl.a por el método espectrofotométrico ha sido

ampliamente documentada en la literatura (Rowan, 1989). Los valores de sobreesti-
mación por la aplicación de la fórmula tricromática presentaron diferentes amplitudes,
según la concentración de nutrientes del ecosistema. Aún así, no se puede descartar el uso
de este método debido a que en los sistemas que tuvieron baja concentración de
nutrientes, la sobreestimación fue en promedio del 27%. Este valor es bajo si se compara
con valores > 100% descritos por Sartory (1985). Los modelos de regresión mostraron
una tendencia a tener coeficientes de correlación altos y desviaciones estándares bajas,
especialmente en sistemas acuáticos con bajas concentraciones de nutrientes, como es el
caso del H. Llano Grande y de la L. Guatavita. El análisis de los modelos de regresión
indicó que la tendencia de los resultados espectrofotométricos (independientemente de
la sobreestimación) fue altamente coherente con los datos obtenidos por el método
fluorométrico para el H. Llano Grande, la L. Guatavita y el

H. Briceño. En concordancia con estos resultados, el análisis de los residuales del modelo
y los valores de nutrientes señaló que en el H. Llano Grande y la L. Guatavita la
estimación de Cl.a fue más adecuada. En H. Briceño algunas de las muestras pre-
sentaron valores de clorofila y nutrientes por encima del límite establecido mediante el
análisis de los residuales, por lo que la cuantificación por medio del método espec-
trofotométrico estuvo posiblemente sesgada en algunos casos.

Los H. Siberia y Briceño presentaron una alta mineralización, elevadas concentra- ciones
de nutrientes y bajas concentraciones de oxígeno debido a la acumulación de materia
orgánica (inferido a partir de la concentración de nutrientes y observaciones de campo).
En ambientes altamente enriquecidos y productivos como el de H. Sibe- ria, la
acumulación y descomposición de materia orgánica permite el aumento de algunos
pigmentos que pueden interferir con la cuantificación de la Cl.a. Los feofor- bidos y
feofitinas son dos productos comunes de la degradación de la Cl.a que, al igual que los
carotenoides, podrían interferir fuertemente con su determinación es- pectrofotométrica
(APHA, 1998). Estos pigmentos no fueron cuantificados en este trabajo, y por esta razón
solo es posible establecer que existe un factor asociado a la alta concentración de
nutrientes que interfiere con el método. Si bien otros com- ponentes orgánicos e

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inorgánicos pueden ser también los causantes de interferir con el método

espectrofotométrico, el estudio de los pigmentos degradados merece espe- cial atención
en futuras investigaciones para establecer el papel de tales sustancias en las
determinaciones de la Cl.a.

En el caso de la L. Guatavita, la inclusión de los datos del hipolimnio en el modelo in-

crementaron la DS debido a la mayor dispersión de los datos; no obstante, también se
incrementó la correlación entre los dos métodos porque la amplitud en la estimación de
la variable aumentó. Estos resultados sugieren que para L. Guatavita el método espec-
trofotométrico utilizado puede ser conveniente para describir los patrones verticales de
distribución de la Cl.a, a pesar de los valores más sesgados hallados en el hipolimnio.

CONCLUSIONES

Los coeficientes de correlación obtenidos demostraron que los dos métodos pre- sentan
una tendencia semejante con el tipo de muestras analizadas, y que el método
espectrofotométrico puede utilizarse con precaución en ecosistemas acuáticos con baja
concentración de nutrientes. La pendiente de los modelos indica que en estos ecosistemas
el método espectrofotométrico sobreestima la clorofila con respecto al método
fluorométrico. Sin embargo, este método es útil para describir patrones espa- ciales y
temporales, ante la dificultad de utilizar en forma rutinaria metodologías más exactas
pero costosas. El método espectrofotométrico puede utilizarse en sistemas acuáticos con
baja concentración de nutrientes y con concentraciones de clorofila-a inferiores a 60 mg
m-3.

BIBLIOGRAFÍA

 APHA, American Public Health Association, American Waterworks, Association

(AWWA), Water Pollution Control Federation (WPCF). Standard Methods for
Examination of Water and Sewage and Wastewater. 20a ed. New York; 1998.
 BANDERAS A, GONZÁLEZ R, LANZA G. Limnological Aspects of a High-
Mountain Lake in Mexico. Hydrobiologia. 1991;224:1-10.
 BÜHRER H. Problems in Estimation of Pheophytine. Verh Internat Verein
Limnol. 1991;24:1259.

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DETERMINACIÓN DE CLOROFILA A Y FEOPIGMENTOS RAMÓN VARELA

INTRODUCCIÓN

La determinación de clorofila a se emplea para estimar la biomasa de los productores

primarios (fitoplancton) que se encuentran como partículas en suspensión en el agua. El
procedimiento que se describe a continuación cuantifica la concentración de clorofila a y
feopigmentos presentes en una muestra utilizando técnicas fluorométricas. El
procedimiento sigue los lineamientos propuestos por Holm-Hansen et al. (1965), y los
cálculos se efectúan como se indican en Lorenzen (1966). Entre las modificaciones se
encuentran el uso de metanol en vez de acetona como un disolvente de extracción debido
a su mayor eficiencia (Holm-Hansen y Riemann, 1978) y el empleo de un sonificador
(Wright et al., 1997). Este método se puede aplicar en todos los rangos de concentración
de clorofila a que se encuentran en el mar. El límite de detección del método es de 0,01
µg L-1 para aguas naturales (muestra de 0,5 L). Los resultados se expresan en µg L-1 ó mg
m-3.

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO

Una muestra de agua de mar se filtra a través de un filtro de fibra de vidrio sobre el cual
se retienen las partículas en suspensión. Entre estas partículas se encuentran organismos
del fitoplancton los cuales poseen pigmentos clorofílicos como clorofila a y feopigmentos.
La extracción de estos pigmentos de las células se efectúa usando metanol como
disolvente, y el ultrasonido (sonificación) se usa para romper el filtro y las células. Luego
de aclarar el extracto por centrifugación se coloca en un fluorómetro donde los pigmentos
de las algas se excitan con luz de longitud de onda azul, emitiendo fluorescencia con
longitud de onda roja. La fluorescencia se detecta por medio de un fotomultiplicador.
Seguidamente, la muestra se acidifica para convertir toda la clorofila a en feopigmentos y
se mide en el fluorómetro nuevamente.

ADVERTENCIAS ANALÍTICAS

1. La presencia de clorofila b, clorofila c y/o divinil clorofila a en la muestra pueden

acarrear error en la medición. Concentraciones elevadas de clorofila b, especialmente en
la zona del máximo de clorofila, interfieren en forma negativa con la clorofila a y positiva

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con los feopigmentos (Knap et al., 1997). Esta interferencia es importante si son
abundantes algas pertenecientes a la clase clorofíceas y/o proclorofitas.

2. El límite de detección del equipo se sobrepasa cuando el nivel de los pigmentos en los
extractos es muy alto. El fluorómetro siempre se mantiene en su máxima sensibilidad;
por lo tanto, las mediciones tienden a subestimar concentraciones elevadas, posiblemente
por efecto de la extinción (“quenching”). Para solventar este problema, existen varias
alternativas. Una alternativa no muy recomendable es diluir la muestra lo cual aumenta
la incertidumbre del método. Si el filtro se encuentra saturado de material después de la
filtración, otra opcion es cortar el filtro en fracciones más peque- ñas y realizar el análisis
por separado a cada fracción. La alternativa más recomendable en aguas muy productivas
con una concentración elevada de fitoplancton es filtrar un volumen menor de agua (250
mL o menos) de manera de evitar cortar el filtro o diluir la muestra.

3. La fluorescencia depende de la temperatura. Por lo tanto, realizar la calibración del

equipo así como el análisis de muestras a una temperatura ambiental constante entre 20-
25 °C. El coeficiente de temperatura para la fluorescencia de la clorofila es - 0,3%/°C.

4. La luz intensa puede degradar con rapidez la clorofila. Realizar todo el análisis en un
ambiente con luz tenue.

5. Tanto el material que se emplea en el análisis como el metanol deben permanecer libres
de residuos de ácido.

MATERIALES

 Filtros de fibra de vidrio (Whatman grado GF/F o su equivalente, 0,7 µm, 25 mm).
 Unidad de filtración y bomba de vacío.
 Embudos para filtros de 25 mm, 200 mL de capacidad.
 Tubos de centrífuga de polipropileno con tapa, de 15 mL.
 Celdas de 13-mm específicas para el fluorómetro.
 Pipetas automáticas monocanal con capacidad de 200 y 1000 µL.
 Pipetas de 5 y 10 mL.
 Espátulas pequeñas.
 Guantes de vinilo.

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EQUIPOS

1. Fluorómetro Turner Designs (10-AU-005), con fotomultiplicador sensitivo al rojo (λ

185-870 nm), lámpara F4T5/d, filtro azul (λ 340 – 500 nm CS 5-60) y filtro rojo (λ > 665
nm CS 2-64).

2. Sonificador, Fisher Scientific modelo 100.

3. Centrífuga, 0 - 3900 r.p.m.

4. Unidad de filtración y bomba de vacío.

REACTIVOS

1. Metanol (CH3 OH).

2. Ácido clorhídrico (HCl, 0,48 N).

3. Solución concentrada de clorofila a. Se emplea una ampolla de solución estándar

comercialmente disponible de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma C-6144, 1 mg)
libre de clorofila b. Disolver el contenido de una ampolla con cristales de clorofila a en 15
mL de metanol. Los cristales de clorofila se disuelven muy lentamente; por lo tanto,
realizar la dilución dos días antes de la calibración. Una vez disuelta, mantener esta
solución almacenada a - 20 °C.

4. Solución de trabajo para la calibración. Diluir 1 mL de la solución concentrada de

clorofila a en 49 mL de metanol. La concentración de esta solución debe ser
aproximadamente de 1 µg L-1. Para determinar la concentración precisa, medir la
absorción a cada nanómetro entre 660 y 670 nm empleando un espectrofotómetro recién
calibrado y ubicar la longitud de onda con absorción máxima (Amax). Determinar la
concentración de clorofila a en la solución aplicando la siguiente formula:

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DONDE:

 Amax = absorción máxima (entre 660 - 670 nm).

 A750nm = absorbancia a 750 nm.
 E = coeficiente de absorción específica de la clorofila en metanol, 79,81 g-1 cm-1
(Jeffrey y Welschmeyer, 1997).
 L = longitud de la celda en cm, 10-cm.

CAPTACIÓN DE MUESTRAS

1. Captar las muestras de agua en botellas oscuras de polietileno de 1 L lavando tres veces
con la muestra antes de llenar.

2. Filtrar la muestra inmediatamente a través de filtros de fibra de vidrio. Anotar el

volumen filtrado. El volumen a filtrar depende de la cantidad de clorofila presente en el
agua, lo cual se puede estimar a través del fluorómetro del CTD. Para las aguas con
biomasa baja (< 1 mg m-3) se filtran 500 mL por duplicado. Filtrar 250 mL por triplicado
si la biomasa es > 1 mg m-3.

3. Mantener el nivel de vacío de la bomba entre 400- 500 mm Hg para no romper las
células.

4. Al finalizar la filtración, sacar el filtro con una pinza plana y doblarlo por la mitad o
enrollarlo con el lado que contiene las partículas hacia adentro. Introducir el filtro en un
tubo de centrífuga debidamente identificado.

5. Congelar a - 20 °C. Realizar el análisis antes de un mes.

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ANÁLISIS DEL BLANCO

Antes de realizar el análisis de clorofila a es imprescindible evaluar el funcionamiento del

fluorómetro así como la calidad analítica del metanol con un análisis del blanco. El
metanol debe estar libre de contaminantes o de algún otro elemento que pueda alterar los
resultados del análisis.

1. Colocar 5 mL de metanol con una pipeta limpia en una celda del fluorómetro.

2. Realizar una lectura en el fluorómetro. Una lectura mayor de cero indica posible
contaminación del reactivo o un equipo descalibrado; por lo tanto, NO SE DEBE realizar
el análisis hasta calibrar el equipo o cambiar de reactivo.

3. Es conveniente verificar la estabilidad del equipo antes del análisis utilizando un

estándar sólido suministrado por el fabricante. Este estándar se ajusta durante la
calibración.

ANÁLISIS DE MUESTRAS

Se recomienda comenzar el análisis a partir de las muestras con menor concentración y

terminar con las que posean la mayor concentración (usualmente las superficiales).
Realizar los duplicados en forma consecutiva. Usar guantes en todo momento durante el
análisis y atender las medidas de seguridad para el manejo del metanol.

1. Preparación de las muestras antes del análisis. Sonificación.

a. Sacar los tubos de centrífuga con los filtros del congelador y descongelar a temperatura
ambiente a resguardo de la luz.

b. Agregar a cada tubo 10 mL de metanol puro sin formar burbujas. Verificar que todos
los tubos contengan la misma cantidad del líquido y que el filtro quede totalmente
sumergido.

c. Romper el filtro dentro del tubo con una peque- ña espátula para homogenizar la
muestra. Esto favorece la ruptura de las células del fitoplancton e incrementa la eficiencia
de extracción del solvente. Colocar los tubos en una gradilla cubriéndolos con papel de
aluminio para protegerlos de la luz.

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d. Introducir la punta del sonificador en el metanol sin tocar el fondo del tubo de
centrífuga. La sonda debe estar lo más perpendicular posible y no tocar las paredes del
tubo.

e. Prender el sonificador y aumentar gradualmente la potencia hasta la posición 15.

f. Mantener en esta lectura por 30 segundos, apagar el equipo y retirar la punta del
sonificador, tapar el tubo de centrífuga y guardarlo protegido de la luz.

g. Entre muestra y muestra, lavar la punta del sonificador con metanol puro y secar.

h. Colocar los tubos en una gradilla y almacenar a 4 °C (no congelar) por 24 horas para
permitir que el metanol extraiga los pigmentos. Es recomendable agitar ligeramente los
tubos tres o cuatro veces durante este periodo.

2. Medición de clorofila a y feopigmentos con el fluorómetro.

Encender el fluorómetro una hora antes de comenzar el análisis para permitir que
estabilice.

a. Colocar los tubos en una centrifugadora por 30 minutos a 3000 r.p.m. para clarificar
el extracto.

b. Transferir los tubos a una gradilla y ordenarlos por réplicas, protegiéndolos de la luz.

c. Con una pipeta, extraer cuidadosamente 5 mL de metanol de la mitad superior del

líquido en el tubo, sin tocar las partículas del filtro ni producir turbulencia y transvasarlo
a la celda del fluoró- metro.

d. Colocar la celda en el fluorómetro previamente calibrado, y realizar la lectura una vez

que el equipo estabilice (~ 8 s). Esta lectura corresponde a la fluorescencia inicial (Fo).

e. Agregar 100 µL de HCl 0,48 N y agitar levemente. Esperar tres minutos como mínimo
para que se complete la reacción.

f. Colocar la celda en el fluorómetro y esperar que el equipo estabilice, realizar la lectura

de la muestra acidificada. Esta lectura corresponde a la fluorescencia acidificada (Fa).

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g. Entre muestra y muestra, lavar la pipeta y las celdas del fluorómetro un mínimo de tres
veces con metanol puro.

CALIBRACIÓN DEL FLUORÓMETRO

El fluorómetro se calibra, siguiendo las instrucciones del fabricante, cada seis meses con
un estándar, comercialmente disponible, de clorofila a pura (Anacystis nidulans Sigma C-
6144, 1 mg) libre de clorofila b. Realizar cinco diluciones con la solución de trabajo de
clorofila a para alcanzar concentraciones entre 0 y 130 µg L-1 con lo cual se puede calibrar
el equipo para una escala de valores de 0 a 150 µg L-1. Una vez finalizada la calibración,
medir el estándar sólido que suministra el fabricante, y utilizar esta lectura para verificar
la estabilidad del equipo en análisis sucesivos. Una deriva mayor de un 10% indica la
necesidad de una nueva calibración. Las mismas diluciones se pueden emplear para
determinar la razón de acidificación máxima (R) después de la calibración. Tomar las
lecturas de varias diluciones (Fomax) y acidificar con 100 µL de HCl 0,48 N. Medir las
muestras nuevamente en el fluorómetro (Famax). R es la razón máxima de fluorescencia,
antes y después de acidificar, calculada a partir del estándar de clorofila a pura usada para
calibrar el fluorómetro. Para el metanol, R varía entre 2,4 y 2,7. Cuando se utiliza metanol,
el valor de R es más variable que cuando se emplea acetona. La cantidad de ácido añadido
a la celda debe ser fijo, igual en la calibracion como para las muestras. Un incremento
pequeño en el volumen produce valores de R anómalos.

DONDE:

 Fomax = lectura antes de la acidificación.

 Famax = fluorescencia acidificada máxima.

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CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

La fórmula basada en Lorenzen (1966) empleada para el cálculo de la concentración de

clorofila a y los feopigmentos en el agua de mar es:

 Ve = volumen de metanol (10 mL).

 Vm = volumen de muestra filtrada.
 Fo = lectura antes de la acidificación.
 Fa = lectura después de la acidificación.

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CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS

OBJETIVO Y DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

El objetivo de esta parte de la práctica es extraer los de pigmentos de cloroplastos de un

material vegetal y determinar la cantidad de clorofila contenida en el mismo.

EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS:

 PROTOCOLO 1: Extracción con acetona

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier

otro material verde, con 5 ml de acetona al 80%, disgregando el tejido vegetal en un
mortero, de modo que los pigmentos salgan al exterior y se disuelvan en acetona. Cuando
la acetona está bien verde, el macerado se introduce en un tubo de centrífuga de plástico
y se centrífuga a 2000 rpm durante 10 minutos. Después de centrifugar se obtiene un
sobrenadante verde que contiene los pigmentos. Ajustar el volumen final a 6 ml con
acetona al 80%.

 PROTOCOLO 2: Extracción con etanol

Extraer los pigmentos de cloroplastos de 0.5 g de hojas frescas de espinacas o de cualquier

otro material verde cortando las hojas en segmentos de aproximadamente 0.5 cm que se
introducen en un tubo de ensayo con 6 ml de etanol al 80% de modo que los segmentos
queden bien sumergidos en el etanol. Incubar durante 20 minutos en un baño a 80° para
que las clorofilas salgan al exterior y se disuelvan en el etanol. Al cabo de este tiempo los
segmentos deberán quedar totalmente decolorados y el etanol queda de color verde.

MEDIDA DE CLOROFILA:

Se toman 0.5 ml del sobrenadante de cada uno de los extractos y se diluye hasta 5 ml con
acetona al 80% en la extracción con acetona (protocolo 1) y con etanol al 80% en la
extracción con etanol (protocolo 2). Después se mide en un espectrofotómetro a
longitudes de onda de 645 y 663 nm.

Para calcular las clorofilas totales aplicaremos la siguiente fórmula:

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DETERMINACIÓN DE CLOROFILA EN FRUTOS DE CUATRO VARIEDADES

DE CHILE (Capsicum sp)

RESUMEN

La importancia del chile (Capsicum sp.) es por su amplia distribución, gran diversidad de
tipos de chiles cultivados y silvestres, y los diversos usos que se le da a los frutos. Es una
fuente excelente de colorantes naturales, vitaminas y minerales que representan una
importante materia prima en la elaboración de alimentos y en la industria. El objetivo del
presente estudio fue cuantificar el contenido del color extractable, clorofila total, y β, y
carotenoides de los grupos rojos (R) y amarillonaranja (A) en cuatro variedades de chile
(Capsicum sp.). La determinación de carotenos y clorofilas se realizó por dos métodos de
extracción y la determinación de color extractable por el método ASTA 20-1. El mayor
contenido de clorofila total así como el de sus componentes y β se presentan en la muestra
seca de chile chilaca después de 4h de extracción. La mayor concentración de
carotenoides totales y grupos carotenoides (R) y (A) se obtuvo en la muestra fresca de
chile habanero después de una hora de extracción. En la variedad habanero en muestra
fresca se presentó el mayor contenido de unidades ASTA y en las muestras secas el mayor
contenido de estas se obtuvo en la variedad de chile chilaca.

INTRODUCCIÓN

En México, la importancia económica del chile (Capsicum sp.) es evidente por su amplia
distribución y los diversos usos que se da a los frutos. El interés por este cultivo se ha
incrementado por la presencia de otros compuestos, conocidos como fitoquímicos, que
tienen un efecto benéfico sobre la salud humana (GuzmánMaldonado y Paredes-López,
1998). Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los ácidos fenólicos, de los
cuales se sabe que reducen el riesgo de contraer cáncer, problemas cardiovasculares y
otras enfermedades crónico degenerativas (Dillard y German, 2000). Los frutos de
Capsicum se han utilizado en forma de concentrados, oleorresinas y como especias en
colorantes alimenticios. Los frutos presentan carotenoides, como ceto-carotenoides,
capsantina, capsorubina contribuyendo a la coloración roja del fruto (Philip et al., 1971),
mientras que β-caroteno, zeaxantina, luteína y β- criptoxantina son responsables del color
amarillo-naranja. Los pigmentos y precursores de color de frutas y hortalizas desde el

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punto de vista químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados
por unidades de isopreno y su biosíntesis se produce a partir de isopentil pirofosfato. La
clorofila ayuda a la fijación del hierro en casos de anemia, la clorofila y la clorofilina
poseen actividad antimutagénica y anticarcinogénica, posee acción antioxidante, nutre y
fortalece el sistema circulatorio e intestinal, tiene actividad desintoxicante contra metales
pesados, aflatoxinas, acción deodorizante (ayuda a neutralizar el olor corporal) (Breinholt
et al. 1995, Chermonosky et al. 1999). Desde el punto de vista de la tecnología de los
alimentos, el interés por clorofilas se centra en las reacciones poscocecha que degradan a
estos pigmentos, incluso los que ocurren durante el procesamiento y almacenamiento.
Paralelamente se reconoce que la clorofila tiene efectos sobre la salud, tales como la
reducción de algún tipo de tumores en animales de laboratorio. Existen varias clorofilas
reportadas, las clorofilas y β están presentes en el tejido fotosintético en una relación 3:1.
Las clorofilas se emplean poco como aditivos alimentarios, con excepción de algunas
gomas de mascar y pastillas, junto con sales cúpricas. En estados Unidos se emplean como
aditivos a través del uso de jugos de vegetales. De acuerdo con Almeda et al. (1991), el
contenido total de carotenoides en el fruto varia de acuerdo al tipo de cultivar, estado de
madurez y condiciones de crecimiento. Además, la temperatura, iluminación y tiempo de
secado para almacenar y/o elaborar subproductos pueden generar incrementos o
decrementos en la concentración de los carotenoides (Gómez-Ladron y Pardo-González,
1996). Los procesos de secado, fabricación y extracción de pigmentos deben estar
eventualmente resueltos para evitar pérdidas de color y conservar en forma más natural
estos pigmentos (Minguez-Mosquera et al., 1994). Hornero-Méndez et al. (2002),
determinó el contenido de carotenoides en el chile pimiento cv. MA1, reportando
12607.58 mg.kg-1 de peso fresco. Por otra parte Arjona et al. (2003), reportaron valores
de 150 y 214 unidades ASTA en carotenoides de pimentón (Capsicum annuum) var.
trompa de elefante., superando el valor mínimo exigido por la Federal Specification que
es de 120 unidades, además observaron que la materia prima influye en el contenido total
de carotenoides.

El conocer el contenido de pigmentos en frutos frescos y secos, es de gran importancia ya

que debido a los efectos antitumorales que se le atribuyen a los pigmentos podrá
recomendarse su consumo. Por lo que el objetivo del presente estudio fue cuantificar el

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contenido del color extractable, clorofila y β, y carotenoides rojos (R) y amarillo-naranja

(A) en cuatro variedades de chile (Capsicum sp.).

METODOLOGIA:

Material biológico y procesamiento de muestras

 Se obtuvieron 200 g de frutos frescos de chile de cada una de las variedades

(serrano, habanero, chilaca y jalapeño) y se refrigeraron a 5ºC por 24 horas.
Posteriormente, los frutos se desinfectaron con cloro 10% v/v y se enjuagaron con
agua destilada, se desvenaron y se eliminó la semilla.
 Una vez eliminadas las semillas se dividieron las muestras en partes iguales, una
de las cuales se refrigeró hasta su posterior uso (muestra fresca) y la otra se colocó
en papel aluminio para efectuar el secado de las muestras el cual se realizó en un
horno eléctrico durante tres días a 60oC. Determinación de color extractable,
carotenos y clorofilas Las muestras frescas y secas de cada una de las variedades
fueron sometidas a dos métodos de extracción:

MÉTODO DE EXTRACCIÓN 1.

Se colocaron 0.5g de cada muestra (fresca y seca) por variedad en seis repeticiones, se
colocaron en vasos de precipitado de 100mL, se agregaron 50mL de acetona y se agitaron
durante 4 h; se filtró dos veces con papel Whatman No. 4, a la muestra se le adicionaron
otros 50mL de acetona y se agitaron nuevamente (estos pasos podrán repetirse hasta
obtener la decoloración total de la muestra). El volumen total de acetona fue de 100mL.

MÉTODO DE EXTRACCIÓN 2.

Se tomaron 0.5g de cada una de las muestras y se molieron en mortero evitando la

incidencia de luz, el polvo así obtenido se transfirió a un vaso de precipitado de 200mL y
se adicionaron 400mL de acetona y se mantuvieron en reposo durante 1h, posteriormente
se filtró dos veces en papel Whatman No. 4 y se aforó a 100mL con acetona.

La determinación de color extractable se realizó por el método ASTA 20-1 (Anónimo,

1986) para lo cual se tomaron 5mL de la solución final y se determinó por seis repeticiones

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la absorbancia a 460nm en un espectrofotómetro (Spectrphotometer BioMate TM 3).

Éste se determinó solamente de las muestras procesadas por el método1. A partir de las
soluciones obtenidas mediante los métodos de extracción 1 y 2, se tomaron 5mL de cada
una de las muestras y se realizaron lecturas de absorbancia en el espectrofotómetro a
diferentes longitudes de onda; 648nm-663nm para clorofila (Godwing, 1976), 480nm-
750nm para carotenos totales (Strickland & Parsons, 1972; Britton, 1985), 450nm-508nm
para carotenos amarillos y rojos respectivamente (Fekete et al., 1976; Haspel-Horvatovic
y Horickova, 1976). Los resultados obtenidos fueron analizados mediante un Análisis de
Varianza para detectar diferencias significativas entre las variedades, y mediante
comparación múltiple de medias (Tukey).

RESULTADOS Y DISCUSION

En relación al contenido de pigmentos en frutos de cuatro variedades de chile (Capsicum

annuum L.) se encontró con base en el Análisis de Varianza, que existen diferencias
altamente significativas (P<0.01) entre variedades y entre tratamientos, así como en la
interacción de las diferentes fuentes de variación, demostrándose una amplia
variabilidad. En cuanto a la clorofila el más alto contenido de este pigmento se presento
en las muestras secas de los frutos de la variedad chilaca independientemente del tiempo
de extracción, alcanzado valores de hasta 8.34mg/g de muestra. Por otra parte en las
muestras secas de chile habanero se registraron los valores mas bajo con 0.3mg/g (Figura
1). En cuanto a los resultados obtenidos de clorofila y β se reporta que para ambos
métodos la muestra de chile chilaca (tanto muestra fresca, como seca) presentan valores
relativamente altos comparados con los demás variedades evaluadas. Respecto al
contenido de carotenoides totales en las muestras de las cuatro variedades se encontró
que la mayor concentración se presenta en las muestras frescas de los frutos de habanero
registrándose 93.25g/L cuando el tiempo de extracción en acetona fue de 1h, cuyo
contenido se incrementó a 116.92g/L cuando el tiempo de extracción fue de 4h. Este
comportamiento se observó también en la muestras de las variedades de chilaca y
jalapeño. De manera general se observa un drástico decremento en este pigmento cuando
los frutos fueron deshidratados a 60oC durante 72h (Figura 2). El contenido de grupos
carotenoides reporta que para ambos grupos (A y R) las muestras frescas de chile
habanero del método de extracción 2 (1h) registran una mayor cantidad de grupos

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carotenoides en relación a las demás variedades estudiadas (Tabla 1). Para el color
extractable, se reporta un alto índice de 35.05 unidades ASTA para muestra fresca de chile
habanero, mientras que la muestra seca de chile chilaca da como reportado 22.49
unidades ASTA, esta misma tendencia se observa para la muestra seca de chile serrano
dando 2.65 unidades ASTA por encima de su contraparte fresca.

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CONCLUSIONES

El mayor contenido de clorofila total así como el de sus componentes y β se presentan en

la muestra seca de chile chilaca del primer método (4h). El contenido de carotenoides
totales y grupos carotenoides se obtuvo la mayor cantidad de la variedad chile habanero
muestra fresca del segundo método de extracción (1h). La variedad chile habanero en
muestra fresca presentó el mayor contenido de unidades ASTA, en cambio por parte de la
muestra seca el mayor contenido de unidades ASTA lo obtuvieron la variedad de chile
chilaca (uso del método de extracción 1, 4h).

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