TRANSCRIEREA (BIOSINTEZA RNA) Spre deosebire de replicare, care antreneaza simultan Intregul cromozom, transcrierea vizea7a numa anuite portiun 5 de DNA, si anume acelea care codific’ proteinele necesare G- celulei la momentul dat. Structura RNA este conclude: ya dictatd de structura matricei. in vivo, transcrierea este asi- metricS, adicd intr-o anumitd regiune se copiaz o singur’ T cateni de DNA, desemnati drept_caten3 sens, spre ct deosebire de cea netranscris’ — catend antisens. c in 1961, Sol Spiegelman elaboreaza metoda hibridiza- Cc rii, ce const& in incalzirea dublului helix DNA; depagind TH temratura de topire, el trece intr-o forma unicatenara. La a ricitea lent a solufiei, catenele reasociaza’ si formeazi dublul : : helix cu ostructurd nativa. Dublulhelixse formeazinumaiin Catena Catena cazul in care catenele de DNA provin din organismeleunei = RNA = DNA specii sau ale specie inrudite. Dac& secventa bazelor din pissey 224, seevetele mRNA ecomplementari, apoi in combinarea catenelorde fempiementare DNAsi RNA trebuie sa formeze fragmentehibrid DNA- —_formeazi hibridul RNA- RNA (fig. 2.24). ‘DNA’ Experimentele au demonstrat c& succesiunea bazelor azotate in mRNA sunt complementare succesiunii DNA mattice. in 1960. fost descoperiti enzima ce sinte~ tizeaz3 RNA corespunzitor suecesiunii din DNA mattice. Pentru sinteza mRNA sunt necesare: 1. Matricea DNA — de preferinta dublu helix; 2. Precursori activati—cele 4 ribonucleotide — ATP, GTP, CTP, UTP; 3. Toni de Mg’* sau Mn"; 4. Enzima RNAp, ca si DNAp, necesita zincul pentru functionare; 5, Sinteztae loc iracecayi directic S*’ —» 3°, E unalog yi mecanisinul de elongatie alantului nucleotidic favonizant atacului nucleofil al fosfatului intern din urmiitorul ribonu- cleotidtrifosfat de grupa 3'-OH ai catenei crescinde. Forta motrice a procesului e hidroliza pirofosfatului tiv. Particularitatile procesului de sintezi RNA: a) RNAp nu necesita prezenta primerului: : b) DNA matricea se pastreaza intact c) RNAp nu posedi proprietiti nucleazice. La eucariote deosebim trei RNAp: RNAp-I ce asigura 2 sinteza rRNA 28 si 188; RNAp-II-mRNA siacele RNA care Figura225.Structna pot fi mareate la capete; RNAp-III asigura sinteza (RNA gi 7 = 58 rRNA, precum si RNA mult mai mici. RNA-polimeraza foloseste informatia inscris& in DNA matrice, acest fapteste argumentat experimental (succesiunea bazelor in mRNA intocmai copia complementari a succesiunii lor in DNA matriceal). RNAp este 0 enzim’ compusi din citeva subunititi — (6,0,Bf'), adic’ e 0 holoenzima (fig.2.25). Sigma subunitatea alege segmentul de initiere, Enzima fiira sigma = 130-poartd denumirea de «core» ferment (ferment minim): o:subunitatile sunt centrele catalitice, p' — se leagd de DNA, iar fi subunitatea fixeaza substratul — ribonucleotidtrifosfatii. Sinteza decurge tn mod similar, implicind urmatoarele etape: 1 Initierea sintezei —incepe in anumite fragmente de DNA, cu o secventa specifica ce poarta denumirea de promotor. in promotor participa aproximativ 40 de nucleotide sideosebim dou’ locusuri—unul de recunoastere, depistat cuajutorul subunit sigma, sioaltl seeventi—locusul de legarelaxiia RNA-polimerazei. Sigma amplificd afinitatea enzimei pentru acest locus de 10* ori in raport cu alte locusuri de pe DNA. 1.0 importanga deoscbita i se atribuic locusului de recunoastere (7 nucleotide) situat laodistanta de 25 nucleotide de locusul de legare si circa 10 nucleotide de punetul de initiere (+1), Punetul de start al transcrierii va dicta capatul 5’ al transcriptului primar RNA. Promotorii suntsituati inamonte sinotafi cu minus (conventional). Secvengele in aval fafa de punctul de start sunt notate cu plus.Se considera cd secvenfa Pribnow la procariote sau Hogness la eucariote e responsabild de exactitatea initierii (fig. 2.26). Punetul de iniiere A. Promotorul procariot oni ois 2 Seevente Pribnow “UTR, __ Transcript RNA B, Promotorul evcariot Hogness Since ae (NAP T 40.200 bp 25.3509 mam CCC CAAT ox GCeasete CAAT casete TATA easete Quik, “Transcript RNA Punetul start C.Promotoruleucariot —} 450 +70 +80 +90 (5stRNA) —— 5 Transcript Figura 2.26. Secventele ipice in promotor la pro-siewcariote 2. Sigma activeaza identificarea secventelor de RNA-polimeraza. 3. De asemenea ia parte la desfacerea dublului helix al DNA pentru ca aceasta si serveasca drept matrice si conlucreazi la formarea primei legaturi fosfodiesterice in noua catenda RNA. Complexul de initiere e format, sigma-subunitate ¢ disociata de la holoferment si corfermentul continu procesul de elongare. Sigma se atageaza la alt corferment si ia parte lainitierea unui altciclu de transeriere fig. 2.27). 1. Blongarea decurge dupa acelasi mecanism descris mai sus. O molecullide RNAp sintetizeazi tot transcriptul —fenomenul e procesiy si activeazi cu o vitezi de SO cleotide pe secunds (fig. 2.28), RNAp nu controlea7a catena sintetizata, reducindu- -131-| 3037 © Enzimacor __ a Figura 2.27. Initierca rranserierii si formarea complexului de niiere.Reciclarea factoralui sigma Catena parent se precizia. Se comite o greseali la 10° nucleotide san de 10° mai multe decit in DNA. IIL Finalizarea transcrieri: se reglea- Zi foarte fin, la nivelul unor secvente nu- cleotidice specifice de pe catena DNA ce contin un numar mare de G, C, T, recu- noscute de RNAp Un ral insportant il jo- ci proteina p (rho), care se asociazit cu cenzima si se misc cu ea. La identificarea semnaleleor de terminare coboari de pe matrice, incetind actiunea enzimei si producind transeriptul cu folosirea ener- gici ATP. Transeriptul obtinut ¢ autocomplementar si poate forma pe- rechi de baze, cea ce genereaza struc- ‘uri simetice,favorizind expulzarea hui din puvees (fig. 2.29). acai catena se extinde in directia 5! — 3, este evident cd enzima RNA- polimeraza se misc pe DNA in directia 3) —» 9 (antiparalel). ala (©) Directiatranscripie} Figura 2.28, Transeripra ta Ecol. a) RNAp si procesele ce sunt eawzate de activtate ei, b) directa elongarii, -132-Dup’ procesul de transcriere con- tinui formarea moleculelor functional active de RNA — asa-numitul procesing, care consti in urmatoarele: 1. «Cap»-area. La capatul 5' este —aata aditionati guanozina metilati. in proces sunt utilizate ca substrat GTP, iar donator de grupe CH, este adenozilmetionina. Sunt implicate enzimele: fosfohidrolaza, guanil transferaza si metil tansferazele. 2.Poliadenilarea, La3'—osecven- amare de A (100-200). Acest fe- nomen are loc pind la terminarea sintezei intregii molecule (e catalizat de poli-A~ polimeraza). Astfel de “coada” e necesard pentru exportul moleculelor de RNA din nucleu. 3. Semodificd bazele si resturile glucidice—2'-OH este metilat& (1:100) de S'~ adenozilmetionina, la procatiote—G-dimetil-adenina, se atesté in (RNA, de altel sipseudouridilatl, ibotimidilatul. 4, Modificarea intensiva pe care o sufera transcriptul primar consti in scurtarea lui ‘S-a constatat ci mRNA nuclear este mult mai lung decit acelasi MRNA ajuns in citoplasma. S-a ajuns la concluzia ck RNAp realizeaza o reproducere primari identic’ cu intreaga gend, apoi intronii sunt excizati si exonii se leag’ intre ei formind mRNA matur, traductibil (fig 2.30). | DNA intron Figura 2.29, Terminarea independenti de Rho comeum | comp pina mel pir 4 Segventenecodifeate 8 CClivate, poliadenilarea sisplaisingal i V/ MRNA 5) Senn AAA 9 Figura 2.30, Formarea teanseriptului primar si maturigarea RNAm la eucariote -133-Secventele intronilor au dimensiuni de 10-100 ori mai mari decit exonii Cum se manifesta excizia intronilor? Asa-numitul splicing are loc in mucteul celule. a) unele enzime specifice identifica seevenfele de baze la jonetiunea intron-exon (excizia pe introni este o excizieincorecta siconduce la generarea unui RNA inactiv ce contine un intron rezidual. in unele B-talasemii are loc descresterea sintezei a lanurilor B-globina); ’b) inexcizia intronilor un rol important fi revine unei categorii de RNA nuclear cu ‘mas moleculara mic, desemnat RNA U (snRNAS),care are oseeventiabazelor complementarii cu secventele de la capetele tiecdru: tron, Intronn sunt scosi de RNA nuclear i capetele exonilor corect juxtapuse, apoi sunt sudate intr-un aparat enzi- matic specializat (fig. 2.31); Intron, OH a tee Re berate ta ° {ua} FR SAS i RNA di 5 ‘UpU! OH") Figura 231. Sudarea exonitor si excicia intonitor de snRNAS ) Thomas Cech a stabilit ¢& pentru excizia intronilor sisudarea exonilor in epru- beta enevoie numai de RNA, ioni Mg™* si guanozin. Molecula in spatiu ocupi atare pozitie, incitcapetele secventei de introni se localizea7A foarte aproape. Excizia $i sudarea decursd in regim autocatalitic, unde singura RNA —segmental intron —denotit ‘comportamentul enzimei. Guanozina initiaz procesul, iar Mg?” stabilizeazi structura de RNA -autosplicing. Astfel de RNA a fost denumit ribozim. Ribozimul de 10" ori mai repede scindeaza legatura fosfodiestericd deeit prin hidroliza nefermentativa. -134-Prezenta RNA catalizii e demonstrat in multe studi. S-a depistat, bundioarii, o enzima (Escherichia coli 5.2.) RNA-aza P cu o funetie specified —la maturizarea tRNA taie din molecula precursoare un fragment la un capat. Enzima e compusd din compartment proteic sinucleotidic. in unele conditi, enzimaeste efectiva si firi componenta proteicd si nu contrar, cum era de asteptat. Unele compartimente ale enzimei pot scinda nu RNA, ci polizaharide— ceva nou in enzimologie. Demult s-a observat ci extragerea moleculelor mari intacte de RNA e dificil. $inumai dupa descoperirea ribozimelor, s-aclarificat e3 RNA-aza activ’ este atributul constant al moleculelor de RNA. Ribozinul scindeaz§ molecula de RNA conform combinatiei = CUCU =, ceea ce se poate aplica in practic pentru scindarea RNA virotica sia celei de SIDA. Transcriptia si translatia au loc in diferite compartimente ale celulei. Replicarea, transcriptia pot fi modulate prin intermediul diferitelor substante. Efectul preparatelor medicinale sunt ilustrate in figura 2.32. Cronomicina Profla [chinimieina Et Hedamicina ‘Dauornicina Netropsina Nogalamicina Mlinicion Distamicina Cloroquina Negare lcomicina MiraclD f\ Aetdnanidine ‘Kancanomicina ino-/Steptonigrina | |, Alcoa! Lteeskirina sce; aoe fenetl Antramicina ) No Nucleaids “SU / swf oN Rifampicin”——cramanitina Bazelialogge —\.Araserna Sweptovaricina Nucleotide Metotexat igura 232, Locul aclunll unor medicamente .Ofixare noncovalents cu DNA, ce impiedied replicarea ‘Se leaga rigid in duplex, jometionind cu guanina si inhibind activitatea DNA ea matice pentru RNA limeraza (inka transcrip). Actioneaza similar: doxorubicina (adriamicina), cronomicina A yi amicina. Se fxeuzi de DNA, flr a modifi sructura helsului Medlicamente ce rip punt in DNA. Preparate ce formeazi legturi covalente itr spralcle de DNA. Substante ce fxindu-se in bifurcatie impiedicdreplicarea, Inia sigma s beta subunit de RNAp,ingrenindinitierea procesuui de transripfic. Ine RNA-polimeraza II (-amanitna etc): preparaele ce contin plating (cisplatin yi carboplatina) 1c jormare legaturdortransversalein DNA Structura subnucleozomic’ acromatinei se mentine in procesele de transcriere si \licare.Dret matrice serveste complexul DNA histonic, dar nu DNA liber. RNA tse impacheteazi in complexe ribonucleoproteidice. DNA netranscriptibil (linker) ia parte la procesul_ de reglare a transcrierii, servind t promotor pentru RNAp ILElementele mai importante sunt blocurile TATA si CAAT situate a o distangiide 25- 100 pn dela punctul de inifiere. Este descrisa prezenta unor elemente reglatoare localizate in diferite regiuni ale DNA, numite enhancers sisilancers. Se presupune o modalitate anume in impachetarea RNA. Dupai cum impachetarea DNA in cromatin e meniti si determine functionarea ei normal in celul’, procesul (insuficient studiat) condensariiRNA cu proteinele nucleicee necesar pentru decurgerea perfect a procesingului primar—RNA transcript cu transportul lor in citozol. Se stie cAnnmai 5% din masa totallia RNA transcript piriseste nuclenl celular. Semnalele specifice care servese ca permis pentru parsirea nucleului nu suntidentificate. E do- vedit faptul ci astfel de semnale aparin procesul de splicing al RNA. S-a argumentat c& daca in secventa nucleotidica nu sunt intronii, RNA transcript va imine in nucleu. Particularitifile transcrierii a eucariote Procesul de transcriere la eucariote este foarte complex, desi in principiu decurge dup’ acelasi mecanism ca gi a procariote. a) Daca la procariote toate tipurile de RNA sunt sintetizate de acceasi RNA- polimerazi, la eucariote intervin mai multe tipuri, ficcare transcriind seturi diferite de gene. De asemenea, dacd la procariote RNA-polimeraza era formata din 5 subunitati la eucarivte acestea sunt constituile din 9-11 subunitai Insinteza RNA la eucariote intervin patru tipuri de polimeraze: trei expuse mai sus $1 alpatrulea tip - RNA-polimeraza mitocondrialA ce sintetizeazi toate tipurile de RNA mitocondral RNA-polimeraza II si RNA-polimeraza III sintetizeaza gi RNA nuclear de mici dimensiuni. Fiecare tip de RNA-polimerazi utilizeaz3 promotor diferiti, acestea find extrem de variafi pentru RNA-polimeraza II care produce sinteza mRNA. Dacii considerim pozitia de start 1 (locul unde incepe transcrierea genei structurale RNA. polimeraza It) existi mai multe regiuni care conditioneaz’ aceasta povitie: n pozitia 35 se afl caseta Hogness care este recunoscutii de RNA-polimeraza Il si prin urmare e responsabila de acuratetea transcrierii; - spre capaitul 5, la o distant mai mare de promotor se afl caseta CAAT, care se pare ci este responsabili de freeventa cu care se transcrie gena structural. Elementele de control enhancers si silancers isi exercit& actiunea mumai in urma interactiunii cu niste proteine specifice numite factori de transcriere, care induc modifica inmolecula de DNA, avind ca rezultat modificarea vitezei de transcrierea genei +) Laencariote transcrierea se realizeazi pe DNA complexat innnucleozomi, fra si fie necesarii desprinderea lui. ©) Freeventa cu care se transcrie 0 gend este foarte diferitS si depinde de necesarul de proteina codificati de gena respectiv’ Pentru majoritatea genelor transcrierea se face rar, astfel ineit transcriptaza parcurge {ntreaga gend inaine cao alt& transcriptaza si se lege. Pe alte gene insa transcrierea are oc cu freeventé mare; este vorba de genele care codificd sinteza unor proteine de care ‘organismul are nevoie in cantitate mate. [n acest caz-de gen’ se leag’ simultan mai multe ‘transcriptaze, aledtuind o aga-numiti «unitate de transeriere», -136-4) S-au depistat mecanisme alternative ale procesingului in complexul transcriptional lacucariote(fig.2.32a), Poli A seevens sy Seovesd 9 Seriensl Poll Asecveutt pa YY ‘Transcript, rimary! ‘Transcript primar wae HEE oo op Cctivareasi ive gi —_—s poliadenilarea A, } poliadeilarea A, A oh Splaisingut WD, »»». WEEE, mRNA matur (a) ‘mRNAmatur 6) Figura 2.32a, Mecanisme alfernative ale procesinguluila eucariote e) RNA now-sintetizat este impachetat imediat sub forma unor complexe ribonucleoproteice, prin asocierea cu proteinele specifice, Aceste complexe sunt similare nucleozomului, avind forme globulare. 4) Transcrierea DNA Ia eucariote, cade altfel sila procariote, poate fi opr aceasta serealizeaza (fig.2.32) - fie prin distorsionarea structurii DNA astfelincitacesta nu mai poate servica matrice; - fie prin inhibarea RNA-polimerazei Sinteza DNA pe matricea de RNA. ‘In virusii oncogeni s-a identificat o enzima care a completat conceptul exprimat prin “dogma central” a geneticii moleculare, fn care fluxul de informatie are sensul DNA —= RNA —» proteina. Enzima e revers transcriptaza -§i prezintiio DNA polimeraza RNA dependent. Ea poseda proprietatea, patrunzind in celula-gazda, dea sintetiza un hibrid DNA-RNA, adicd pe matricea de RNA a virusului genereaz4o. catena de DNA. RNA viral este degradat enzimatic, iar catena DNA se autoreplica, ddind nastere la dublul helix de DNA, ce confine informatia prezentd in RNA viral. DNA se insereaz in genomul-gazda, avind capacitatea de a se exprima ca protein. Se considera ca fiecare subiect este purtatorul unor gene oncogene neexprimate, fiindun ‘rezultatal patrunderii anumitor retrovirusi in organism int-un moment al evolutiei. in anumite conditii nefavorabile pentru organism, poate aves loc transcrierea, traducerea simalignizarea celulei. Cu ajutorul acestei enzime se poate construi artificial pe orice matrice de RNA un DNA complementar, adic& se pot objine gene sintetice care, prin fehnicile ingineriei genetice, produc mari canttiti de protein’ codificat. -137-Biosinteza RNA pe matrice de RNA Materialul cromozomial al unor virusi RNA este replicat in celula garda sub actiunea unei replicaze — RNA polimeraza— RNA dependenté. Ca rspuns Ia infectia virali, ele se sintetizeazi in celula-gazd3, au o actiune sutprinzatoare, folosind RNA virusului ce se replica. RNA sintetizat nue complementar, ci identic cu al virusulri—RNA viral (+) Catena RNA (-) va servi ca matrice pentru sinteza numeroaselor catene comple- mentare(+) virale, care (RNA viral) vor functiona ca RNA matrice pentru sinteza proteinelor virale (spre deosebire de RNA al retrovirusilor). Lo [i Proteine ;y dq RNA RNA Moleculele fice eal ‘ipl + omoloage’ RNA viral Francois Jacob “Tomas Cech Paul Zamecnik. George Palade -138-