UNIVERSIDAD DEL BÍO- BÍO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD Y DE LOS ALIMENTOS

DEPARTAMENTO INGENIERÍA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRACTICAS
DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS I

Profesor: Juan Esteban Reyes Parra

INGENIERIA EN ALIMENTOS - 2009

 PRÁCTICA Nº 1
NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

El laboratorio de Microbiología de Alimentos, es un lugar convenientemente habilitado donde se

estudia la microflora de interés para la seguridad, salubridad y/o vida útil de los alimentos. En éste
se mantienen y manipulan principalmente bacterias y hongos, incluyendo cepas patógenas de los
mismos, lo que conlleva siempre un riesgo biológico de contaminación. Por esta razón, cuando
maneje cualquier tipo de muestra o cultivo microbiano deberá tomar todas las precauciones
destinadas a evitar la contaminación personal (manos y vestimenta) o del ambiente de trabajo
(mesones, equipos, utensilios, etc.).

También deberá tomar las precauciones necesarias para evitar lesiones con material cortante o
punzante (trozos de vidrio, bisturí, agujas, etc.), quemaduras con objetos calientes o por la
exposición a la llama de mecheros y vapor de agua, así como a la acción de agentes químicos
tóxicos y corrosivos.

En consecuencia y teniendo en cuenta que las actividades que se desarrollan en el Laboratorio de

Microbiología son eminentemente prácticas, es necesario que considere las siguientes Normas
Generales:

PRESENTACIÓN Y SEGURIDAD PERSONAL

1. Será obligatorio llevar puesto un delantal largo de algodón, que deberá estar limpio, sin roturas y
correctamente abrochado. Igualmente, es obligatorio el uso de un gorro o paño que cubra
completamente el cabello.
2. Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
3. Se prohíbe fumar y aplicarse cosméticos en el laboratorio.
4. Se deberá lavar meticulosamente las manos con agua y jabón antes de retirarse del laboratorio.
5. Es recomendable mantener las uñas limpias, cortas y sin pintar.
6. No deben substraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
7. Las personas con un elevado grado de sensibilidad debido a alergias, convalecencia, embarazo,
etc., deberán ponerlo en conocimiento del profesor a fin de adoptar una protección especial.

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

1. Al ingresar no toque o cambie de ubicación el material dispuesto en los mesones. Espere las
instrucciones del profesor o ayudante.

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2. Siempre trabaje en las proximidades de un mechero encendido, pero mantenga los productos
inflamables (etanol, isopropanol, xilol, etc), cuadernos y equipos de laboratorio a una distancia
prudente de éste. Los mecheros se deberán apagar en cuanto dejen de utilizarse y deberá
asegurarse que las llaves de paso queden bien cerradas.
3. Esterilice siempre a la llama del mechero el “asa de cultivo” y “rastrillos de vidrio”, antes y
después de usar. Las asas de cultivo se esterizan calentándolas a la llama del mechero hasta que
se pongan al rojo vivo. Los rastrillos de vidrio se sumergen en una solución de etanol al 70% y
luego se flamean a la llama del mechero.
4. No pipetear con la boca ningún tipo de cultivo microbiano, sin antes comprobar que las pipetas
están provistas de un tapón de algodón hidrófobo.
5. Los tubos que contengan medios de cultivo o cultivo de microorganismos, nunca deben abrirse
en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible; es decir, inclinados, pero evitando
derramar su contenido. Al quitarles la tapa se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán
con la otra, que sostendrá a su vez el asa o la pipeta y la tapa. Una vez abierto, se flamea por
algunos segundos la boca del tubo, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (la
tapa nunca debe dejarse sobre el mesón).
6. Cuando manipule microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la boca,
nariz, ojos, etc. Los lápices y rotuladores o cualquier otro material no beberán entrar nuca en
contacto con la boca.
7. Los medios inoculados o sembrados que se coloquen en las estufas de incubación deberán ir
adecuadamente rotulados, indicando: grupo, número de mesón, nombre del alumno, fecha y
procedencia o naturaleza de la muestra.
8. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia,
al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente su lugar de trabajo. Cada grupo
de prácticas será responsable de su zona de trabajo y del material proporcionado.
9. Todo el material usado (tubos de cultivo, pipetas, placas de Petri, porta-objetos, hojas de bisturí,
etc.) se debe considerar contaminado. Por este motivo, deberán colocarse en los contenedores
adecuados al finalizar la práctica para proceder a su esterilización antes de ser desechados o
lavados. Nunca los deje tirados sobre los mesones.
10. Se deberá dar cuenta inmediatamente al profesor o ayudante de cualquier accidente tal como
quemaduras, cortes y/o derrame de cultivos.
11. En el caso de derrames de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar
la calma y además informar al profesor o ayudante. El procedimiento a seguir es el siguiente: (i)
coloque papel absorbente sobre el material derramado para evitar su dispersión, (ii) ponga
abundante solución desinfectante sobre el papel, (iii) deje transcurrir al menos 15 minutos, retire
el papel (usando guantes) y deposítelo en el receptáculo destinado a la eliminación de material
contaminado, y (iv) vuelva a desinfectar la zona.

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MANIPULE CON CUIDADO EL MATERIAL DE LABORATORIO

1. No someta a calentamiento excesivo el material de vidrio, con ello evitará trizaduras o roturas de
los mismos.
2. Todos los instrumentos o equipos, especialmente los aparatos delicados como lupas y
microscopios, deben manipularse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
Siempre deberá dejar limpios todos los equipos utilizados, las lentes de los objetivos deberán
limpiarse sólo con los líquidos y material suministrados. Informe cualquier irregularidad en el
funcionamiento de los equipos.
3. Evite exponerse en forma directa al aire caliente del horno Pasteur, al vapor a presión del
autoclave y a la llama del mechero Bunsen o de alta caloría.
4. Manipule con extremo cuidado los reactivos inflamables (xilol, etanol, isopropanol, etc.) y los
ácidos o bases fuertes (HCl y NaOH).

PRINCIPALES OBLIGACIONES DE LOS ESTUDIANTES

1. Concurrir puntualmente al laboratorio, prevenga con anticipación cualquier eventual demora. No

se permitirá el ingreso a alumnos atrasados.
2. Será obligatorio concurrir al laboratorio con su delantal, gorro, manual de trabajos prácticos y un
lápiz para marcar vidrio (indeleble al agua).
3. Prepare cada sesión práctica con anticipación, ya que será evaluada en cada práctico. La
evaluación no se referirá exclusivamente a la información que aparece en el manual, sino
también a la aportada por el profesor y/o ayudante, así como a la de sus propias observaciones
y/o conclusiones.
4. Tome nota de las instrucciones que se den, pregunte si tiene alguna duda.
5. No comience a trabajar hasta estar seguro de lo que debe realizar.

ACTIVIDADES:

1. Se discutirán las principales normas de seguridad y obligaciones que deberán tener en cuenta
durante su permanencia y trabajo en el Laboratorio de Microbiología.
2. Se mostrarán los diferentes equipos, aparatos y materiales que se utilizarán en las sesiones
prácticas, destacando su funcionalidad y la forma apropiada de uso.
3. Se demostrará la forma apropiada de manipular cultivos microbianos contenidos en tubos y
placas de Petri.
4. Se discutirán los principales riesgos (biológicos, físicos y químicos) a que están expuestos sino
siguen las Normas Generales del Laboratorio de Microbiología, destacándose la forma correcta
de proceder en caso de accidentes comunes.

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 PRÁCTICA Nº 2
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
(ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES)
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no solamente en el
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA, donde son fundamentales para evitar la contaminación
de medios de cultivos, placas, utensilios, etc., sino también en otros ámbitos tales como la
INDUSTRIA DE ALIMENTOS, donde fallas en estos procedimientos puede acarrear la
disminución de la vida útil de los alimentos debido a cambios organolépticos ocasionadas por el
desarrollo de microorganismos alterantes (sacarolíticos, pectinolíticos, proteolíticos, lipolíticos,
etc); o bien, provocar toxi-infecciones alimentarias por la presencia y/o desarrollo de
microorganismos patógenos.

La presencia de microorganismos alterantes (saprófitos) y patógenos es común en el ambiente de la

industria de alimentos. Éstos se pueden encontrar en el suelo, agua, aire, superficies de mesones,
equipos, utensilios materias primas vegetales y animales e incluso en el propio personal. Por esta
razón, es preciso conocer los métodos más comunes utilizados para controlar, inhibir o destruir
microorganismos, tanto en el laboratorio de microbiología como en la industria de alimentos.

DEFINICIÓN DE TÉRMINOS

1.- Contaminación microbiana: Se refiere a la presencia de agentes microbianos (bióticos) en la

superficie del cuerpo u objetos inanimados (superficies de trabajo, equipos, utensilios,
vestimenta, etc.), incluyendo bebidas y alimentos.
2.- Esterilización: Es el proceso destinado a destruir toda forma de vida microbiana de un substrato
determinado, incluyendo las estructuras de resistencia producidas por ciertas bacterias (esporas).
Un objeto estéril, en sentido microbiológico, está libre de microorganismos vivos.
3.- Desinfección: Es proceso mediante el cual se inactiva o destruyen los microorganismos
indeseables (patógenos o alterantes) por medio de la exposición directa a agentes químicos. La
desinfección no implica necesariamente esterilización, ya que sólo destruye las formas en
desarrollo de los microorganismos (células vegetativas) y no las esporas de bacterias.
4.- Desinfectante: Es un agente (usualmente químico) capaz de matar las células vegetativas de los
microorganismos, pero no necesariamente sus esporas. Estos agentes, por su toxicidad, sólo se
utilizan sobre objetos inanimados (nunca sobre tejidos vivos: piel o mucosas).

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5.- Antiséptico: Es un agente químico que impide el crecimiento o la acción de los
microorganismos, ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Por ser menos
tóxicos se pueden aplicar sobre tejidos vivos (piel y mucosas).
6.- Limpieza: Es el proceso de remover, por medios mecánicos y/o físicos, el polvo, la materia
orgánica y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales, personal, etc. Las
soluciones limpiadoras generalmente contienen agentes alcalinos o ácidos, con o sin
detergentes, por ejemplo, agentes tensioactivos no iónicos. Éstas deben ser compatibles con la
superficie que va a ser limpiada, tener buena capacidad de humectación y emulsificación,
además deben ser capaces de remover el tipo de suciedad presente sin dejar ningún tipo de
residuo.
7.- Sanitización: Es el proceso destinado a reducir el contenido de microorganismos viables
remanentes en una superficie limpia. En la industria se emplea este término cuando se tratan,
con agentes químicos o físicos, las áreas de producción y los equipos empleados en la
elaboración de productos, con el propósito de reducir el contenido microbiano hasta niveles
insignificantes.
8.- Sanitarizante: Es un agente químico que reduce la población microbiana a niveles seguros (no
peligrosos). Se aplican a objetos inanimados de uso diario en la industria de alimentos; por
ejemplo, superficies de trabajo, equipos, recipientes y utensilios.
9.- Germicida: Es un agente que mata a los microorganismos, pero no necesariamente a sus esporas.
10.- Agente bactericida: Es un agente que mata bacterias. Afecta las células vegetativas, pero no
necesariamente a sus esporas, en forma tan grave, que no pueden continuar su reproducción aún
después de retirada la sustancia.
11.- Agente bacteriostático: Es un agente que impide o inhibe la multiplicación de bacterias,
mientras permanece en contacto con ellas.
12.- Agente fungicida: Es un agente que mata hongos y sus esporas. Afectan a los hongos y sus
esporas, en forma tan grave, que no pueden continuar su reproducción aún después de retirada la
sustancia.
13.- Agente fungistático: Es un agente que inhibe el crecimiento de los hongos, mientras permanece
en contacto con ellos.
14.- Agente virucida: Es un agente que destruye o inactiva virus.
15.- Agente esporocida: Es un agente que destruye o inactiva esporas.

MÉTODOS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS

Los microorganismos pueden ser controlados, inhibidos o eliminados por medio de agentes físicos,
mecánicos o químicos. Existe una gran variedad de técnicas y agentes de control que actúan de
maneras diferentes y cada uno presenta sus propias limitaciones. Por ello, su elección depende del
tipo de microorganismos que se desean eliminar y de las superficies o materiales sobre los cuales se
va aplicar.

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I.- CONTROL POR MÉTODOS FÍSICOS

1.- ALTAS TEMPERATURAS

Los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su

óptima de crecimiento. Esto permite utilizar las altas temperaturas para eliminar microorganismos
por termodestrucción. Los métodos basados en el calor son quizás los más utilizados para controlar
el crecimiento microbiano, principalmente por su facilidad de controlar, bajo costo y efectividad.
Las altas temperaturas pueden ser aplicadas tanto como calor húmedo o seco. El calor seco destruye
los microorganismos principalmente por oxidación de sus componentes intracelulares y se
requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a
temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno
responsables de la estructura terciaria de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y
pierdan por tanto su funcionalidad, por lo cual su acción se basa en la coagulación del protoplasma
celular.

A. -CALOR SECO

La esterilización por calor seco puede hacerse por incineración (flameado) o mediante estufas de
aire caliente:

• Incineración (Flameado): Se emplea para esterilizar asas de siembra, pinzas, espátulas, etc.
Consiste en someter directamente a la acción de la llama del mechero Bunsen los utensilios que
se desean esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede
aplicar a objetos combustibles y termolábiles. En el caso del asa de siembre, el filamento de
nicrom se debe exponer a la llama hasta quedar al rojo vivo. En cambio, pinzas y espátulas
previamente deben ser sumergidas en una solución de etanol (70% v/v), escurridas y flameadas a
la llama del mechero hasta la completa combustión del etanol.

• Aire caliente (Horno Pasteur): Consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar,
debidamente protegidos (envueltos en papel) para que no se contaminen una vez esterilizados, en
el interior de un Horno Pasteur. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio
(pipetas, matraces, tubos, etc.) u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se
someten estos materiales son muy elevadas (160-180ºC durante 2 horas) con el fin de asegurar la
total eliminación de bacterias y sus esporas. Estas temperaturas no pueden utilizarse para
esterilizar preparados acuosos (como medios de cultivo: agares o caldos), ya que al llegar a los
100ºC comenzarían a hervir con la consecuente evaporación de su fracción líquida. El material
que se desea esterilizar debe estar seco, envuelto y ordenado de tal manera que el aire caliente
pueda distribuirse homogéneamente por todo el material. El tiempo de esterilización se tomará

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 cuando el horno alcance la temperatura de esterilización (160-180ºC). Antes de sacar el material
del horno, éste debe dejarse enfriar para evitar que se rompa por el cambio de temperatura.

B.- CALOR HÚMEDO

• Ebullición (Baño María): Consiste en poner el material en contacto con agua hirviendo (100ºC)
por un periodo no inferior a 10 minutos (comúnmente entre 15 a 30 minutos). Tiene una acción
limitada, pues si es aplicado durante el tiempo señalado sólo destruirá las formas vegetativas de
los microorganismos, no destruirá las esporas bacterianas que son “termorresistentes” (pueden
soportar hasta 3 horas a 100ºC). Este método tiene una acción limitada, se utiliza sólo con fines
de desinfección, cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros
métodos más eficaces. Usualmente se utiliza para la desinfección de utensilios, paños,
recipientes o medios de cultivos que no puedan esterilizarse en autoclave. También se puede
emplear en el control de microorganismos presentes en el agua de consumo.

Una variante de esta técnica es la Tyndalización, que consiste en someter el material a

“esterilizar” a baño María o vapor fluyente durante 3 días consecutivos, dejándose a temperatura
ambiente en los intervalos entre 2 tratamientos consecutivos. La muestra se somete a
calentamiento (100ºC) durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas
vegetativas, pero no las esporas. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después
del calentamiento y luego serán destruidas en los siguientes ciclos.

• Vapor saturado a presión (Autoclave): Esta técnica requiere el uso del autoclave, que basa su
acción en temperaturas elevadas y presión de vapor de agua. Tal combinación permite esterilizar
con gran seguridad el material contaminado, principalmente medios de cultivos, fluidos
termoestables, material quirúrgico y alimentos enlatados. Es uno de los métodos más eficaces de
esterilización, ya que destruye todos los microorganismos, incluyendo las esporas de bacterias.
Los parámetros de esterilización más frecuentemente utilizada para esterilizar el material de
laboratorio son 121ºC//15 Lb/pulg2//15 minutos. En el caso de conservas dependerá del tipo de
producto y de su acidez; por ejemplo, para productos de baja acidez (pH >4.6) se aplica la
cocción botulina 121ºC//15 Lb/pulg.2/2.52 minutos).

Instrucciones para usar el autoclave que se encuentra en el laboratorio de microbiología

1.- Verifique que el nivel de agua sea el indicado. Si falta, agregue de preferencia agua destilada.
2.- Introduzca el material que va a esterilizar en forma ordenada y espaciada para que la
distribución del vapor sea homogénea.
3.- Tape el autoclave apretando las manillas en forma cruzada.
4.- Asegúrese que la válvula superior esté abierta.
5.- Encienda el autoclave.

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6.- Al alcanzar una temperatura de 80-90 ºC cierre la válvula superior y, espere que alcance la
temperatura y presión de esterilización (121 ºC- 15 Lb/pulg.2). Una vez alcanzada la
temperatura y presión deseada tome el tiempo de esterilización (15 minutos).
7.- Al cumplir el tiempo de esterilización, apáguelo. No abra hasta que la presión en el interior del
autoclave llegue a cero.
8.- Por último, retire el material del autoclave. El material para desechar se debe vaciar en el
recipiente destinado para ese objetivo. En cambio, los medios de cultivos que se van a utilizar
deben enfriarse y guardarse en el refrigerador (2-8ºC).

• Pasterización: Es un tratamiento de calor controlado, donde se emplean temperaturas inferiores

a la de ebullición del agua, que se aplica a ciertos tipos de alimentos (vinos, cerveza, zumos,
leche, etc.) que no pueden ser tratados a temperaturas altas, pues podrían perder algunas de sus
propiedades biológicas u organolépticas (principalmente, destrucción de vitaminas). Su objetivo
es eliminar microorganismos patógenos y reducir la población de microorganismos alterantes.
No puede ser considerado como un método de esterilización, ya que no elimina la totalidad de
los gérmenes presentes en el producto; además las esporas de bacterias resisten los tratamientos
convencionales de pasterización. La temperatura seleccionada para el proceso de pasterización
se basa en el tiempo letal térmico representativo para los tipos más resistentes de
microorganismos patógenos que deberán ser destruidos mediante este procedimiento. Para la
pasterización de la leche se utilizan temperaturas de 62.8 ºC durante 30 minutos (Tratamiento
LTLT: Low Temperatura, Long Time) o 71.7ºC durante 15 segundos (HTST: High
Temperatura, Short Time). También se pueden utilizar temperaturas superiores a la ebullición
del agua, pero durante unos pocos segundo; por ejemplo, 148.9ºC durante 2-3 segundos (UHT:
Ultra High Temperature). Los tratamientos térmicos señalados permiten reducir
considerablemente la carga microbiana total presente en la leche cruda (alargando cono ello su
vida útil o comercial) y aseguran la destrucción de bacterias patógenas comúnmente vehiculadas
por este alimento (Brucella spp, Staphylococcus aureus, Mycobacterium bovis y Coxiella
burnetti).

2.- RADIACIONES

A.- RADIACIONES IONIZANTES

Estas incluyen las radiaciones beta “ß” y “X” (producidas por electrones acelerados o rayos
catódicos) y las radiaciones gamma “γ” (producidas por radioisótopos: 60Co). Estas radiaciones al
ser absorbidas por el agua y otros componentes celulares (ácidos nucleicos, enzimas y lípidos) se
ionizan, creándose radicales libres que ocasionan daños, principalmente a nivel de ADN
(mutaciones) y proteínas (enzimas), que conllevan a la muerte del microorganismo. A la
esterilización mediante radiaciones ionizantes se le denomina esterilización fría, ya que producen
relativamente poco calor en el material que se irradia.

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• Radiaciones γ (gamma): Las radiaciones gamma poseen un gran poder penetración y, por lo
tanto, posee un elevado poder de destrucción de microorganismos; sin embargo, puede ajustarse
la dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes. La principal aplicación industrial es
para la esterilización de materiales quirúrgicos y otros equipos médicos sensibles al calor y para
la preservación de ciertos productos alimenticios. Las principales ventajas de estas radiaciones
es que pueden aplicarse sobre productos envasados y a temperaturas bajas. No obstante, posee
algunas desventajas, tales como: (i) altera algunas vitaminas (C, E, A y B1), (ii) los alimentos
pueden adquirir un mal sabor debido a la generación de radicales libres a partir de lípidos
(rancidez oxidativa), (iii) no destruye virus ni toxinas, (iv) tienen un costo elevado (requieren un
riguroso control e instalaciones especiales), y (v) presenta una baja aceptación por parte de los
consumidores.

B.- RADIACIONES NO IONIZANTES

• Radiaciones ultravioleta (U.V): La luz U.V es normalmente producida por la luz solar,
pudiendo además ser obtenida por lámparas de mercurio de baja presión. El intervalo
germinicida se ubica a una longitud de onda entre 240-280 nm, pero su máximo poder letal se
manifiesta 253.7 nm. La luz U.V no produce ionización, sino que son absorbidas en forma
específica por proteínas y ácidos nucleicos, donde excitan electrones y los elevan a niveles
mayores de energía, creando diferentes especies químicas que producen alteraciones a nivel de
proteínas y ácidos nucleicos, entre ellas la formación de dímeros de pirimidina adyacentes que
inducen lecturas erróneas del código genético, produciendo mutaciones que impiden funciones
vitales de los microorganismos y, por lo tanto, la pérdida de la viabilidad de las células (muerte
celular). Este tipo de radiación tiene una aplicación limitada como método de desinfección,
debido a su bajo poder de penetración y a que las partículas circulantes en el ambiente ejercen un
efecto protector (absorben ellas mismas las radiaciones UV). Su uso está principalmente dirigido
a la desinfección ambiental (quirófanos, laboratorios, cámaras de atmósferas controladas) y a la
desinfección de superficies lisas, las que previamente deben ser tratadas con un agente químico
(etanol o isopropanol al 70% v/v). También puede ser aplicada para la desinfección
(potabilización) del agua de bebida. El tiempo de exposición no debe ser inferior a 30 minutos.

II.- CONTROL POR MEDIOS MECÁNICOS

• Filtración: Consiste en el paso de un líquido, gas o aire a través de una membrana o filtros
bacteriológicos que tienen poros lo suficientemente pequeños para retener a los
microorganismos (≤0.22 µm).
o
o Filtros de membranas: Son filtros de membranas de ésteres de celulosa, que se utilizan para
esterilizar soluciones que no pueden ser tratadas por calor (es decir, termolábiles), tales como la

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 urea, hidratos de carbono y antibióticos. Esta técnica se aplica a un producto antes de envasar,
por lo que es imprescindible que el recipiente en que se va a recolectar o guardar esté
previamente esterilizado. Esta operación tiene las ventajas de poder realizarse a temperatura
ambiente y ser capaz de eliminar tanto los organismos vivos como los muertos presentes en una
solución.
o
o Filtros HEPA: Son filtros de aire de gran eficiencia que forman parte de las campanas o cámaras
de flujo laminar, donde se utilizan para filtrar el aire y así obtener un ambiente libre de polvo,
bacterias y hongos (incluyendo esporas).

III.- CONTROL POR AGENTES QUÍMICOS

Existe una amplia gama de productos químicos utilizados para reducir o eliminar microorganismos,
ya sea desde superficies inanimadas (desinfectantes) o tejidos vivos (antisépticos). La acción
desinfectante o antiséptica de los agentes químicos se encuentra influenciada por los siguientes
factores:

1.- Concentración del agente.

2.- Tiempo de exposición.
3.- Temperatura (a menor temperatura, menor es su acción).
4.- pH.
5.- Estado fisiológico de las células (las células jóvenes, metabólicamente activas, son más
fácilmente destruidas que las células viejas).
6.- Tipo de microorganismos presentes en el medio.
7.- Número de microorganismos presentes en el medio.
8.- Naturaleza del material que se encuentra presente junto con los microorganismos (por ejemplo,
la materia orgánica interfiere con algunos agentes).

DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS DE USO FRECUENTE

• ALCOHOLES (etanol e isopropanol)

Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región hidrocarbonada de los
lípidos. Éstos poseen una rápida acción bactericida, actuando sobre células vegetativas de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas, también actúan sobre virus con envoltura. No tienen efecto sobre
las esporas bacterianas, por lo que no son esterilizantes, sino más bien son considerados como
desinfectantes de bajo nivel. Su actividad depende de la concentración, siendo siempre más
efectivos en soluciones acuosas al 70%, ya que necesitan agua para mejorar su efectividad puesto

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que ésta le permite penetrar mejor en las células y, además retrasa la evaporación y aumenta el
tiempo de contacto, permitiendo así la desnaturalización de proteínas.

El etanol o alcohol etílico se utiliza como antiséptico de la piel (antes de inyecciones cutáneas) y en
la desinfección de termómetros clínicos. En el laboratorio de microbiología se utiliza para
desinfectar utensilios como pinzas, espátulas y asas de vidrio. Éstos se sumergen en etanol al 70% y
seguido se pasan por la llama del mechero (flamean) hasta la completa combustión del etanol.

El isopropanol (alcohol isopropílico), es menos volátil y más efectivo que el etanol. Se emplea
igualmente en la desinfección de termómetros; sin embargo, su efecto tóxico (narcótico) es mayor y
más duradero que con el etanol. En el laboratorio de microbiología se utiliza preferentemente para la
desinfección de superficies (mesones y plataforma de trabajo de la cámara de flujo laminar) y para
controlar salpicaduras o derrames de cultivos sobre superficies u objetos de trabajo.

Los alcoholes se inactivan en presencia de materia orgánica.

• COMPUESTOS HALOGENADOS

Los compuestos halogenados son bactericidas muy potentes. Así por ejemplo, el yodo no tiene
parangón como antiséptico de la piel y el cloro no tiene igual en el tratamiento de aguas.

Los compuestos halogenados son agentes oxidantes que inactivan enzimas (proteínas), convirtiendo
los radicales -SH en disulfuros -S-S. Además, los más potentes también atacan radicales amino, el
grupo indol (presente en el triptófano), y la tirosina.

Yodo: Es un bactericida muy eficaz, es el único que actúa contra todos los tipos de bacterias (Gram
positivas y Gram negativas), hongos y virus; también posee cierta actividad esporocida. Es un
agente oxidante débil, pero en adición a este efecto, se combina irreversiblemente con residuos de
tirosina de las proteínas. Presentan ciertos inconvenientes, tales como: (i) precipita en presencia de
proteínas, (ii) producen manchas en la ropa y piel, (iii) es irritante y alergénico, y (iv) retarda la
cicatrización de heridas, sobre todo si se aplica en forma continuada.

Sus principales presentaciones son la “tintura de yodo” y los “iodóforos”.

La tintura de yodo, es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en etanol al 70%. Es un magnifico

antiséptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un efecto doloroso y cáustico
en heridas abiertas.

Los iodóforos, son una mezcla de yodo con agentes tensioactivos (detergentes), formando así un
complejo que libera lentamente yodo orgánico cuando se diluye en agua. El yodo penetra fácilmente

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en los microorganismos a través de sus membranas celulares, destruyendo las proteínas. Son
bactericidas de potencia intermedia, su actividad es menos intensa que la de la tintura de yodo y
menos rápida, pero si se deja el tiempo suficiente afecta a formas vegetativas de bacterias, hongos,
virus y esporas en menor grado. Su actividad se reduce en presencia de sustancias alcalinas y
materia orgánica. Son corrosivos para los metales. El más conocido de los yodóforos es la povidona-
yodada (compuesto de yodo y polivinil-pirrolidona), que contiene entre un 9 y 12% de yodo
disponible. Se utilizan preferentemente como antiséptico de la piel y mucosas, y lavado de manos
antes de intervenciones quirúrgicas. También se emplean en la desinfección de instalaciones de
industrias de alimentos.

Cloro y compuestos clorados: El cloro se presenta bajos las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y
cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberación de cloro libre (Cl2), que reacciona con el
agua para dar ácido hipocloroso, que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte.

El cloro es activo contra la mayoría de las células vegetativas de bacterias y sus esporas, virus y
hongos. Actúa por oxidación de los componentes celulares.
El cloro gaseoso, a 1-3 ppm, se usa para la potabilización de aguas para bebida y piscinas.

Los hipocloritos de sodio, de calcio o de litio se utilizan para la desinfección de frutas y hortalizas
(50-200 ppm). También se emplea como desinfectante/sanitizante (300-500 ppm) de baños, pisos,
paredes, superficies, equipos y utensilios de hospitales, laboratorios e industrias de alimentos.
Como el cloro se inactiva con la materia orgánica, primero habrá que limpiar con agua y jabón,
enjuagar abundantemente y posteriormente, desinfectar. Las superficies (excepto pisos y paredes),
equipos y utensilios tratados necesitan ser nuevamente enjuagados.

Los hipocloritos son baratos y de acción rápida. Sin embargo, se ha de tener en cuenta que son
desinfectantes que deterioran los metales (corrosivos), que se inactivan fácilmente en presencia de
materia orgánica, son relativamente inestables y su eficacia se ve afectada por el pH. Además,
interaccionan con otras sustancias químicas (soluciones ácidas y de amonio), produciendo vapores
de cloro que son muy irritantes para la piel y mucosas. No se deben utilizar en combinación con
formaldehído, ya que esta combinación es altamente carcinógena. Su ingestión provoca graves
lesiones en la mucosa esofagogástrica.

El dióxido de cloro (ClO2), es otro derivado del cloro que está siendo ampliamente utilizado en la
industria de alimentos. Éste no presenta los problemas del hipoclorito de sodio, como generar
derivados halogenados y reaccionar con compuestos nitrogenados, y en contacto con material
proteico no forma cloraminas, ni ácidos trihalometanos o haloacéticos. El tratamiento de alimentos
(frutas, hortlizas y canales de aves y animales de abasto) con dióxido de cloro aumenta su vida
media útil o comercial, sin alterar su calidad organoléptica ni nutricional. Es soluble en agua y su
acción no es afectada por valores altos de pH.

13
El dióxido de cloro es un potente germicida, en comparación con el cloro acuoso posee un poder
desinfectante siete veces superior y una capacidad oxidativa 2.5 veces mayor. Debido a las ventajas
que presenta sobre los hipocloritos, en los últimos años, su uso se ha extendiendo a la industria de
alimentos. Actualmente sus aplicaciones incluyen: (i) la desinfección de superficies ambientales y
equipos, incluyendo aquellos que entran en contacto directo con el alimento procesado; (ii) lavado y
sanitizado de sistemas CIP; (iii) lavado y sanitización de frutas y verduras; (iv) tratamiento del agua
en la industria avícola; (v) fabricación de hielo para conservación de pescados y mariscos; y (vi)
sanitización de canales de pollo, cerdo, vacuno y subproductos de mataderos.

• COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO

Los compuestos de amonio cuaternario (conocidos como "quats") son esencialmente sales de
amonio con algunos o todos los átomos de hidrógeno del ión (NH4)+ substituidos por grupos tipo
alquilo de complejidad variable. Son detergentes o tensioactivos catiónicos que actúan,
principalmente, a nivel de la superficie celular, donde producen la desorganizando (rotura) de las
membranas fosfolipídicas, lo que se refleja en el incremento de su permeabilidad, con la
consiguiente salida de componentes citoplasmáticos. Posteriormente, la entrada del detergente
produce un efecto secundario de desnaturalización de proteínas.

Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad desinfectante. El cloruro de benzalconio
fue el primer compuesto comercial de este tipo introducido en el mercado. Tiene una buena
actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas, pero es menos efectivo sobre bacterias
Gram-negativas, particularmente contra Pseudomonas, la cual incluso puede crecer en las
soluciones de estos productos. También presentan actividad fungicida y virucida sobre virus con
envoltura, pero ésta es escasa frente a virus sin envoltura y casi nula frente a esporas bacterianas,
aunque previene su germinación. Factores como la dureza del agua y restos proteicos interfieren en
su actividad y reducen su eficacia. No obstante, los amonios cuaternarios denominados de segunda
generación (por ejemplo, el cloruro de etilbenzilo) y de tercera generación (por ejemplo, el cloruro
de dodecil dimetil amonio) son compuestos que permanecen activos en presencia de agua dura.

Los compuestos de amonio cuaternario son considerados como desinfectantes de bajo nivel y
comúnmente se utilizan en la industria de alimentos para la desinfección y/o sanitización de
superficies, paredes y pisos (utilizándose a concentraciones del 0.4 a 1.6%).

• BIGUADINAS (Clorhexidina 2-4%):

La clorhexidina es uno de los antisépticos de la piel y mucosas más utilizado. Su espectro de acción
incluye bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (pero su actividad es menor frente a bacterias

14
Gram-negativas), hongos y virus con envoltura. No es esporicida, aunque inhibe la germinación de
las esporas. Su mecanismo de acción se basa en la alteración de la permeabilidad de la membrana
celular y precipitación de proteínas y ácidos nucleicos.

Posee una acción germicida rápida y una duración prolongada, gracias a que esta sustancia tiene
gran adhesividad a la piel, por lo que sus efectos antimicrobianos permanecen hasta 6 horas después
de su uso. Su actividad se reduce por alteración de pH (actividad máxima a pH 5,5-7), dilución con
agua corriente, jabones con aniones orgánicos o inorgánicos. La presentación más común contiene
un detergente como base y un 4% de clorhexidina, y se utiliza para el lavado de manos del personal
de hospitales, laboratorios de microbiología e industrias de alimentos. También está presente en
enjuagues bucales y pastas dentales.

• COMPUESTOS FENÓLICOS

El fenol se ha considerado clásicamente como el antiséptico y desinfectante estándar con el que se

ha comparado la actividad de otros germicidas (coeficiente fenólico). Los derivados fenólicos
inducen una alteración de la permeabilidad de la membrana citoplasmática, lo que produce una
progresiva salida de constituyentes intracelulares, que finalmente provoca la lisis y la destrucción
microbiana. Los fenoles poseen actividad bacteriostática o bactericida (según la concentración),
fungicida y virucida, pero en general no esporicida.

Los derivados fenólicos utilizados como antisépticos se encuentran en 2 grupos: bifenoles y

halofenoles. No obstante, solo se mencionará el triclosán, que se ubica dentro de los bifenoles.

Triclosán (Tricloro-hidroxidifenil-eter): Es muy activo frente a bacterias Gram positivas y Gram

negativas, excepto Pseudomona aeruginosa y otras especies de Pseudomonas. Su eficacia contra
bacterias Gram negativas y levaduras puede incrementarse al asociarse con EDTA, ya que aumenta
la permeabilidad de la membrana externa. En estudios con E. coli, se ha demostrado que el triclosán
a concentraciones subinhibitorias inhibe el consumo de nutrientes esenciales, mientras que
concentraciones más elevadas producen la liberación de componentes celulares y muerte celular. El
triclosán se presenta en jabones a una concentración entre 0.2-0.5 %. Se usa principalmente como
antiséptico para el lavado de manos de tipo clínico, de laboratorios y en la industria de alimentos.

• AGENTES OXIDANTES

Peróxido de hidrógeno (H2O2):

El agua oxigenada es activa frente a bacterias vegetativas, hongos, virus y esporas bacterianas según
la concentración y condiciones de utilización. Su actividad germicida se debe a la destrucción de

15
las membranas celulares, DNA y otros componentes celulares esenciales. Los preparados
comerciales suelen contener concentraciones entre el 3-6% (10-20 volúmenes). Se inactiva
rápidamente en presencia de materia orgánica, luz y contacto con el aire. La forma oxidante activa
no es el peróxido de hidrógeno como tal, sino el radical hidróxilo libre formado por su
descomposición. Las soluciones estabilizadas de agua oxigenada, del 10 al 25%, se utilizan como
agentes esporicidas en la desinfección de materiales especiales (implantes de plástico, lentes de
contacto y prótesis quirúrgicas).

En la actualidad existen en el mercado sistemas cerrados que utilizan peróxido de hidrógeno en

forma de vapores como alternativa para desinfección y esterilización de endoscopios. Estos aparatos
utilizan ciclos que oscilan entre 20 y 25 minutos a temperaturas bajas (25-50ºC) y alcanzan una
concentración final de 1-2 mg/L de H2O2. Una de las ventajas fundamentales es que no producen
residuos tóxicos.
Su uso más frecuente está asociado con la limpieza y antisepsia de heridas; adicionalmente, se está
estudiando su aplicación como sanitizante de frutas y hortalizas mínimamente procesadas.

Ozono (O3):

El ozono es una molécula de oxígeno triatómica altamente inestable, que es formada por la unión de
una molécula de oxígeno diatómico (O2) a un átomo de oxígeno. Este es producido por la
disociación de las moléculas de oxígeno cuando éstas son sometidas a una fuerte descarga eléctrica.
La molécula de ozono es uno de los oxidantes más poderosos que se conocen después del fluoruro,
con una velocidad de reacción tres mil veces superior a la del cloro. El ozono actúa como un agente
fuertemente oxidante, que lo hace muy efectivo para destruir microorganismos (bacterias, hongos,
virus y protozoos). Es más efectivo que el cloro, por ello su uso en soluciones acuosas está siendo
evaluado como desinfectante (sanitizante) de frutas, hortalizas, canales de pollos y animales de
abasto. Este agente posee varias ventajas, por ejemplo: (i) sólo agrega oxígeno a los compuestos
orgánicos, por lo que pocos compuestos formados se consideran dañinos para la salud; (ii) posee un
amplio espectro microbiano; (iii) elimina olores y sabores extraños del agua; (iv) no libera
compuestos tóxicos al ambiente; (v) remueve compuestos orgánicos tales como pesticidas,
detergentes y fenoles; y (vi) no se requiere de un enjuague posterior a su aplicación. No obstante,
presenta algunas desventajas, entre las que destacan: (i) su gran inestabilidad, su reacción es difícil
de predecir en presencia de materia orgánica; (ii) su efecto antimicrobiano se ve afectado a pH
básico; y (iii) es tóxico a bajas concentraciones (≥ 1 ppm), produce irritación de las vías nasales,
ojos y garganta.

La acción antimicrobiana del ozono se basa en su gran poder oxidativo, siendo la superficie celular
el primer blanco de su actividad (cambia la permeabilidad celular), provocando la lisis celular. En
segundo lugar, daña en el material genético debido a los cambios que provoca en las bases
pirimídicas.

16
ACTIVIDADES:

• SESIÓN I: Determinar la presencia de microorganismos en piel y mucosas, así como en el

ambiente del laboratorio.

1.- Exponga una placa de Petri con Agar Nutritivo (abierta/sin tapa) al ambiente del laboratorio
durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, tape la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h.
Como control, incube una placa con el mismo medio de cultivo, pero la cual ha sido mantenida
cerrada.
2.- Coloque una placa Petri con Agar Nutritivo a una distancia aproximada de 30 cm de su boca y
estornude vigorosamente sobre ella. Tape la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h. Como
control, repita la experiencia, pero antes cubra su boca con una mascarilla.
3.- Abra una placa de Petri con Agar Papa Dextrosa y sacuda su cabello sobre ella. Cierre la placa e
incúbela a 25ºC durante 5 días.
4.- Utilizando una tórula estéril, tome una muestra de sus fosas nasales y extiéndala sobre la
superficie de Agar Nutritivo (contenido en una placa de Petri). Incube la placa a 35ºC durante
48 h.
5.- Humedezca su dedo pulgar con una solución de suero fisiológico y frótelo con su dedo índice
durante 15 segundos. Seguido, imprima la huella de su dedo pulgar sobre la superficie de Agar
Nutritivo (contenido en una placa de Petri). Cierre la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h.

• SESIÓN II: Determinar el efecto de agentes de control microbiológico.

1.- Efecto del lavado de manos con jabón que contiene triclosán como agente antiséptico

Utilizando un lápiz marcador divida en dos una placa de Petri con Agar Nutritivo. Luego,
humedezca su dedo pulgar de su mano derecha con una solución de suero fisiológico y frótelo con
su dedo índice durante 15 segundos, seguido imprima la huella de su dedo pulgar sobre una de las
mitades de la placa. Seguido, lave sus manos con jabón antiséptico (con triclosán) y enjuague con
abundante agua. Séquese las manos con papel absorbente e imprima la huella de su dedo pulgar
izquierdo sobre la otra mitad de la placa. Incube la placa a 35ºC durante 48 h.

2.- Efecto del calor sobre la flora bacteriana presente en leche

En el laboratorio encontrará un matraz con 100 ml de leche pasterizada que ha sido inoculada con un
cultivo de bacterias coliformes. Tome una alicuota de 1 ml, dilúyala hasta 10-1 y transfiera 1 ml de
la dilución a una placa de Petri. Vierta sobre la placa 18 ml de Agar VRB fundido y atemperado a
48ºC, homogenice la mezcla mediante movimientos circulares y deje solidificar. En seguida,
introduzca el matraz en un baño termorregulable ajustado a 63ºC y a intervalos de tiempo de 3, 5, 15

17
y 30 min, tome una alícuota de 1 ml del matraz y dilúyala hasta 10-1. Repita la operación de siembra
realizada anteriormente. Espere que el agar solidifique e incube las placas a 35ºC durante 48 h.

3.- Efecto de la radiación U.V

Se le proporcionara un tubo que contiene un cultivo de Escherichia coli a una concentración

aproximada de 108 células/ml. Con una pipeta Pasteur, transfiera dos gotas del cultivo sobre la
superficie de Agar Nutritivo (contenido en una placa de Petri). A continuación, transforme la pipeta
Pasteur en un rastrillo (asa) de siembra y extienda el inóculo por toda la superficie del agar. Levante
la tapa y cubra la mitad con papel de aluminio. Exponga la placa abierta bajo una lámpara de luz
U.V. durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo, quite el papel de aluminio, cierre la placa e
incúbela a 35ºC durante 48 h.

18
 PRÁCTICA Nº3
AISLAMIENTO Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS DE MICROORGANISMOS
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

En general, los alimentos constituyen substratos complejos que pueden contener una microflora muy
diversa, comúnmente constituida por bacterias, mohos y levaduras, pertenecientes a diferentes
taxones. Por esta razón, el estudio de su microflora, ya sea con fines cuantitativos (recuento de
microorganismos viables) o cualitativos (identificación de microorganismos patógenos o con algún
interés biotecnológico), requiere emplear técnicas que permitan obtener “cultivos puros”.

Un cultivo puro, es aquel que contiene solo un tipo de microorganismo que procede generalmente
de una o más células de una misma especie (clon).

En medios de cultivos sólidos (agares), los cultivos puros forman una masa de células visibles a
simple vista que reciben el nombre de “colonias”. No obstante, cuando se hace referencia al origen
de una colonia es más correcto denominarlas “unidades formadoras de colonias” (UFC), dado que
una colonia puede ser originada por una o más células de un microorganismo de una misma especie.
Es necesario tener en cuenta además, que los cultivos puros o colonias de una misma especie se
denominan “cepas”, puesto que entre estás pueden existir variaciones genéticas debido a
mutaciones espontáneas.

La obtención de colonias aisladas es imprescindible para poder determinar el recuento viable de

microorganismos en alimentos y bebidas. Igualmente, la utilización de cultivos puros es un requisito
ineludible para estudiar aquellas características (morfológicas, bioquímicas y/o fisiológicas) que
permitan identificarlos a cualquier nivel taxonómico (familia, género o especie).

TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

A partir de muestras de alimentos se puede obtener colonias aisladas de microorganismos utilizando

el método de las “diluciones decimales sucesivas o seriadas”; esta técnica es la base para realizar
el recuento viable de microorganismos. Por su parte, para chequear la pureza de las colonias u
obtener cultivos puros a partir de cultivos mixtos, comúnmente se emplea el método de siembra de
“agotamiento por estrías”.

1. - Aislamiento mediante el método de las diluciones decimales sucesivas o seriadas

19
Este método consiste en preparar un banco de diluciones decimales de la muestra que se desea
investigar, las que posteriormente se siembran en un medio de cultivo sólido apropiado hasta
obtener colonias aisladas. La siembra se puede realizar mediante la técnica de “vertido en agar” (o
siembra en masa) o por “extensión superficial”.

TÉCNICA

A- Preparación del banco de diluciones

1.- En forma aséptica, se toma una muestra de alimento de 10 g ó 10 ml, según sea el caso. Si el
alimentos es sólido, la muestra se deposita en una bolsa de stomacher estéril junto con 90 ml de
Agua Peptonada Tamponada (APT, 0.1 % p/v) y se homogeniza en el stomacher, durante 1
minuto a 230 rpm. Si el alimento es líquido, se vierte la muestra en un frasco que contenga 90
ml de APT y se homogeniza manualmente, agitándolo durante 15 segundos (25 veces en un arco
de 30 cm). En ambos casos se obtendrá una muestra del alimento diluida 1:10 (1/10 ó 10-1).

2.- Usando una pipeta estéril, se toma 1 ml de la dilución 1:10 y se transfiere a un tubo que
contiene 9 ml de APT, el tubo se agita en un Vortex. Así se obtendrá la segunda dilución de
1:100 (1/100 ó 10-2).

3.- A partir de la segunda dilución, se transfiere un 1 ml a otro tubo que contiene 9 ml de APT y se
agita en un Vortex, obteniendo así la tercera dilución de 1:1000 (1/1000 ó 10-3). La operación
se repite hasta obtener las diluciones necesarias, que dependerá del grado de contaminación del
producto analizado. Así, mientras más alta sea la carga o contaminación microbiana, mayor será
el número de diluciones requeridas.

A.1.- Siembra mediante vertido en agar (siembra en masa)

1.- Se toma un volumen de 1 ml de cada una de las diluciones preparadas y se depositan en placas
de Petri estériles y vacías.

2.- A continuación, en cada placa se vierten 18 ml de un agar apropiado, previamente fundido y

atemperado a 48-50ºC. La mezcla de homogeniza por rotación suave de la placa.

3.- Se espera que el medio solidifique y las placas se incuban en forma invertida, a la temperatura y
durante el tiempo apropiado para el tipo de microorganismo que se desea aislar. Por ejemplo:
7ºC durante 7 días, para microorganismos psicrótrofos; 30ºC durante 72h ó 35ºC durante 24h,
para microorganismos mesófilos; o 25ºC durante 3 a 5 días, para levaduras y mohos.

20
A.2.- Siembra por extensión superficial

1.- Se toma una alícuota de 0.1 ml de cada una de las diluciones apropiadas y se depositan sobre la
superficie de un agar apropiado (contenido en placas de Petri).

2.- A continuación, utilizando un asa de vidrio, previamente esterilizada con alcohol y flameada a la
llama del mechero, se extiende la alícuota por toda la superficie del agar.

3.- Las placas se incuban en forma invertida a la temperatura y durante el tiempo apropiado para el
tipo de microorganismos que se está investigando.

Tras la incubación, se obtendrán colonias aisladas que se podrán diferenciar por su morfología
(tamaño, forma, textura, pigmentación, etc), permitiendo así distinguir distintas especies
microbianas. Esto será válido para las colonias que crecen sobre la superficie del agar, ya que las
colonias que se desarrollan en el interior (bajo la superficie o masa del agar) tendrán todas una
forma lenticular, por lo cual no se podrán diferenciar aunque los microorganismos que las formen
sean de distintas especies. En ambos casos, puesto que el volumen de las diluciones sembradas es
conocido, se puede determinar el número de microorganismos viables en el producto, el que será
calculado multiplicando el número de colonias contadas en cada placa por el factor de dilución
correspondiente. La expresión de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias por
mililitro o gramo de muestra" (UFC/ml ó g), puesto que se desconoce el número de células de una
misma especie que han originado una colonia. A partir de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para su posterior estudio o identificación.

21
 A.- Preparación de las diluciones decimales
seriadas

9 ml (APT)

10g muestra/90 ml APT (10- 10-2 10-3 10-4

16 colonias
16 x 1000
A1.- Siembra en masa (1 = 1.6 x 104
UFC/ml

A2.- Extensión superficial (0.1 ml) 16 colonias

16 x 100 x 10
= 1.6 x 104
UFC/ml

AISLAMIENTO MEDIANTE “DILUCIONES DECIMALES SUCESIVAS O SERIADAS”

(A) Preparación de las diluciones, (A1) Siembra en masa, (A2) Siembra por extensión superficial.

22
2. - Aislamiento mediante el método de siembra de agotamiento por estrías

Mediante este método se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un

cultivo mixto, o bien que proceden de muestras homogéneas, pero en las que existe un elevado
número. Este método además permite chequear la pureza de cultivos que se desean someter a
pruebas morfológicas, bioquímicas, fisiológicas o moleculares. Se trata de un método rápido y
simple, que consiste en el agotamiento continuo de un inóculo (líquido o sólido) sobre un agar
apropiado que está contenido en placas de Petri.

TÉCNICA

1.- Utilizando un asa de siembra (curva), previamente esterizada, se toma una alícuota del cultivo
de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. Se extiende en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.
2.- A continuación, se flamea el asa, se enfría y después de rozar una vez con el asa las estrías
sembradas previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías.
3.- El asa nuevamente se flamea y enfría y se repite la operación anterior, pero en esta ocasión
rozando la segunda tanda de estrías.
4.- Se cierra la placa y se flamea el asa.
5.- Las placas se incuban a la temperatura adecuada durante 24-48 h, siempre en posición invertida.

Tras la incubación, se observan las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada. En las
zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfología de las colonias. Si todas las
colonias presentan características morfológicas similares, el cultivo está puro; es decir, contiene
microorganismos de una misma especie.

AISLAMIENTO MEDIANTE EL MÉDOTO DE SIEMBRA DE “AGOTAMIENTO POR

ESTRÍAS”

23
ACTIVIDADES

1.- Obtención de colonias aisladas y recuento total de microorganismos viables a partir de una
muestra de alimento, utilizando el método de las diluciones decimales seriadas que se
sembrarán utilizando la técnica de vertido en agar y por extensión superficial:

o A cada grupo (mesón) se le proporcionará un trozo de quesillo fresco. A partir de éste, tome
una muestra de 10 g y prepare diluciones decimales seriadas (10-1 a 10-4). Siembre las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 en Agar Plate Count, utilizando la técnica de vertido en agar y
extensión superficial. Incube las placas a 35ºC durante 48h. Tras el periodo incubación,
describa la morfología de los distintitos tipos de colonias que se han desarrollado en forma
aislada. Al mismo tiempo, calcule el recuento total de microorganismos viables.

2.- Obtención de cultivos puros empleando la técnica de siembra de agotamiento por estrías:

o En cada mesón encontrara tubos con Caldo Tripticasa que contienen un cultivo mixto de
bacterias. Con un asa de siembra (curva) tome una alícuota del cultivo y siémbrelo mediante el
método de agotamiento por estrías en placas de Petri que contienen Agar Tripticasa. Tras
incubar las placas a 35ºC durante 24 h, describa las características fenotípicas de las colonias
que ha logrado separar.

24
 PRÁCTICA Nº 4
MEDIOS DE CULTIVO
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que

crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. En este contexto, los
alimentos, los ambientes sucios y las heridas podrían considerarse como medios de cultivos, pero
como medios de cultivos naturales. No obstante, en el laboratorio de microbiología, cuando se
habla de medios de cultivo se hace referencia a medios de cultivos artificiales; es decir, de aquellos
que han sido formulados para satisfacer las necesidades nutritivas específicas de los
microorganismos que se desean investigar. Puesto que la diversidad metabólica de los
microorganismos es inmensa, la variedad de medios de cultivo es también muy grande.

En general, los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías:
(i) físicos, donde se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y, (ii) químicos, que
comprenden los elementos nutritivos (fuentes de C y N), las sustancias minerales, el oxígeno y
determinados factores orgánicos de crecimiento (por ejemplo: vitaminas y/o aminoácidos).

La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es necesario

rehidratar y esterilizar según las especificaciones del fabricante. La mayoría (salvo contadas
excepciones) se esterilizan en el autoclave, pero algunos suplementos termolábiles se deben
esterilizar por filtración y se añaden al cultivo previamente esterilizado y atemperado a 50ºC. Una
vez sembrados o inoculados, deben ser incubados a temperatura y condiciones atmosféricas
adecuadas.

En la práctica, la función de los medios de cultivos es aportar un substrato que permita:

5 Cultivar, aislar, seleccionar e identificar microorganismos (principalmente: bacterias, mohos y

levaduras).
5 Obtener cantidades apreciables de microorganismos con fines industriales; por ejemplo, para la
mantención de fermentos lácteos o la obtención de enzimas bacterianas.
5 Mantener cepas de microorganismos por tiempos prolongados (ceparios).

25
Aunque existe una gran variedad de medios de cultivos artificiales, cuya formulación varía según su
uso, todos deben contener los siguientes nutrientes o elementos básicos:

5 Una fuente de carbono (glucosa, sacarosa, almidón u otro azúcar asimilable).

5 Una fuente de nitrógeno (extracto de carne, peptona de caseína o peptona de soja).
5 Una fuente de fósforo (P) y azufre (S).
5 Elementos trazas como Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
5 Tampones (sales que mantienen el pH dentro de un rango óptimo, tales como fosfatos bisódicos o
bipotásicos)

Adicionalmente, los medios de cultivos sólidos o semi-sólidos contienen un agente gelificante,

agar-agar, que es un polisacárido obtenido de ciertas algas marinas (polímeros de ácido
galacturónico). En el caso de los medios de cultivo selectivos, éstos poseen uno o más agentes
inhibidores (por ejemplo: antibióticos, colorantes, sales biliares, etc). Por su parte, los medios de
cultivo diferenciales llevan un indicador de pH (por ejemplo: rojo de fenol, púrpura de
bromocresol, rojo neutro, etc). Por último, a los medios de cultivos para bacterias exigentes o
fastidiosas se incorporan uno o más factores de crecimiento (por ejemplo: vitaminas, aminoácidos,
hemina, etc.).

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Desde el punto de vista físico los medios de cultivos se pueden clasificar en “medios de cultivo
sólidos o agares”, “líquidos o caldos” y “semi-sólidos”. El desarrollo microbiano en un medio de
cultivo líquido se manifiesta por enturbiamiento del mismo, el que puede ser parcial, total, o
solamente estar limitado a la formación de una película membranosa superficial. En medios de
cultivo sólidos, se manifiesta por la aparición de una “colonia”, que corresponde a una formación
macroscópica no filamentosa (bacterias y levaduras) o filamentosa (mohos), que resulta de la
multiplicación de una o más células y/o esporas de una misma especie (clon).

Por otro lado, según las características nutritivas, los medios de cultivos pueden ser clasificados en
seis grupos bien definidos:

1.- MEDIOS BASICOS

Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, ya que no satisfacen ninguna necesidad en
especial. Se utilizan, de preferencia, como base para la preparación de otros medios de cultivo. En
ellos crecen bacterias poco exigentes y pueden ser usados para mantener cepas bacterianas
(cepario). Ejemplos de éstos son el Agar o Caldo Nutritivo y el Agar o Caldo Tripticasa.

26
2.- MEDIOS BASICOS MEJORADOS

Son medios básicos a los cuales se les adiciona una sustancia enriquecedora como suero, sangre o
leche. El uso de estos medios es universal y está orientado a obtener un mejor desarrollo de
cualquier tipo de bacterias por exigentes que ellas sean. Por ésta razón se utilizan en primera
instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros medios de cultivo, alimentos o
productos patológicos. Ejemplos de éstos son el Agar Sangre, Agar Suero, Agar Leche y el Caldo
Carne Cocida.

3.- MEDIOS SELECTIVOS

Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies
microbianas y permiten el desarrollo de otras. Tienen aplicación en el diagnóstico bacteriológico,
principalmente cuando el problema consiste en aislar un germen de un producto que contiene
numerosos grupos o especies de microorganismos, a menudo sin importancia etiológica, y las
cuales en un medio de cultivo mejorado crecerían de tal forma, que dificultarían el aislamiento del
agente que se desea pesquisar. La mayoría de estos medios además incluyen algún substrato
(azúcar, aminoácido o de otra naturaleza) y un indicador de pH que permite detectar su utilización,
permitiendo así diferenciar entre grupos o especies microbianas.

Entre los medios selectivos más utilizados en microbiología de alimentos están:

• Agar BAIRD-PARKER- Yema de Huevo- Telurito

Medio selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

recuento presuntivo de estafilococos coagulasa positivos,
particularmente Staphylococcus aureus.
Este medio de cultivo es selectivo debido a que contiene
cloruro de litio y telurito de potasio, los cuales inhiben el
desarrollo de la flora acompañante. Su poder diferencial está
dado por la yema de huevo y el telurito; la primera permite
demostrar la presencia de lecitinasa y el segundo la
reducción del telurito a teluro, propiedades que son
características de los estafilococos coagulasa positivos. Las
colonias típicas de S. aureus se presentan de color negro-
grisáceo (reducción del teluriuto a teluro) rodeadas de una
zona opaca de precipitación que a menudo presenta una zona clara más externa debido a la acción de
la lecitinasa.

27
• Agar VRBG (Agar Cristal Violeta- Rojo Neutro-Bilis-Glucosa)

Medio selectivo y diferencial utilizado para la detección y

recuento de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros de
esta familia son bacilos Gram negativos, oxidasa negativos,
que fermentan la glucosa con o sin producción de gas. El
medio contiene cristal violeta y sales biliares, que inhiben la
mayor parte de la flora Gram (+) acompañante. El rojo
neutro es el indicador de pH y permite diferenciar entre
colonias glucosa positivas y glucosa negativas. Las colonias
fermentadoras de glucosa se caracterizan por presentar un
color rojo púrpura, con o sin una zona de precipitación a su
alrededor. En cambio, las colonias no fermentadoras de
glucosa son incoloras o transparentes. Las colonias típicas de
los miembros de la Fª Enterioacteriaceae, deben ser confirmadas mediante la prueba de oxidasa
(oxidasa negativa) y fermentación de glucosa con producción de ácido en un medio glucosado.

• Agar VRBL (Agar Cristal Violeta-Rojo Neutro- Bilis-Lactosa)

Medio selectivo y diferencial utilizado para la detección y

recuento presuntivo de bacterias coliformes
(Enterobacteriaceae lactosa +) y bacterias coliformes
fecales (coliformes termotolerantes). Ambos grupos son
miembros de la Fª Enterobacteriaceae y se caracterizan por
su capacidad para fermentar la lactosa con producción de
ácido y gas a 35ºC (48 h) y 44.5ºC (24 h), respectivamente.
El medio contiene cristal violeta y sales biliares, los que
inhiben la mayor parte de la flora Gram (+) acompañante. El
rojo neutro es el indicador de pH, que permite diferenciar
entre colonias lactosa positivas y lactosa negativas. Las
colonias fermentadoras de lactosa se caracterizan por
presentar un color rojo púrpura, con o sin una zona de precipitación a su alrededor; mientras que las
colonias no fermentadoras de lactosa son incoloras o transparentes. El carácter de coliforme o
coliforme fecal, debe ser confirmado mediante la producción de gas a partir de la lactosa a 35ºC y
44.5ºC, respectivamente.

28
• Agar MacConkey-Sorbitol

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el

aislamiento presuntivo de Escherichia coli O157:H7, un
patógeno asociado con colitis hemorrágica y el síndrome
hemolítico-urémico.
La formulación de este medio es parecida al agar VRBL y
VRBD, la diferencia está en que contiene sorbitol en vez de
lactosa o glucosa; además contiene cefixima y telurito de
potasio (inhibidores) con el fin de aumentar su poder
selectivo. E. coli O157: H7 es resistente a dichos inhibidores
y a diferencia de otros serotipos de E. coli no fermentan el
sorbitol. Por lo tanto, las colonias típicas de E. coli O157:H7
son incoloras o blancas (sorbitol negativas). En contraste, la
mayor parte de las E. coli de otros serotipos fermentan el sorbitol, originando colonias de color
rosado-rojas. Las colonias típicas de E. coli O157:H7 se deben confirmar mediante pruebas
bioquímicas (test IMViC) y serológicas (usando el antisuero O157 y H7).

Test IMViC= Indol (I), Rojo Metilo (M), Vogues-Proskauer (V), i (y), Citrato (C).

• Agar EMB- Levine (Agar Eosina-Azul de Metilo- Según Levine)

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para aislar

y diferenciar miembros de la Fª Enterobacteriaceae lactosa
positivas, principalmente E. coli. El medio contiene azul de
metilo y eosina, colorantes que ejercen un efecto inhibitorio
sobre muchas bacterias Gram positivas y, a su vez, permiten
la diferenciación entre organismos lactosa positivos (como
E. coli) y lactosa negativos (como Proteus spp., Salmonella
spp., y Shigella spp.). En este medio, las colonias de
Escherichia coli se caracterizan por presentar un brillo verde
metálico. No obstante, las colonias típicas deben ser
confirmadas mediante pruebas bioquímicas (test IMViC).

29
• Agar XLD (Agar Xilosa- Lisina - Desoxicolato)

Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e

identificación presuntiva de Salmonella spp. y Shigella spp.,
preferentemente provenientes de cultivos pre-enriquecidos.
El medio contiene desoxicolato de sodio, que actúa como un
inhibidor de bacterias Gram positivas. El medio además
contiene xilosa, lactosa, lisina y tiosulfato de sodio. La
fermentación de la xilosa, lactosa y sacarosa, la
descarboxilación de la lisina y la producción de H2S a partir
del tiosulfato de sodio, son la base para diferenciar
Salmonella spp. y Shigella spp. de otras enterobacteriáceas
no patógenas. Salmonella y Shigella son sacarosa y lactosa
negativas, por lo cual el pH del medio se mantiene intacto y, por lo tanto, el indicador de pH
mantiene el color rojo alrededor de las colonias. Por su parte, la mayor parte de las especies de
Salmonella producen H2S, el que actúa con el citrato férrico amoniacal presente en el medio,
produciendo colonias con un precipitado de color negro en el centro por las formación súlforo
ferroso. Las bacterias coliformes (lactosa positivas) provocan el viraje del indicador de pH alrededor
de las colonias, de rojo a amarillo. Las colonias sospechosas de Salmonella y Shigella, deben ser
confirmadas mediante pruebas bioquímicas y/o serológicas.

• Agar PALCAM
Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento
de Listeria spp., particularmente Listeria monocytogenes. Su
selectividad está dada por la presencia de cloruro de litio,
polimixina B, acriflavina y ceftazidima, agentes que
suprimen la flora que normalmente acompaña a Listeria spp.
El medio además contiene manitol y rojo fenol como
indicador de pH. También posee esculina y citrato de fierro
amoniacal. Listeria spp. es manitol negativo y esculina
positivo. Por lo tanto, las colonias típicas de Listeria spp.
producen a su alrededor un ennegrecimiento del medio
debido a la degradación de la esculina. La incapacidad para
fermentar el manitol se manifiesta por la manteción del color
rojo del medio. La presencia de L. monocytogenes debe ser confirmada mediante pruebas
bioquímicas y/o serológicas.

30
• Agar ALOA (Agar Listeria según Ottaviani & Agosti)

Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento

de Listeria spp., particularmente Listeria monocytogenes. Su
selectividad está dada por la presencia de cloruro de litio y a
la adición de ácido nalidíxico, ceftazidima, ciclohexamida y
polimixina B, agentes que suprimen la flora que
normalmente acompaña a Listeria spp. La propiedad
diferencial de este medio se debe a la presencia de un
compuesto cromogénico (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
glucopiranósido) que actúa como substrato de la enzima β-
gluocosidasa, presente en todas las especies de Listeria. La
actividad diferencial específica para Listeria monocytogenes
se debe a la presencia L-α-fosfastidilinositol, que actúa como
substrato para la enzima fosfolipasa C presente en Listeria monocitogenes y en algunas cepas de
Listeria ivanovii. Debido a la presencia de ambos substratos es posible diferencial las colonias de
Listeria spp. (colonias de color verde-azulado) de las colonias de Listeria monocytogenes (colonias
verde-azuladas y rodeadas por un halo opaco). La presencia de L. monocytogenes debe ser
confirmada mediante pruebas bioquímicas y/o serológicas.

• Agar MYP (Agar Manitol- Yema de Huevo- Polimixina)

Medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento

de Bacillus cereus. Su selectividad está dada por la
polimixina B, que inhibe el crecimiento de la mayor parte de
la flora acompañante. El medio contiene D-manitol y rojo de
fenol como indicador de pH, además de yema de huevo para
determinar la actividad de la lecitinasa. Bacillus cereus no
fermenta el manitol y produce lecitinasa, por lo que las
colonias típicas se aprecian de color rosa-rojo, rodeadas por
un halo de precipitación. La confirmación de la presencia de
Bacillus cereus debe ser confirmada mediante pruebas
morfológicas y bioquímicas.

31
• Agar DRBC (Agar Dicloran- Rojo de Bengala-Cloranfenicol)

Medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y

recuento de mohos y levaduras. El medio contiene glucosa
como fuente energética y cloranfenicol como inhibidor de
bacterias Gram (+) y Gram (-). Además contiene dicloran, un
antifúngico que reduce al tamaño de las colonias de mohos
de rápido crecimiento, que comúnmente impiden el
crecimiento o visualización de mohos de crecimiento más
lento o levaduras. El rojo de bengala también actúa como
supresor del crecimiento de bacterias y como represor del
tamaño de mohos de rápido crecimiento. En adición, el rojo
de bengala es incorporado por las colonias de levaduras,
facilitando su reconocimiento y conteo. El pH del medio
(5.6) también favorece el crecimiento de mohos y levaduras por sobre el de bacterias. Las colonias
de mohos presentan formas filamentosas de diversos tamaños y colores. En cambio, las colonias de
levaduras son no filamentosas, salvo ciertas excepciones, y exhiben una tonalidad que varia de rosa
a rojo.

• Agar PDA (Agar Papa Dextrosa)

Medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y

recuento de mohos y levaduras. La fuente energética está
dada por infusión de papa y glucosa. El crecimiento de
bacterias se restringe mediante la adición de un antibiótico
de amplio espectro (generalmente, cloranfenicol) o ajustando
el pH a 3.5 con ácido tartárico o láctico. Las colonias de
mohos son típicamente filamentosas, de tamaño y color
variable. En cambio, las colonias de levaduras son no
filamentosas, salvo algunas excepciones, y dependiendo de
la especie son de color blanco, crema o pigmentadas
(amarillas, rosas o rojas).

32
4.- MEDIOS ESPECIFICOS

Son medios de cultivo que por su composición nutricional y química sólo son capaces de satisfacer
los requerimientos nutricionales mínimos de una especie bacteriana determinada, solamente en ese
medio hallan las condiciones óptimas (factores de crecimiento) para su desarrollo. Ejemplos de
éstos son el Agar Chocolate para Haemophilus spp., Agar Stuart para Leptospira spp., y Agar
Loweisten-Jensen para Mycobacterium tuberculosis.

5.- MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO

Son medios de cultivos que gracias a su composición estimulan el crecimiento de un determinado

microorganismo. Además, poseen sustancias inhibidoras que impiden el crecimiento de
microorganismos que no se desean aislar y forman parte de la microflora acompañante .

Los más utilizados en microbiología de alimentos son:

• Caldo TETRATIONATO

Es un medio de enriquecimiento selectivo para la detección de Salmonella spp. El caldo contiene

sales biliares, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram (+); tiosulfato de sodio y tetrationato
(este último es formado en el medio por la adición de una solución de yodo y yoduro de potasio),
los cuales suprimen la microflora comensal del intestino. También contiene carbonato de calcio, que
absorbe e inhibe los metabolitos tóxicos.

• Caldo RAPPAPORT-VASSILIADIS.

También es un medio de enriquecimiento selectivo para la detección de Salmonella spp. El medio

contiene cloruro de magnesio que eleva la presión osmótica del medio, verde malaquita que es
inhibitorio para la mayoría de los microorganismos, excepto para Salmonella spp. Además su bajo
pH (5.1) selecciona salmonelas altamente resistentes.

• Caldo E.Cm (modificado)

Medio de enriquecimiento selectivo utilizado para la detección de Escherichia coli O157:H7. El

medio sólo contiene lactosa como fuente de carbono asimilable. Los agentes inhibidores son las
sales biliares y la novobiocina (antibiótico). Las sales biliares inhiben bacterias bacterias Gram (+);
mientras que la novobiocina, inhibe la flora bacteriana que normalmente acompaña a E. coli
O157:H7.

33
• Caldo FREASER

Medio de enriquecimiento selectivo y diferencial utilizado para la detección de Listeria spp.,

particularmente Listeria monocytogenes. El medio contiene cloruro de litio, ácido nalidíxico y
acriflavina, que inhiben la flora acompañante. También contiene esculina y citrato férrico
amoniacal. Como todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, los productos de su
degradación reaccionan con el citrato férrico amoniacal, provocando el ennegrecimiento del medio,
el que es una señal de la presencia de especies del género Listeria.

6.- MEDIOS DIFERENCIALES

Se emplean para demostrar una propiedad bioquímica de la bacteria, la cual es de gran ayuda para su
identificación. Por ejemplo: degradación de hidratos de carbono (Caldo Base Rojo Fenol), hidrólisis
de la urea (Agar Urea), utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono (Agar Citrato
de Simmon`s), etc. Como se trata de fenómenos metabólicos que tienden a la identificación de un
género o especie bacteriana, siempre se deben usar “cepas puras”.

Estos medios poseen indicadores de pH que permiten visualizar una determinada propiedad
alterando sus propiedades cromáticas. Medios de este tipo son numerosos, los más conocidos y
utilizados son aquellos que son utilizados para identificación de los especies de la Fª
Enterobacteriaceae, ya que éstos no poseen características muy distintivas en sus cultivos y
colonias.
Los más utilizados para este efecto son:

• Agar CITRATO DE SIMMON´S

Se utiliza para estudiar si una cepa bacteriana tiene la capacidad de utilizar el

citrato de sodio como única fuente de carbono incorporada en el medio de
cultivo. El medio se prepara en tendido y es de color verde. Se siembra sólo
en superficie y se incuba a 37 ºC durante 24-72 h.

Interpretación
La degradación del citrato por los microorganismos da lugar a una
alcalinización del medio de cultivo, que se manifiesta por un viraje a azul
oscuro del indicador de pH (azul de bromotimol).

34
• Agar UREA DE CHRISTENSEN

Sirve para demostrar si una cepa bacteriana posee la capacidad de hidrolizar

la urea. El medio se prepara en tendido y es de color levemente amarillo. Se
siembra en superficie y se incuba a 37ºC durante 24-72 h.

Interpretación

Si la urea es hidrolizada por la enzima ureasa se forma dióxido de carbono y

amoniaco. Este último proporciona una reacción alcalina al medio, que se
visualiza por el viraje de amarillo a rojo-púrpura del indicador de pH (rojo de
fenol).

• Agar TSI (Agar Tres azúcares-Hierro)

En este medio se estudia: i) La fermentación de la glucosa, con o sin producción de gas; ii) la
fermentación de la lactosa y/o sacarosa; y iii) la producción de H2S. El medio se prepara en tubo
inclinado y se siembra en superficie y picadura con asa recta. Se incuba a 37ºC durante 24 h.

Interpretación

La degradación de los azúcares con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del
indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo. La utilización de la lactosa y/o sacarosa se
visualiza en la parte tendida del tubo, mientras que la utilización de la glucosa se observa en la parte
profunda (columna) del mismo. La formación de gas por fermentación de la glucosa se aprecia por
la aparición de burbujas o ruptura del agar en su parte profunda. Por último, la producción de H2S
se observa por la aparición de un precipitado de color negro que corresponde al súlfuro ferroso.

35
 A B C D E

TUBO ANOTACIÓN INTERPRETACIÓN AGAR TSI

A 0/0. Tubo control, sin inocular
B A/A. Tendido: Producción de ácido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Producción de ácido a partir de la glucosa.
C A/A g. Tendido: Producción de ácido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Producción de ácido a partir de la glucosa con formación de
gas.
A/A H2S. Tendido: Producción de ácido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Producción de ácido a partir de la glucosa y formación de H2S.
E 0/A H2S. Tendido: No produce ácido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Producción de ácido a partir de la glucosa y producción de
H2S.

• Agar LIA (Agar Lisina-Hierro)

En éste medio se estudia la decarboxilación y la deaminación de la lisina, la producción de H2S, y

la formación de gas. El medio se prepara y se siembra de igual forma que el agar TSI. Se incuba a
37ºC durante 24 h.

36
Interpretación

La lisina puede ser decarboxilada por microorganismos LD-positivos, que la transforman en la

amina cadaverina. Esto produce un viraje a violeta del indicador de pH (púrpura de bromocresol).
Puesto que la decarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0), es necesario que
se produzca previamente la fermentación de la glucosa. Por ello, este medio de cultivo sólo puede
utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa (Fª Enterobacteriaceae). Por
otro lado, los microorganismos LD-negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un
cambio de color en la parte profunda del medio (violeta a amarillo). La producción de H2S se
visualiza por la formación de un precipitado de color negro (súlfuro ferroso), mientras que la
formación de gas se visualiza por la formación de burbujas o por la ruptura del medio en su parte
profunda. Las cepas del grupo Proteus-Providencia, desaminan la lisina a ácido α-cetocarbónico,
que se evidencia por la formación compuestos pardorojizos en la región superficial del medio de
cultivo.

A B C D E F

TUBO ANOTACIÓN INTERPRETACIÓN AGAR LIA

A K/K Tubo control, sin inocular
B K/K Descarboxilación de la lisina.
C K/A Ni descarboxilación, ni desaminación de la lisina. Sólo fermentación de
la glucosa.
D K/A g, H2S. Ni descarboxilación, ni desaminación de la lisina. Sólo fermentación de
la glucosa y producción de H2S.
E K/K H2S. Descarboxilación de la lisina y producción de H2S.
F R/A Desaminación de la lisina.

37
• Medio MIO ( Medio Movilidad – Indol – Ornitina)

Es un medio de cultivo semi-sólido que permite comprobar la descarboxilación de la ornitina,

formación de indol y movilidad. El medio se siembra en picadura y se incuba a 37ºC durante 18-24
h.

Interpretación

La movilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal
de la picadura. La no movilidad se caracteriza por el crecimiento solamente a lo largo de dicho
canal. La demostración del indol se efectúa mediante la aplicación de un par de gotas del reactivo
de Kovac’s (p-dimetil-amino-benzaldehido), el que se deja escurrir suavemente por las paredes del
tubo; la aparición de una coloración rojo-púrpura de la capa de reactivo indica producción de indol.
La descarboxilación de la ornitina se manifiesta por la mantención o intensificación del color violeta
del medio de cultivo en la parta baja del tubo.

A B C D E F

TUBO A B C D E F
MOVILIDAD Control (+) (-) (-) (+) (+)
INDOL Control N.D N.D N.D (+) (-)
ORNITINA Control (+) (-) (-) (+) (+)

38
• Caldo MR-VP (Caldo Rojo Metilo – Voges Proskauer)

Este medio permite demostrar la producción de ácido (prueba del rojo metilo) o compuestos neutros
a partir de la glucosa (prueba de Voges-Proskauer).

Prueba del Rojo Metilo (RM)

Mediante esta prueba se puede determinar si la producción de ácidos

orgánicos (ácido láctico, succínico, fórmico, etc. ) a partir de la
glucosa ha sido capaz de bajar el pH a valores inferiores a 4.4. Para
realizar la prueba se inoculan 5 ml del caldo MR-VP con la cepa a
estudiar y se incuba a 30ºC durante 5 días. Terminada la incubación,
se añaden 5 gotas de una solución de rojo de metilo. La reacción
positiva se evidencia por la aparición de un color rojo en el medio, el
que indica acidez (pH igual o inferior a 4.4). El color amarillo indica
reacción negativa (pH igual o mayor 5.1).

5 La solución indicadora de Rojo de Metilo se prepara disolviendo

0.4 g de rojo de metilo en 60 ml de etanol absoluto. El pH debe ajustarse a 5.0, la solución a este
pH tendrá un color anaranjado.

Prueba de Voges-Proskauer (VP)

Esta prueba permite comprobar la producción de diacetilo a partir de

la glucosa. Algunas bacterias como E.coli, Salmonella y Shigella
fermentan la glucosa con producción de grandes cantidades de ácidos
orgánicos, que bajan el pH a valores inferiores o iguales a 4,4 y que
puede ser verificado por la prueba del rojo de metilo. En cambio,
otras bacterias fermentan la glucosa y producen compuestos neutros
como el acetilmetilcarbinol (acetoína), 2,3-butanodiol o diacetilo, los
que son determinados con la prueba de VP. La prueba se realiza
sembrando 5 ml de un caldo MR-VP con la cepa bacteriana a estudiar
y se incuba a 37ºC durante 48 h. Tras el periodo de incubación se
agregan 3 ml del reactivo A y 1 ml del reactivo B, se agita y se deja
reposar por 5 a 10 min. Si se desarrolla una coloración roja-
anaranjada, que se extiende por todo el medio la reacción se
considerará positiva.

39
5 Reactivo A: α- naftol al 5 % en alcohol etílico absoluto.
5 Reactivo B: Hidróxido de potasio al 40% en agua destilada conteniendo 0.3 % de creatina
(solución muy cáustica).

INSTRUCCIONES PARA PREPARAR UN MEDIO DE CULTIVO

1.- Lea cuidadosamente las instrucciones que aparecen en la etiqueta del medio de cultivo.
2.- Ocupe un matraz cuya capacidad sea aproximadamente el doble del volumen del agua destilada
requerida para la preparación.
3.- Lave el matraz y una probeta con agua corriente y enjuáguela con agua destilada. Mida en la
probeta el volumen de agua destilada requerida y viértalo al matraz. Tape de inmediato con
papel de aluminio.
4.- Pese el medio de cultivo deshidratado sobre un papel limpio de acuerdo a la cantidad
especificada por el fabricante. Tape inmediatamente el frasco que contiene el medio de cultivo
deshidratado.
5.- Vierta el medio de cultivo pesado dentro del matraz que contiene el agua destilada. Disuelva
por medio de movimientos circulares. Evite que al agitar el medio quede cultivo seco en las
paredes del matraz.
6.- Caliente de acuerdo a las especificaciones del fabricante hasta lograr la total homogenización
del medio. Ello se aprecia por un cambio en el tono del color del medio de cultivo, éste se
vuelve translucido. Compruebe el pH y corríjalo si es necesario.
7.- Reparta el medio de cultivo en tubos o matraces de menor volumen.
8.- Esterilice el medio de acuerdo a las especificaciones que aparecen en la etiqueta del frasco
(autoclave o filtración).
9.- Si el medio fue esterilizado en autoclave espere que éste se enfríe e incúbelo a 35ºC durante 24
h para verificar su esterilidad. Se deben eliminar aquellos tubos o placas que presenten
desarrollo microbiano.
10.- Guarde los medios en el refrigerador (2-8ºC) hasta su posterior uso.

ACTIVIDADES

• SESIÓN I:
- Observación, descripción e interpretación de medios de cultivos selectivos de uso rutinario en el
laboratorio de microbiología de alimentos.

• SESIÓN II:
- Observación, descripción e interpretación de medios de cultivos diferenciales utilizados para la
identificación de especies de la Fª Enterobacteriaceae.

40
 PRÁCTICA Nº 5
EXAMEN MICROSCÓPICO DE BACTERIAS
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

La observación microscópica de bacterias permite conocer algunas características importantes de

éstas, tales como su tamaño, morfología, agrupación, presencia estructuras (cápsula, espora,
flagelos, etc.) y movilidad. Esta información es fundamental para su identificación o clasificación
dentro de un taxón determinado, ya que los aspectos morfológicos constituyen la primera etapa del
proceso de identificación de un microorganismo.

Para el estudio microscópico de bacterias generalmente se usan dos técnicas: “el frotis fresco o
examen en preparaciones húmedas” y “el frotis fijo o examen en preparaciones fijas”.

FROTIS FRESCO

El frotis fresco permite la observación de bacterias en su estado vivo y su principal aplicación es

estudiar su movilidad. En bacterias es posible diferenciar tres tipos de movimientos:

Movimiento browniano: Se manifiesta como un movimiento vibratorio y es el resultado de la

colisión de las bacterias con las moléculas presentes en el medio que las rodea. No existe
desplazamiento como tal y, por lo tanto, no se debe a la presencia de flagelos.

Movimiento de corriente: Se caracteriza porque todas las bacterias se desplazan en una misma
dirección del campo visual del microscopio. A primera vista da la impresión que las bacterias se
desplazan por su propia acción, pero no es así, sino que son arrastradas por corrientes que se
generan dentro de la preparación.

Movimiento de traslación: Se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos en

diferentes direcciones del campo del microcopio. La observación de este tipo de movimiento
permite afirmar que una bacteria es móvil y, por tanto, presenta flagelos.

TÉCNICA

1.- Limpie un portaobjetos y páselo rápidamente sobre la llama del mechero.

2.- Coloque una gota de suero fisiológico (S.F) sobre el portaobjetos.
3.- Con el asa de cultivo, resuspenda sobre la gota de S.F una muestra del cultivo que desea
observar. Debe usar cultivos frescos, de no más de 48 horas de incubación.

41
4.- Cubra la preparación con una lámina cubreobjetos y obsérvela en el microscopio con aumento
mayor (X40).

FROTIS FIJO

El frotis fijo, a diferencia del frotis fresco, permite solamente la observación de bacterias muertas y
es la base para realizar cualquier tinción.

TÉCNICA

1.- Limpie un portaobjetos y páselo rápidamente sobre la llama del mechero.

2.- Coloque sobre el portaobjetos una gota de agua destilada estéril.
3.- Sobre la gota de agua deposite una asada del cultivo que desea observar. Disuélvala y extiéndala
sobre el portaobjetos.
4.- Caliente nuevamente el portaobjetos hasta que la película formada sobre éste se seque
completamente.
5.- Una vez seco, vuelva a pasarlo sobre la llama evitando que la preparación se queme por
sobrecalentamiento.
6.- Deje enfriar y realice la tinción que desee.

TINCIONES

Las células bacterianas son prácticamente transparentes (hialinas), por esta razón es recomendable el
uso de colorantes para su observación. El empleo de colorantes biológicos permite aumentar el
contraste entre la célula y el medio que la circunda. Asimismo, el uso de algunas técnicas especiales
de tinción permite diferenciar entre grupos afines de bacterias o distinguir algunas estructuras
bacterianas (por ejemplo: flagelos, cápsula, gránulos de lípidos, gránulos metacromáticos, etc.).

Las tinciones se pueden clasificar en:

1.- TINCIONES SIMPLES

Se basan en el uso de un sólo colorante, por lo que todas las células bacterianas se observan del
mismo color. Este tipo de tinciones no permite establecer ninguna diferencia entre grupos de
bacterias o diferenciar estructuras. Por esta razón, tienen escasa aplicación en microbiología, sólo se
usan para estudiar la forma, tamaño y agrupación de las células bacterianas. Las tinciones simples se

42
pueden realizar con azul de metileno, violeta de genciana, cristal violeta, rojo de metilo, safranina,
etc.

2.- TINCIONES DIFERENCIALES

Estas tinciones permiten diferenciar grupos de bacterias de acuerdo a su afinidad por determinados
colorantes, por lo que prestan una gran utilidad para el estudio e identificación de bacterias. La más
empleada de ellas es la tinción de Gram, la cual permite separar a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.

TÉCNICA

1.- Prepare un frotis fijo de la cepa bacteriana que desea teñir.

2.- Cubra el frotis fijo con una solución de cristal violeta durante 60 segundos.
3.- Lave con agua destilada manteniendo el portaobjeto inclinado.
4.- Cubra con lugol y déjelo actuar durante 60 segundos.
5.- Lave nuevamente con agua destilada y decolore la preparación con alcohol-acetona hasta que
deje de escurrir el colorante, aproximadamente durante 30 segundos.
6.- Lave con agua destilada y luego cúbralo con una solución de safranina durante 15 segundos.
7.- Lave con abundante agua destilada y séquelo con cuidado a la llama del mechero.
8.- Observe la preparación en el microscopio usando el aumento de inmersión (X100).

Las bacterias que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecerán de
color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivas. Aquellos que pierden el color
inicial del cristal violeta tras la decoloración, se clasifican como Gram negativas y toman el color
rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias químicas en sus paredes celulares,
son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-lugol (yodo). Las bacterias Gram
positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras
que en Gram negativas, aunque la pared está también constituida por péptidoglucano, es más
delgada y presenta además una membrana externa con lipopolisacáridos. Las paredes de las
bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratación y sus poros se contraen,
dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol
desorganiza la capa lipídica más externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano.

43
3.- TINCIONES ESPECIALES O ESTRUCTURALES

Las tinciones especiales tienen por objeto destacar algunas estructuras de la célula bacteriana como
por ejemplo: endosporas, cápsula, flagelos, lípidos, etc.

La tinción especial más usada en nuestro laboratorio es la tinción de endosporas. Las endosporas
son estructuras que se forman en el interior de las células vegetativas de bacterias pertenecientes a
los géneros Bacillus (algunas especies han sido reclasificadas en los géneros Alicyclobacillus,
Brevibacillus, Geobacillus y Paenibacillus), Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira y
Sporolactobacillus. A diferencia de la célula vegetativa de la que procede, las endosporas son
resistentes a factores ambientales adversos como altas temperaturas, compuestos químicos tóxicos,
radiaciones U.V y también a los colorantes. Sin embargo, existen colorantes como el verde de
malaquita que, con ayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vez teñidas, no pierden el colorante
al ser lavadas con agua, pero sí lo perderán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el
colorante de contraste. La posición y morfología de las esporas en el interior de la bacteria tiene gran
interés taxonómico, ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo género.

TÉCNICA

1.- Prepare un frotis fijo de la cepa bacteriana que desea estudiar. Fíjelo a la llama, pero evite no
sobrecalentar para no romper el portaobjetos.
2.- Cubra la preparación con una solución saturada de verde de malaquita (7.5%) y pásela por la
llama de un mechero hasta la emisión de vapores. Esta operación se repite durante 5 minutos,
evitando que la muestra hierva y que se evapore completamente el colorante. Si es necesario
agregue más colorante.
3.- Lave con agua corriente el exceso de colorante.
4.- Cubra la preparación con una solución acuosa de safranina al 0.25% durante 30 segundos.
5.- Lave, seque y observe la preparación con aumento de inmersión (X100).
6.- Las endosporas se observan de color verde, ya que se tiñen con el verde de malaquita; en
cambio, el cuerpo de la bacteria tiñe de color rosado por efecto del colorante de contraste
(safranina).

44
MORFOLOGIA CELULAR BACTERIANA

Las células bacterianas presentan una morfología típica que facilita su identificación. Las bacterias
se clasifican de acuerdo a esta propiedad en:

1.- CELULAS COCACEAS

En este caso las células son esféricas o aproximadamente esféricas (arriñonada u ovoides) y reciben
el nombre de cocos. Según como se agrupen se denominan:

o Diplococos: Se dividen en un sólo plano y permanecen unidas formando parejas (Neisseria

gonorrhoeae -N. meningitiditis).
o Estreptococos: Se dividen en planos paralelos y quedan unidas formando cadenas de distintas
dimensiones (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium).
o Tetracocos: Se dividen en dos planos perpendiculares y forman grupos característicos de cuatro
células (Aerococcus viridans).
o Estafilococos: Se dividen en tres planos irregulares formando racimos de cocos (Staphylococcus
aureus).
o Sarcina: Se dividen en tres planos perpendiculares dando agrupamientos cuboidales (Sarcina
spp).

2.- CELULAS BACILARES

En este caso las células son alargadas, pudiendo presentar formas variadas como: “cocobacilos”
(Escherichia coli), “bacilos fusiformes” (Fusobacterium spp.), “filamentosos” (Actinomyces spp.),
“elipsoides” (Acetobacter spp), “curvos o vibriones” (Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus),
“espiralados o helicoidales” (Helicobacter pylori), “rectangulares” (Bacillus anthracis), etc.

Las principales agrupaciones que pueden presentar las bacterias de forma bacilar son: “diplobacilos”
(Moraxella spp.), “estreptobacilos” (Bacillus cereus), y “letra china o empalizada”
(Corynebacterium spp.).

45
 A B C

D E F

A) Staphylococcus spp., B) Lactobacillus sp., C) Actinomyces sp., D) Pseudomonas sp., E)

Neisseria sp., F) Enterococcus sp.

Endospora de Bacillus sp. (teñidas con verde de malaquita)

46
ACTIVIDADES

A cada grupo se les proporcionará cultivos frescos de bacterias: Listeria innocua, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp., Bacillus sp. y Pseudomonas fluroescens.

1.- A partir de cada uno de los cultivos realice un frotis fresco y examínelo al microscopio.
Describa el tipo de movilidad que presenta.

2.- Prepare un frotis fijo de cada uno de los cultivos. A los frotis preparados con Listeria innocua,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp. y Pseudomonas fluorescens
efectúeles la tinción de Gram, mientras que a Bacillus cereus realícele la tinción de esporas.

47
 PRÁCTICA Nº6
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

La presencia de ciertas bacterias patógenas en alimentos (por ejemplo: Salmonella spp. Escherichia
coli O157:H7, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococous aureus, Listeria
monocytogenes y Bacillus cereus) constituye un serio peligro para la salud de los consumidores. Por
este motivo, su correcta detección e identificación es fundamental para determinar la aceptación o
rechazo de un producto alimenticio destinado al consumo humano.

Tradicionalmente la identificación de bacterias se ha llevado a cabo realizando una serie pruebas

bioquímicas, que permiten poner de manifiesto algunas características metabólicas (producción de
ciertas enzimas) de los microorganismos que se desean identificar. En algunos casos para confirmar
con certeza la identidad de ciertas bacterias (por ejemplo: Escherichia coli O157:H7, Salmonella
spp. y Staphylococcus aureus) es preciso incluir métodos no bioquímicos, como es el caso de
reacciones serológicas de aglutinación o precipitación. Para este efecto, comercialmente están
disponibles partículas de latex cubiertas con anticuerpos específicos que reaccionan con
determinados antígenos presentes en la superficie de las bacterias señaladas.

Hoy en día, también se pueden usar técnicas moleculares de identificación, como por ejemplo la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aunque este método ha sido utilizado con gran éxito
para la detección e identificación de bacterias en alimentos, su uso está restringido debido a su alto
costo. Por esta razón, la mayoría de los laboratorios siguen realizando la identificación en base a
métodos tradicionales.

A continuación se presenta el esquema básico para la identificación de Enterobacteriáceas mediante

la determinación de sus propiedades bioquímicas, utilizando “el método tradicional (en tubos)” y un
“sistema miniaturizado de identificación (el sistema API-20E)”.

I.- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN TRADICIONAL

1.- Siempre se debe trabajar con un cultivo puro de la colonia (cepa) que se desea identificar y la
cual ha sido aislada a partir de un medio de cultivo selectivo apropiado para Enterobacteriáceas
(por ejemplo: Agar MacConkey, Agar VRBD, Agar VRBL, Agar EMB-Levine, Agar XLD,
etc). La pureza de la colonia se debe verificar mediante el método de siembra por estrías,
utilizando un agar no selectivo (por ejemplo: Agar Nutritivo o Agar Tripticasa) incubado a 35-
37ºC durante 24 h.

48
2.- Luego, una porción de una colonia aislada se transfiere a un tubo con Agar Nutritivo
(inclinado) y se incuba por 18-24 h a 35-37ºC.

3.- Tras el periodo de incubación se comprueba que se trata de un miembro de la familia

Enterobactericeae; para ello, se le realiza la tinción de Gram (bacilos Gram-negativos), la
prueba de oxidasa (reacción negativa), y se verifica la producción de ácido a partir de la glucosa
(reacción positiva).

4.- Si es confirmada como un miembro de la Fª Enteroabacteriaceae se procede a su

caracterización bioquímica, usando como mínimo los siguientes medios de cultivos
diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Medio MIO, Agar CITRATO, Agar UREA y Caldo RM-VP.
Éstos se incuban a 35-37ºC durante el tiempo recomendado para cada medio de cultivo.

5.- Tras el periodo de incubación, se procede a la lectura y registro de las propiedades determinadas
en cada uno de los medios diferenciales utilizados. Los resultados se contrastan con los
presentados en las tablas de identificación para miembros de la Fª Enterobacteriaceae.

6.- Finalmente, si la colonia “cepa” es identificada como Salmonella o Escherchia coli, se deberían
confirmar mediante pruebas serológicas. Para Salmonella spp. se utiliza un antisuero polivante
para el antígeno somático (Ag. O) y capsular (Ag. Vi) presentes en salmonelas (Salmonella O
anti-suero poli A-I & Vi, Difco). Mientras que para Escherichia coli se utiliza el antisuero O157
(Oxoid) para determinar si trata del serogrupo O157 (E.coli enterohemorrágica o ECEE),
responsable de “la colitis hemorrágica” y del “síndrome hemolítico-urémico”.

II.- SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN MINIATURIZADOS

El desarrollo individualizado de las pruebas bioquímicas usadas en el método tradicional requiere la

manipulación de una gran cantidad de material, lo que a efectos prácticos los hace inviables en
laboratorios de análisis rutinarios. Por este motivo, se han desarrollado sistemas miniaturizados que
permiten el ensayo a gran escala y de forma sencilla de muchos ensayos bioquímicos simultáneos.
Uno de éstos es el sistema API-20E (BioMérieux®), que ha sido especialmente diseñado para la
identificación de las especies de la Fª Enterobacteriaceae, pero también existen otros sistemas para
la caracterización de otros grupos bacterianos (por ejemplo: API 20 NE, para Pseudomonas spp.,
API-LISTERIA, para Listeria spp., API-STAHAP, para Staphylococcus spp., etc).

El sistema API-20E, no es más que una tira o una galería, que contiene 20 microtubos o posillos con
distintos substratos deshidratados (Fig.1), que permiten determinar reacciones específicas de
fermentación/oxidación para determinados azúcares, así como la utilización de diferentes substratos
o la presencia de ciertas enzimas (Tabla 1).

49
 A

Fig. 1. (A) Galería API-20E sin inocular, (B) Galería API-20E inoculada.

Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la
vez. A partir de un cultivo puro, es posible conocer la identidad de la bacteria problema entre 18-24
h. Los resultados (+) o (-) de cada reacción son traspasados a una hoja de resultados (Fig. 2), la que
permite obtener un perfil numérico de la cepa ensayada. Este perfil numérico es introducido en un
Softoware (APILAB-PLUS), que entrega de forma inmediata la identidad de la cepa problema. No
obstante, en algunos casos puede solicitar la realización de alguna prueba adicional.

Fig. 2. Hoja de resultado del sistema API-20E.

50
PROCEDIMIENTO

1.- Reúna el fondo y la tapa de una cámara de incubación y reparta aproximadamente 5 ml de agua
destilada en los alvéolos para crear una atmósfera húmeda. Anote la referencia de la cepa en la
lengüeta lateral de la cámara. Saque la galería de su envase y colóquela en la cámara de
incubación.

2.- Tomé con el asa de cultivo una colonia aislada de la cepa

problema (cuya pureza previamente ha sido verificada mediante
siembra en agotamiento por estrías) y suspéndala en un tubo con
5 ml de suero fisiológico estéril. Homogenice la suspensión
usando el vortex.

3.- Inocule los microtubos (posillos) de la galería, utilizando una pipeta Pasteur estéril o una
micropipeta.

1.- Llene los tubos y las cúpulas de los ensayos

[CIT], [VP] [GEL].
2.- Llene únicamente los tubos (y no las cúpulas) de
los otros ensayos.
3.- Cree una atmósfera anaeróbica en los ensayos
ADH, LDC, ODC, H2S y URE, llenando las
cúpulas con parafina estéril.

4.- Cubra la cámara de incubación con su tapa e incúbela a 35-37ºC durante 18-24 h.

5.- Tras el periodo de incubación, realice la lectura de la galería para lo cual debe remitirse a la
tabla de lectura (Anexo 1). Anote en la hoja de resultados todas las reacciones espontáneas y
después revele los ensayos que necesitan la adición de reactivos:

51
 - Prueba de TDA: Agregue una gota del reactivo TDA, un color marrón-rojizo indica una
reacción positiva que se anotara en la hoja de resultados.

- Prueba IND: Agregue una gota del reactivo JAMES, un color rosado que se disipa en toda
la cúpula indica una reacción positiva, que se debe anotar en la hoja de resultado.

- Prueba VP: Agregue una gota del reactivo VP1 y VP2; espere un mínimo de 10 minutos, un
color rosa o rojo indica una reacción positiva que se anotara en la hoja de resultados.

- Prueba reducción de nitratos en nitritos (NO2) y en nitrógeno (N2): En el ensayo GLU

añada una gota de los reactivos NIT1 y NIT2; espere de 2 a 5 minutos, una coloración roja
indica una reacción positiva (NO2). Una reacción negativa (coloración amarilla) puede
deberse a la producción de N2. Agregue de 2 a 3 mg de Zinc en polvo en la cúpula de GLU;
después de 5 minutos, si el color sigue siendo amarillo, indica una reacción positiva (N2),
que deberá anotar en la hoja de resultados. Si el color de la cúpula cambia a naranja-rojo, la
reacción es negativa, ya que los nitratos aun presentes en el tubo han sido reducidos a
nitritos por el Zinc.

6.- Con los resultados positivos (+) y negativos (-), determine el perfil numérico. En la hoja de
resultados, los ensayos están separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de
1, 2 ó 4. Como la galería API-20E contiene 20 ensayos, sumando al interior de cada grupo los
valores que corresponden a reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Este
es el perfil numérico que debe introducir en el programa de identificación APILAB-PLUS.
Luego, presione ENTER y obtendrá la identidad de la cepa investigada o problema.

ACTIVIDADES

A cada grupo se le proporcionará un cultivo puro y fresco de una cepa aislada en agar VRBD ó
XLD, que previamente han sido confirmadas como miembros de la Fª Enterobacteriaceae, mediante
la tinción de Gram (bacilos Gram-negativos), la prueba de oxidasa (reacción negativa), y la
producción de ácido a partir de la glucosa (reacción positiva).

1.- Identifique la cepa utilizando el método tradicional. Para ello, siembre la cepa proporcionada en
los siguientes medios de cultivos diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Medio MIO, Agar
CITRATO, Agar UREA y Caldo RM-VP. Tras incubar durante 24 h a 35ºC, realice la lectura
de las reacciones en cada uno de los medios de cultivos sembrados y contrástelos con los
proporcionados en las tablas de identificación para Enterobacteriáceas.

52
2.- Paralelamente, identifique la cepa utilizando el sistema API-20E, siguiendo el procedimiento
descrito para tal efecto. Tras incubar a 35ºC durante 24 h, proceda a la lectura de los resultados
y obtenga el perfil numérico. Finalmente, para conocer la identidad de la cepa problema,
introduzca el perfil numérico en el Software APILAB-PLUS.

53
Anexo 1.- TABLA DE LECTURA DEL SISTEMA API-20E

COMPONENTES REACCIONES/ RESULTADOS

TESTS
ACTIVOS ENZIMAS NEGATIVO POSITIVO
ONPG Orto-nitro-fenil- β-galactosidasa Incoloro Amarillo (1)
galactósido
ADH Arginina Arginina dihidrolasa Amarillo Rojo/Naranja (2)
LDC Lisina Lisina descarboxilasa Amarillo Naranja
ODC Ornitina Ornitina descarboxilasa Amarillo Rojo/Naranja (2)
[CIT] Citrato Sódico Utilización de citrato Verde- Azul-Verde/ Azul (3)
pálido/Amarillo
H2S Tiosulfato Sódico Producción de sulfídrico Incoloro/Gris Depósito Negro
URE Urea Ureasa Amarillo Rojo/Naranja
TDA Triptófano Triptófano deaminasa Amarillo* Marrón*
IND Triptófano Producción de indol Amarillo* Anillo Rojizo*
[VP] Piruvato Sódico Producción de acetoína Incoloro* Rojo-Rosa
[GEL] Gelatina De Kohn Gelatinasa No Difusión Difusión de pigmento
negro
GLU Glucosa Fermentación/Oxidación (4) Azul/Verdoso Amarillo
(4)
MAN Manitol Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
INO Inositol Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
SOR Sorbitol Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
RHA Ramnosa Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
SAC Sacarosa Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
MEL Melibiosa Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
AMY Amigdalina Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(4)
ARA Arabinosa Fermentación/Oxidación Azul/Verdoso Amarillo
(*)
Requiere la adición de reactivos.
(1)
Un amarillo muy pálido debe considerarse positivo.
(2)
Un color naranja pálido después de 24 horas de incubación podría considerarse negativo.
(3)
La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis).
(4)
La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la superior.

54
 PRÁCTICA Nº7
EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN Y LA ACTIVIDAD DE AGUA DEL
MEDIO EN EL CRECIMIENTO DE BACTERIAS
______________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

Los alimentos constituyen ecosistemas complejos, donde el comportamiento microbiano

(crecimiento y/o supervivencia) está gobernado por factores inherentes a los mismos (factores
intrínsecos) así como por las condiciones de almacenamiento (factores extrínsecos). También
depende de las interacciones entre el alimento, el ambiente y las especies microbianas que coexisten
en ellos (factores implícitos).

Los factores intrínsecos que mayor efecto ejercen sobre el comportamiento de los microorganismos
son la disponibilidad de nutrientes, la presencia de sustancias inhibitorias, el pH, el potencial óxido
reducción y la disponibilidad de agua. Entre los factores ambientales o extrínsecos destacan la
temperatura y la tensión de oxígeno.
Estos parámetros físico-químicos pueden ser manipulados con el fin de prolongar la vida útil de los
alimentos y/o controlar el desarrollo de microorganismos patógenos. No obstante, el pH, la actividad
de agua, el potencial óxido-reducción y la temperatura son quizás los que mayor efecto tienen sobre
el crecimiento microbiano, tanto en alimentos como en cultivos artificiales.

pH (concentración de hidrogeniones, H+)

El pH se define como el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno o hidrogeniones

(H+) de una solución o de un alimento: pH= -log (H+). El valor de pH indica si el alimento es ácido
(predominio de iones H+), básico (predominio iones OH -) o está próximo a la neutralidad (equilibrio
entre iones H+ y OH-).
La concentración de hidrogeniones (pH) tiene un marcado efecto sobre el crecimiento microbiano.
Influye directamente en la actividad de sus enzimas y en el transporte de nutrientes hacia el interior
de la célula.

Ningún microorganismo es capaz de crecer en todo el rango de pH (1-14), sino que cada
microorganismo tiene un pH óptimo al cual su crecimiento es máximo y un pH mínimo que
corresponde a la acidez máxima que permite su crecimiento. Hay también un pH máximo que
corresponde a la alcalinidad máxima que permite su crecimiento.
La mayoría de las bacterias crecen mejor a pH próximos a la neutralidad o ligeramente alcalinos
(6.8-7.5), aunque pueden crecer entre un rango de 4,5 a 11. Evidentemente existen excepciones,

55
como las bacterias acidolácticas (Bifidobacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp.
Lecuconostoc spp. y Pediococus spp.) y las bacterias acetogénicas (Acetobacter spp. y
Gluconobacter spp.) que toleran bien la acidez (pH 3.0-4.0). Ellas mismas generan esta condición al
producir ácidos a partir de azúcares y/o etanol y, comúnmente se les conoce como bacterias
acidofílicas o acidotolerantes. Existen pocas bacterias que prefieren condiciones netamente
alcalinas (pH 8.5-9.0), sólo algunas especies de Vibrio.

Entre las bacterias patógenas, Staphylococcus aureus presenta el intervalo más amplio de pH (4.0-
9.8). Por su importancia, Clostridium botulinum ha sido objeto de numerosos estudios y se ha
determinado que no crece por debajo de 4.8, aunque por seguridad se toma el pH de 4.5.

Los mohos y levaduras son típicamente acidotolerantes. Éstos, aunque presentan un crecimiento
óptimo a pHs próximos a la neutralidad están dotados de una apreciable capacidad para proliferar en
substratos muy ácidos (con pHs inferiores a 3.0 y hasta valores extremos de 1.5), lo que determina
que sean los principales agentes del deterioro de frutas y otros alimentos ácidos.

Actividad de agua (aw)

Los microorganismos tienen una necesidad absoluta de agua, ya que sin ésta no existe crecimiento.
La cantidad exacta de agua necesaria para el desarrollo de los distintos microorganismos es variable,
pero antes de continuar es preciso aclarar que la totalidad del agua presente en el medio o alimento
(determinada por el porcentaje de humedad) no puede ser utilizada por los microorganismos. Esto se
debe a que una parte de la misma se encuentra ligada a los componentes hidrofílicos del producto
(sales, azúcares y proteínas); solo la parte de agua total que está libre puede ser utilizada por la
célula microbiana para sus exigencias metabólicas. Entonces para determinar la posibilidad de
desarrollo microbiano en un alimento no se utiliza el porcentaje de humedad del mismo sino el
contenido en agua libre o disponible. Esta viene expresada mediante un valor denominado
“actividad agua” (aw) y que se define como la relación entre la presión del vapor de agua del
producto (P) y la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura (Po): aw = P / Po.

El valor de aw de un producto se coloca en una escala que va del 0.0 para el aceite (ninguna
disponibilidad de agua libre) al 1.0 para el agua destilada (máxima disponibilidad de agua libre).
La mayoría de los medios de cultivos poseen una aw superior a 0.99, mientras que en los alimentos
es dependiente de su naturaleza y de los tratamientos a que han sido sometidos (deshidratación,
secado, salazón, azucarado, etc.). Así por ejemplo, la leche fresca posee una aw > 0.99; en cambio, en
la leche en polvo es de 0.20.

Cuanto menor es el valor de aw, menor es el contenido en agua libre y tanto mayor será la dificultad
para el desarrollo microbiano, siendo por lo tanto un potente factor seleccionador de la microflora
que se desarrolla sobre un determinado substrato.

56
El efecto que ejercen las altas concentraciones de solutos (azúcares o sales) sobre los
microorganismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del soluto sobre la aw. La
adición de solutos no solamente fija el agua del producto sino que además la hacen salir de las
células microbianas por osmosis.

En general las bacterias necesitan valores más elevados de aw para crecer que las levaduras y éstas, a
su vez, necesitan una mayor aw que los mohos. Entre las bacterias, las Gram negativas tienen
necesidades más elevadas en cuanto a aw que las Gram positivas. Con respecto a las bacterias
productoras de intoxicaciones alimentarias, se ha demostrado que Staphylococcus aureus crece a
una aw tan baja como 0.86, mientras que Clostridium botulinum no crece por debajo de 0.94.

La mayoría de las bacterias que alteran alimentos no pueden crecen a una actividad de agua inferior
a 0.91, excepto las bacterias halófilas (Halococcus spp. y Halobacterium spp.) que normalmente
están presenten en ecosistemas marinos. Éstas pueden crecer a una aw de 0.75, por lo que pueden
proliferar y alterar productos salados o salpresados.
La mayoría de las levaduras de importancia en los alimentos presentan una aw mínima de 0.87-0.88;
excepto las levaduras osmófilas (Zygosaccharomyces rouxii), las cuales pueden crecer a una aw de
0.60-0.65, por lo que comúnmente alteran miel, melazas y mermeladas. En cambio, la mayoría de
los mohos de importancia en los alimentos crecen a una aw mínima de 0.80; excepto los mohos
xerófilos (Aspergillus glaucus y Asperguillus echinulatus), que pueden crecer a una aw de 0.60-0.70.

Potencial óxido-reducción (potencial redox o Eh)

Desde el punto de vista teórico se expresa mediante la ecuación de Nerst y valora la capacidad de un
substrato o alimento para captar (si es oxidante/Eh positivo) o ceder (si es reductor/Eh negativo)
electrones, es decir su capacidad para oxidar o reducir. Ese intercambio o transferencia de electrones
ocasiona una tensión, una diferencia de potencial eléctrico que se valora o se expresa en mV
(milivoltios). Su valor oscila de -420 mV a + 810 mV, pero cuando la concentración de
componentes oxidantes es igual a la de reductores no existe potencial eléctrico y, por tanto, el Eh =
0 mV.
Desde un punto de vista práctico indica las relaciones del oxígeno con los microorganismos vivos,
es decir la tensión (concentración) de O2 que se precisa para el crecimiento de un determinado
microorganismo que, a su vez, está unido al posible efecto tóxico del mismo. Desde este punto de
vista puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de
multiplicarse. Así, si el Eh de un alimento es negativo se comportará como un sistema anaeróbico
(con una baja tensión de O2). En cambio, si es positivo, se comportará como un sistema aeróbico
(con una elevada tensión de O2).

En función del Eh o de las exigencias en O2 y/o toxicidad del mismo los microorganismos
tradicionalmente se dividen en 4 grupos o tipos respiratorios:

57
- Aerobios estrictos u obligados: Requieren Eh elevados o lo que es lo mismo la presencia de O2
como aceptor final de electrones (disponen de catalasa para eliminar el H2O2 que genera su
metabolismo).. En este grupo se encuentran bacterias Gram negativas como Pseudomonas spp.,
Xanthomonas spp., Flavobacterium spp., Alteromonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella spp.,
Gluconobacter spp., Acetobacter spp., Brucella spp., Legionella spp., etc. También incluye algunas
bacterias Gram positivas como Micrococcus spp. y muchas de las especies del género Bacillus. La
mayor parte de los mohos se incluyen también en este grupo.

Constituyen una parte importante de la microflora en alimentos donde el oxígeno se encuentra

fácilmente disponible como ocurre en la superficie de la carne o en otros alimentos almacenados al
aire como el pan o que permitan el acceso del aire como los huevos.

- Aero-anaerobios facultativos: Pueden multiplicarse tanto en presencia como en ausencia de

oxígeno. Si está presente lo utilizan como aceptor final de electrones, sino utilizan otros aceptores
como el NO3-. Además poseen tanto la enzima catalasa (excepto en las bacterias ácido lácticas y
Enterococcus spp., lo que determina que a veces éstas sean incluidas en el grupo de los
microaerófilos) como las enzimas necesarios para la fermentación. Son principalmente
fermentativos.

A pesar de que se pueden multiplicar tanto en presencia como en ausencia de O2, en igualdad de
condiciones, lo hacen con más dificultad en anaerobiosis (tiempo generacional mayor) que en
aerobiosis, ya que en el primer caso requieren una mayor cantidad de factores de crecimiento.

En este grupo se incluyen bacterias Gram negativas como los miembros de la Fª

Enterobacteriaceae y el género Vibrio. También Gram positivas como Staphylococcus spp.,
Listeria spp., algunas bacterias ácido lácticas (Lactobacillus spp, Leuconostoc spp., Lactococcus
spp., Pedioccocus spp. y Streptococcus thermophilus), Enterococcus spp y Bacillus cereus. La
mayor parte de las levaduras pertenecen a este grupo.

- Anaerobios estrictos u obligados: Solo pueden crecer en alimentos con un bajo potencial redox,
casi siempre en ausencia de O2 (es un tóxico para ellos): Poseen obligatoriamente un metabolismo
fermentativo y, además son catalasa negativos. Por las características señaladas, estos
microorganismos solo van a crecer en el interior de alimentos no procesados donde el acceso del
oxígeno está limitado como en las grandes masas musculares (de aquí el uso de un enfriamiento
rápido de las canales recién obtenidas). De igual modo, los alimentos enlatados y los envasados al
vacío o en atmósferas modificadas corren el riesgo de permitir la multiplicación de estos
microorganismos. En este grupo hay bacterias Gram positivas como Clostridium spp. (Clostridium
perfringens tolera alimentos con Eh ligeramente positivos), Bifidobacterium spp., y

58
Desulfotomaculum nigrificans. Aunque en este grupo hay bacterias Gram negativas, no tienen
mayor importancia en microbiología de alimentos.

- Microaerófilos: Crecen mejor bajo condiciones ligeramente reducidas (85% de N2, 10% de CO2 y
5% de O2) o bajo un intervalo reducido de Eh. Lactobacillus spp., Campylobacter jejuni y
Helicobacter pylori son un claro ejemplo de éstas.

Temperatura

Los microorganismos pueden crecer en un amplio rango de temperaturas. No obstante, cada especie
requiere un estrecho margen de temperaturas que está determinado por la sensibilidad al calor de sus
sistemas enzimáticos. Aí se puede hablar de:

Temperatura mínima de crecimiento: La más baja temperatura a la cual un microorganismo puede

crecer. Por debajo de esta temperatura la actividad enzimática se inhibe y las células son
metabólicamente inactivas (inhibidas).

Temperatura máxima de crecimiento: La temperatura más alta a la cual existe crecimiento. Por
encima de ella la mayoría de las enzimas se destruyen y el microorganismo muere.

Temperatura óptima de crecimiento: La temperatura a la cual la velocidad de crecimiento es mayor.

Sin embargo no es necesariamente la óptima o ideal para otras actividades enzimáticas de la célula.

Atendiendo a los diferentes requerimientos de temperaturas los microorganismos se pueden

clasificar en 4 grupos:

Microorganismos psicrófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 15ºC o
más baja, comprendiendo su rango entre < 0ºC y 20ºC. Son los microorganismos dominantes en los
alimentos refrigerados: carnes, pescados, leche, verduras. Comprenden numerosos géneros,
destacando entre ellos Pseudomonas sp., Vibrio sp., Erwinia sp., Flavobacterium sp.,
Carnobacterium sp., Brochothrix sp., Lactobacillus sp. y Enterococcus sp.

Microorganismos psicrótrofos o psicrófilos facultativos: Aquellos que teniendo una temperatura

óptima de 20-30ºC y una temperatura máxima de 35ºC, pueden crecer a 0ºC. Varios
microorganismos patógenos muy interesantes se incluyen en este grupo dada su capacidad para
multiplicarse a temperaturas de refrigeración normales (4-7ºC). Ejemplos: Listeria monocytogenes,
Yersinia enterocolitica, Clostridium botulinum tipo E, Aeromonas hydrophila, Vibrio
parahaemolyticus, algunas cepas de B. cereus. Así mismo, la mayoría de las levaduras y de los
mohos se comportan como psicrótrofos.

59
Microorganismos mesófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 20-45ºC, con un rango
comprendido entre 15ºC y 48ºC. A este grupo pertenecen la mayoría de las especies patógenas para
el hombre y los animales (como es lógico pensar), y otras muchas que alteran los alimentos
almacenados a temperatura ambiente o alimentos refrigerados cuando se ha roto la cadena del frío.
Incluye a la mayoría de las especies de la Fª Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella spp.,
Proteus spp., etc), de los género Bacillus, Clostridium y Staphylococcus (Staphylococcus aureus).

Microorganismos termófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 50-60ºC, con un rango
de crecimiento entre 40 y 75ºC. Por ejemplo: Geobacillus stearothermophilus y
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum. Estos microorganismos ocasionan problemas en
las conservas tropicales, puesto que en estas zonas se alcanzan temperaturas que pueden permitir su
crecimiento. En la industria conservera es una de las razones que determinan u obligan al
enfriamiento rápido de las conservas una vez han salido del autoclave o del proceso de
esterilización.

Microorganisnos hipertermófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 80ºC, pero no
crecen por debajo de 65ºC ni por encima de 110ºC. Por ejemplo: Sulfolobus sp. y Thermus sp.

Todos los factores anteriormente señalados pueden ser manejados y constituyen la base de algunos
sistemas de conservación de alimentos. Así por ejemplo, los alimentos fermentados se caracterizan
por presentar un pH bajo o una acidez elevada; los alimentos salados, confitados y deshidratados se
distinguen por su aw reducida y; los alimentos empacados en atmósferas modificadas o al vacío se
diferencian por presentan un Eh negativo (baja tensión de oxígeno). Por su parte los alimentos
refrigerados y congelados se caracterizan por estar sometidos a condiciones donde el crecimiento
microbiano está controlado por efecto de las temperaturas bajas y/o por la baja disponibilidad de
agua producto de la congelación.

ACTIVIDAD

- Efecto de la temperatura de incubación sobre el crecimiento de Pseudomonas fluorescens,

Listeria monocytogenes, Escherichia coli y Geobacillus stearothermophilus.

1. Cada grupo recibirá 4 tubos con cultivos frescos de Pseudomonas fluorescens, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli y Geobacillus stearothermophilus, más 5 placas con Agar
Tripticasa.

2. Con un lápiz marcador divida el fondo de las placas en 4 sectores y en cada uno de ellos coloque
el nombre de las especies bacterianas que se estudiarán.

60
3. En cada uno de los sectores rotulados, siembre con asa curva y mediante el método de
agotamiento por estrías, una alícuota de los respectivos cultivos.

4. Incube las placas a 6, 25, 30, 35 y 55ºC.

5. Tras un periodo de incubación de 5-7 días, observe y anote las variaciones que se producen en el
crecimiento de los cultivos, según la temperatura de incubación. Anote la cantidad de
crecimiento mediante los siguientes signos:

0 = Ningún crecimiento.
+ = Poco crecimiento.
++ = Crecimiento moderado.
+++ = Crecimiento muy bueno.

- Efecto de la actividad de agua sobre el crecimiento de Staphylococus aureus, Listeria

monocytogenes, Escherichia coli y Pseudomonass fluorescens.

1. Cada grupo recibirá 4 tubos con cultivos frescos de Pseudomonas fluorescens, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, más 4 placas con Agar Tripticasa
suplementado con NaCl al 1, 5, 10 y 15% (p/v).

2. Con un lápiz marcador divida el fondo las placas en 4 sectores y en cada uno de ellos coloque el
nombre de las especies que se estudiarán.

3. En cada uno de los sectores rotulados, siembre con asa curva y mediante el método de
agotamiento, por estrías una alícuota de los respectivos cultivos.

4. Incube las placas 30ºC durante 5-7 días.

5. Tras el periodo de incubación observe y anote las variaciones que se producen en el crecimiento
de los cultivos, según la concentración de NaCl presente en el medio. Anote la cantidad de
crecimiento mediante los siguientes signos:

0 = Ningún crecimiento.
+ = Poco crecimiento.
++ = Crecimiento moderado.
+++ = Crecimiento muy bueno.

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 PRÁCTICA Nº 8
CARACTERIZACIÓN DE HONGOS: MOHOS Y LEVADURAS
________________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

Los hongos son organismos eucariotas, no fotosintéticos, que presentan paredes celulares
compuestas principalmente de quitina. Son heterótrofos, es decir obtienen sus nutrientes a partir de
compuestos orgánicos complejos que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son
absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser
unicelulares (levaduras) o pluricelulares “filamentosos” (mohos).

Gemación Las levaduras son células comúnmente de forma esférica u

oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza;
frecuentemente se encuentran formando parte de la flora
epífita de frutos y hojas. Las levaduras se reproducen
asexualmente por gemación, un proceso por el cual brota una
protuberancia o yema (blastospora) de la célula madre que
posteriormente se separa como célula individual. Algunas se
reproducen sexualmente por medio es esporas producidas en
el interior de ascos (ascosporas).

El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos

filamentos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido
de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos
hongos (hongos superiores) presentan tabiques transversales o
septos, aunque en el caso del filo Zigomicota las hifas no
presentan estos tabiques y se les conoce como hifas cenocíticas.
Esta característica permite clasificarlos como hongos inferiores.

El principal mecanismo de reproducción de los hongos es

asexual (hongos imperfectos o falsos), por fragmentación de
hifas vegetativas o por la producción de abundantes esporas en
conidióforos (conidiosporas) o esporangióforos
(esporangiosporas) formados en hifas aéreas llamadas hifas
reproductivas.

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 Esporangiosporas
Conidiosporas
Esporangio
Células conidiogénicas

Esporangióforo
Conidióforo

Sin embargo, la descripción de las estructuras de reproducción sexual (esporas y órganos

reproductivos) es el principal criterio para su clasificación, y por el que pueden ser ubicados en tres
subdivisiones o filos: Zygomycota (producen zigosporas en un zigoto), Ascomycota (producen
ascosporas en el interior de ascos) y Basidiomycota (producen basidiosporas en basidios). Todos los
hongos que se reproducen producen esporas de origen meiótico (sexuado) se clasifican como hongos
perfectos o verdaderos.

Zygotos con Zygosporas Ascos con Ascosporas Basidisoporas en Basidios

La mayoría de los hongos son saprófitos y juegan un papel importante en la naturaleza,

principalmente en la degradación de la materia orgánica muerta. No obstante, varios son parásitos
(patógenos para plantas, el hombre y otros organismos. Otros se utilizan como alimentos y en
procesos industriales. Así por ejemplo, las setas como Agaricus bisporus (champiñón), Lactarius
deliciosus y Cyttaria espinosae (digüeñes) se utilizan como alimento; la levadura Saccharomyces
cerevisiae para producir vino, cerveza y pan; y los mohos como Penicillium roquefortii y P.
camenbertii para elaborar (maduración) quesos.

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Los mohos y levaduras pueden estar presentes en cualquier substrato que les aporte los nutrientes
necesarios para su supervivencia o desarrollo. A diferencia de las bacterias, poseen una gran
habilidad para desarrollarse en substratos ricos en azúcares, con una reducida actividad de agua y un
pH bajo. Por esta razón, los mohos son los principales alterantes de frutas frescas y deshidratadas,
granos y productos farináceos. Las levaduras por su parte, son responsables de la alteración de salsas
para ensaladas, mayonesa, zumos de frutas y productos azucarados (mermeladas, miel, melazas,
etc).

La principal fuente de contaminación por hongos en la industria de alimentos son el aire, el suelo y
el agua. Las materias primas también son una importante fuente de contaminación, especialmente
aquellas de origen vegetal.
En la industria alimentaria, el estudio de los hongos está especialmente enfocado hacia los
responsables del deterioro de los alimentos y de aquellos productores de micotoxinas.

Entre los principales géneros de levaduras que contienen especies alterantes están: Brettanomyces,
Pichia, Saccharomyces, Hansenula, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces,
Torulopsis, Candida, Debaryomyces y Rhodotorula. Mientras que las principales especies de mohos
alterantes y/o micotoxigénicos pertenecen a los géneros: Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Alternaria, Cladosporium, Geotrichum, Byssochlamys, Mucor y Rhizopus (los géneros subrayados
contienen especies micortoxigénicas).

CULTIVO DE HONGOS

Para el cultivo de mohos y levaduras se utilizan medios de cultivos que se caracterizan por contener
una alta concentración de azúcares y un pH ácido. Entre los medios frecuentemente utilizados están
el Agar Papa-Glucosa, Agar Extrato de Levadura, Agar Extracto de Malta y Agar DRBC (Dicloran-
Rojo de Bangala-Cloranfenicol). La selectividad de estos medios puede ser mejorada añadiendo un
antibiótico de amplio espectro (por ejempleo, Cloranfenicol o Oxitetraciclina) o bien adicionando
ácidos orgánicos para reducir su pH (≤4.5). La temperatura óptima para el cultivo levaduras y
mohos fluctúa entre 22 y 25ºC., obteniéndose colonias bien desarrolladas entre el 3er y 5to día de
incubación.

IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

La identificación de levaduras se basa en la determinación de las características morfológicas de las

colonias y células, así como de la capacidad para utilizar diferentes fuentes de hidratos de carbono y
compuestos nitrogenados (auxonograma). También se debe estudiar su habilidad para fermentar
ciertos azúcares (zimograma).

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La identificación de mohos es más difícil y tediosa, pues se basa principalmente en el estudio de las
características morfológicas de las colonias (macro- y microscópicas) así como de los detalles de sus
estructuras reproductivas (órganos reproductores y esporas). Para ésto se requiere de una gran
experiencia y del uso de claves generales de identificación que permiten llegar hasta el nivel de
género. Si se desea identificarlos hasta el nivel de especie se deben utilizar claves específicas para
cada género.

El objetivo de esta sesión práctica es que los alumnos aprendan las técnicas de manipulación de
diferentes tipos de hongos. Así mismo, que conozcan las principales características morfológicas
(macro- y microscópicas) de los principales géneros de hongos encontrados en los alimentos.

ACTIVIDADES:

Descripción Macroscópica y Microscópica de Levaduras

Cada grupo recibirá tres placas de Agar Extracto de Malta sembradas con Saccharomyces
cerevisiae, Debaryomyces hansenii y Rhodotorula sp.:

- A simple vista describa la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de cada una de
las levaduras.
- Preparé un frotis fresco de cada una de las levaduras y obsérvelas en el microscopio de contraste
de fases a 400 y 100 aumentos. Detalle las características morfológicas de la célula.

Descripción Macroscópica y Microscópica de Mohos

Cada grupo recibirá un set de placas con Agar Extracto de Malta sembradas con Aspergillus niger,
Penicillium sp., Alternaria sp, Cladosporium sp., Fusarium spp. Mucor sp. y Rhizopus sp.

- A simple vista describa la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, etc.), color del micelio, producción de exudados y
cambios de color en el medio.
- Prepare un frotis fresco de cada una de las colonias de mohos:

o Sobre un portaobjetos limpio coloque una gota de Azul de Lactofenol (colorante).

o Con una aguja de disección, previamente esterilizada en la llama del mechero y
enfriada, corte con cuidado un trozo de la colonia (incluyendo una zona periférica y
media de la misma) y deposítelo sobre la gota de colorante. Por ningún motivo raspe

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 o agite la colonia, pues no podrá observar las complejas y delicadas estructuras,
creando así una distorsión o error en el diagnóstico.
o Cubra la preparación con una lámina cubreobjetos y obsérvala en el microscopio de
contraste fases con los objetivos de 10X y 40X.
o Ubique y describa las estructuras reproductivas (conidióforos, conidios,
esporangióforos, esperonagios, zigosporas, etc). Determine además si las hifas son
tabicadas (hongos superiores) o cenocíticas (hongos inferiores).
o Determine el género, comparando las observaciones con los esquemas de las claves
auxiliares de identificación o con los esquemas y/o figuras que se muestran a
continuación.
MOHOS

Penicillium sp.
.

Aspergillus sp.

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Fusarium sp.

Rhizopus sp.

Mucor sp.

67
 Alternaria sp.

Cladosporium sp.

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 LEVADURAS

Saccharomyces sp.

Debaryomyces hansenii

Rhodotorula sp.

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