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El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar
las siguientes características:
Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.
Contener distintos puntos de ataque aenzimas de restricción y que sean conocidos.
Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.
Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.
Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células
clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser la resistencia a un antibiótico.
Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o
simplemente, inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago , cromosomas
creados de forma artificial y quimeras.
En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa.
Así se realiza el sellado de la llamada Mella, Muesca o Nick.
Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por
ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona.
Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de
replicación, un bajo coste de mantenimiento de las colonias y son fácilmente
manipulables.
Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de
mantener se usan levaduras y células tumorales:
o Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la
expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas.
o Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad
de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse
cambios, pues son muy estables.
Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes
fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración
de grandes moléculas.
Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN
recombinante y, por ello, la clonación. Primero se efectúa una siembra en placas Petri con agar
como medio de cultivo. Se dejan crecer las colonias. Cada una de ellas será seleccionada y
transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el número de individuos de
la colonia.
6. Detección y selección de los clones recombinantes
En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se hace
necesario separar las células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.
Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN
recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe a partir de él.
Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante
mediante anticuerpos específicos.
Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser:
o Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona
que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no produce enzima lactasa,
es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese
gen.
o Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el
antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que sea resistente a él, por tanto, que
porte el ADN.
o Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes
que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminoácido. Para que la colonia
sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando un
vector que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido, haciendo
crecer las colonias celulares en medios carentes de él sólo crecerán las
bacterias que lleven el ADN inserto.