Las relaciones genéticas entre mexicanos

especies de Pleurotus analizando el ITS-

región de rDNA *

G. Huerta1

, D. Martínez-Carrera2

, J. E. Sánchez1

, H. Leal-Lara3

y R. Vilgalys4

1 El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Unidad Tapachula, km 2.5 carretera antigua

aeropuerto, Tapachula,

Chiapas 30700, México. E-mail: ghuerta@ecosur.mx 2 Colegio de Postgraduados en Ciencias

Agropecuarias (COLPOS), Campus Puebla, Biotecnología de hongos,

Apartado Postal 701, Puebla 72001, Puebla, México. E-mail: dcarrera@colpos.mx 3

Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Facultad de Química, Ciudad
Universitaria, México, D.F. 4 Duke University, Department of Biology, Durham, N.C. 27858, EE.
UU.

Aceptado para su publicación el 31 de diciembre de 2009

ABSTRACTO

México es considerado un país con una gran biodiversidad, pero los recursos genéticos de los
comestibles

los hongos aún no se han estudiado bien. Veinticinco cepas de hongos ostra (Pleurotus)

aislados de regiones tropicales, subtropicales y templadas. Las cepas fueron identificadas

secuenciación de la región ITS1-5.8S-ITS2 del rDNA. Seis especies fueron determinadas

utilizando análisis de unión de vecinos y máxima parsimonia con altos niveles de apoyo:

P. "agaves", P. djamor, P. levis, P. ostreatus, P. pulmonarius y P. smithii. Más colección

ciones y análisis genéticos son necesarios para P. "agaves" y P. smithii. La mayoría de las
secuencias de

Las cepas mexicanas se separaron claramente en los árboles de consenso de las cepas de
referencia de

Origen europeo y norteamericano La excepción fue la secuencia ECS-0156 de P.

pulmonarius, que se agrupó con los de cepas de referencia de América del Norte

y origen europeo, abriendo la posibilidad de que las cepas cultivadas comercialmente

se han escapado de la cultivación. Las especies identificadas representan una amplia base
genética para la raza
programas de investigación, y buen potencial para el cultivo comercial.

Palabras clave: Pleurotus, región ITS de ADNr, relaciones filogenéticas, México.

* Parte de la tesis doctoral de G. Huerta, supervisada por D. Martínez-Carrera.

INTRODUCCIÓN

Los hongos ostra (Pleurotus) son

comercializado en todo el mundo, y mostrar

gran potencial en términos de su funcionalidad

propiedades y diversos biotecnológicos

aplicaciones3

. Al menos quince especies de

Pleurotus representando grupos interstéricos

han sido reconocidos29, y estudios regionales

se han vuelto importantes11,27, como geo-

las barreras gráficas están asociadas con patologías

términos de especiación.

En México, muchos indígenas y campesinos

las comunidades tradicionalmente se han reunido

y consumió especies silvestres de Pleurotus,

y la producción comercial de oys-

ter setas en este país comenzaron en

197413. La producción anual estimada de

Pleurotus ha aumentado significativamente durante

en las últimas dos décadas, de 356 toneladas en

1991 a 2.920 toneladas en 200914. Sin embargo,

estudios taxonómicos en el género Pleurotus

son bastante escasos, a pesar de su carácter social,

importancia nómica y ecológica. La mayoría de los

el trabajo de búsqueda se ha centrado en la morfología

lógico y a veces no morfológico

personajes que llevan a una identificación discutible

cationes4,5,6,7,8. Bioquímico y molecular

Las herramientas lar también se han utilizado recientemente para

identificar y caracterizar la genética mexicana

recursos de hongos comestibles, incluidos

Pleurotus [P. cystidiosus O. K. Mill., P.

djamor (Rumph. ex Fr.) Boedijn, P. levis

(Berk. & M. A. Curtis) Cantante, P. ostrea-

tus (Jacq.) P. Kumm., P. pulmonarius (Fr.)

Quél., P. sp.] Y otros géneros, como

Agaricus, Lentinula y Ganoderma16,22.

En este estudio, recolectamos u obtuvimos

cepas de Pleurotus de tropicales, subtropicales

regiones cálidas y templadas de México. los

región espaciadora transcrita interna (ITS1-

5.8S-ITS2) fue secuenciado para identificar

todas las tensiones y evaluar sus relaciones genéticas

relaciones por vecinos-unión y maxi

maxi-

análisis de parsimonia materna Correspondiente

grupos de interstilidad fueron determinados y

publicado por los autores en otro lugar9

MATERIALES Y MÉTODOS

Son. Un total de 25 cepas de Pleurotus

fueron estudiados, y su código y origen

se muestran en la Tabla 1. Diez Estados del

partes norte, central y sur de

México estuvo representado, a saber: Chiapas

(5), Hidalgo (1), Jalisco (2), Morelos (4),

Nuevo León (2), Puebla (2), Tabasco (1),

Tlaxcala (1), Veracruz (5) y Yucatán

(2) Las cepas se depositan en el ECOSUR

colección de cultura, así como el Centro de

Recursos genéticos de setas comestibles

en COLPOS22. Fueron almacenados y sub-

cultivado en almidón soluble en fosfato de levadura

(YPSS / 2) 28 y medios de extracto de agar de malta

(MEA, Bioxon). Las autoridades de las especies están en

acuerdo con el Index Fungorum (www.in-

dexfungorum.org).

Extracción de ADN, amplificación y

secuenciación El micelio de las cepas

estudiado se cultivó en YPSS / 2 agar me-

dium, pH 5.5, durante diez días a 26 C en

la oscuridad. El micelio aéreo fue

investido con una espátula estéril, colocado en

Tubos Eppendorf (2 ml), deshidratados us-

ing un concentrador Speed-Vac (Savant

Instruments, Farmingdale, U.S.A.), y

congelado a -20 C. minipreparaciones de ADN

se realizaron con la extracción CTAB

buffer de acuerdo con Zolan y Pukkila32.

Amplificaciones de PCR del ITS1-5.8S-

La región ITS2 se llevó a cabo utilizando

ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)

y ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC),

como se describió anteriormente por White et al.30.

De acuerdo con Vilgalys y Sun28, cada am-

reacción de plificación (17 ml) contenida: 2.5

μl tampón 10x (MgCl2 10 mM)

); 3.75 μl de ster
agua destilada; 2,5 μl de suero bovino

albúmina; 4 μl de mezcla dNTP (2 mM cada uno); 1 μl

de cada cebador (1 μM); 2 μl de ADN plantilla

(10 ng / ml); y 0.25 μl de polimerasa Taq

solución (5 U / μl). Las muestras fueron superpuestas

con aceite mineral La temperatura en bicicleta

protocolo consistió en una desnaturalización inicial

ciclo de producción a 94 ° C durante 3 min, seguido de

35 ciclos de 94ºC, 1 minuto; 50 C, 30 s; 72

C, 1 min. Los productos de amplificación fueron ana-

purificado por electroforesis en agarosa al 0,8%

geles, y purificado usando columnas de Sephadex.

La secuenciación del ADN se llevó a cabo en un ABI

373 secuenciador automatizado (Perkin-Elmer,

U.S.A.) con secuenciación del terminador de tinte

químicas, utilizando un ciclo inicial (96 C,

2 min), seguido de 25 ciclos (96 C, 30 s;

50 C, 15 s; 60 C, 4 min). La reacción para

secuenciación de productos de amplificación fue tan

sigue: 4.0 μl de Big Dye Kit que contiene

ampliTaq ADN polimerasa, 20 μl de primers

er (ITS1 o ITS4) y 4.0 μl de productos de PCR

uct, superpuestos con aceite mineral. Cada

la muestra fue secuenciada en ambas direcciones.

Los cromatogramas se procesaron usando soft-

ware 2.0 de Genes Codes Corp. (EE. UU.).

Análisis filogenético. Aparte del ADN

secuencias de cepas mexicanas estudiadas, otras

Se incluyeron 22 secuencias como referencias

(Tabla 2), que fueron principalmente pro-

revisado por el Laboratorio de Micología, Duke

University, N.C., U.S.A. Se se-

las secuencias eran de las siguientes especies:

P. "agaves" (2) sensu Vilgalys et al.29, P. calyptratus (Lindblad) Sacc. (1), P. cor-

nucopiae (Paulet) Rolland (2), P. cystidi-

osus (1), P. djamor (5), P. dryinus (Pers.)

P. Kumm. (1), P. eryngii (DC.) Quél.

(2), P. ostreatus (2), P. pulmonarius (3),

P. levis (1), P. smithii Guzmán (1), y

Hohenbuehelia (1) como grupo externo. Todas

las secuencias se alinearon usando Clustal_X,

siguiendo la alineación múltiple estándar, como

bien como ajuste visual. Longitud de secuencia

se hizo uniforme, y las regiones muestran

se excluyeron las alineaciones ambiguas.

Las secuencias se procesaron usando PAUP,

versión 4.0b 10x25, considerando vacíos

giones derivadas de alineaciones como

estados de carácter tional. Si la región vacía

fue> 1, fue recodificado como una inserción única /

eliminación y considerado como un personaje

estado. Las inferencias filogenéticas se basaron

en la distancia genética entre secuencias

de acuerdo con Tamura y Nei26. Máximo

los árboles de parsimonia se identificaron utilizando

opción de búsqueda heurística, y la bisectriz del árbol

algoritmo de conexión y reconexión (TBR) 25.

Se apoyó a las agrupaciones filogenéticas

evaluado por análisis bootstrap (1,000 rep-

licates) con adición aleatoria de secuencias

durante cada búsqueda heurística.

RESULTADOS
Las secuencias estudiadas tenían alrededor de 790 caracteres

ters, de los cuales se usaron 667 caracteres

para un análisis posterior después de la alineación y

guarnición. Hubo 311 parsimonia en

sitios formativos, 171 sitios constantes y 185

sitios no informativos. La distancia genética

matriz derivada de la unión de vecinos

análisis generó un árbol de consenso de

los mejores 1.104 árboles, mostrando lo siguiente

puntajes: longitud del árbol (TL) = 1.128 pasos,

índice de consistencia (IC) = 0.69, homoplasia en

dex (HI) = 0.31, índice de retención (RI) = 0.87,

y índice de consistencia reescalado (RC) = 0.60

(Figura 1). Este análisis filogenético mostró

los siguientes grupos de Pleurotus: un ma-

jor clado que contiene P. ostreatus (Jacq.) P.

Kumm., P. pulmonarius (Fr.) Quél., Y

P. eryngii (DC.) Quél .; y otro importante

clado que contiene P. djamor (Rumph.

Fr.) Boedijn, P. "agaves" sensu Vilgalys et

al.29 y P. calyptratus (Lindblad) Sacc. Eso

es posible que las diferentes especies dentro de la

mismo clado se agrupan porque

Han evolucionado recientemente. Había

clados independientes para P. dryinus (Pers.)

P. Kumm., P. levis (Berk. Y M. A. Curtis)

Cantante, P. cornucopiae (Paulet) Rolland,

y para el grupo de especialistas en formación de

cies P. smithii Guzmán y P. cystidiosus

O. K. Mill. En el último caso, secuencias

D478 (Estado de México) y CP-18 (Estado

de Veracruz), ambos de México, formados

el grupo monofilético de P. smithii se cierra

a P. cystidiosus de origen norteamericano,

que fue compatible con los valores de arranque de

100% y 99%, respectivamente. P. smithii y

P. cystidiosus compartió la posición de más

más de la mitad de los personajes estudiados (56%).

El clado de P. levis fue apoyado por un

valor de arranque del 98% y sus secuencias

D2269 y CP-30 también compartieron el puesto

de más de la mitad de los personajes estudiados

(58%). Todas las especies identificadas en los clados

de cepas mexicanas conformadas

grupos de movilidad29 con morfología específica

cal caracteres y yields9

Secuencias de ADN pertenecientes a P. djamor

formó un grupo monofilético (bootstrap

valor = 98%), cuyas relaciones entre

los subgrupos no están resueltos. Una posible explicación

nación puede ser la presencia de vicarianza

patrones (Fig. 1), en los que dos subpoblaciones

Se identifican las condiciones: 1) Secuencias de cepas

de los Estados de Tabasco (D1847, D2324)

y Yucatán (CP-171); y 2) Secuencias de

cepas de los Estados de Jalisco (ECS-0174, ECS-01130) y Veracruz (ECS-0176). Todas

secuencias de P. djamor compartieron la posición

de la mayoría de los personajes estudiados (60-63%).

Secuencias de cepas CP-98, CP-194,

y ECS-0165 integraron otro mono-

grupo phyletic (valor de arranque = 99%),

junto con las secuencias de referencia D2320

y D2321 identificado como P. "agaves" por

Vilgalys et al.29. Todas las secuencias de P. "aga-

ves "compartió la posición de la mayoría de los personajes

estudiado (66-68%).

Secuencias que pertenecen al subclade de

P. pulmonarius (ECS-0191, ECS-0158,

ECS-0183, ECS-0110, ECS-0170, ECS-

0156) agrupados con las cepas de referencia

(D700, D2347, D2349) en un monophylet-

grupo ic (valor de arranque = 72%). A sub-

secuencias de agrupación de población de cinco

Cepas mexicanas con alto nivel de apoyo

(valor bootstrap = 87%) también sugirió la

presencia de patrones de vicarianza.

El grupo monofilético que contiene P.

ostreatus incluyó la secuencia ECS-0184

(Estado de Nuevo León, México) y aquellos

de las cepas de referencia (D261, D403, ECS-

1102), que están separados del subgrupo

de P. eryngii (valor bootstrap = 96%;

cepas ence: D625, D1822). Todas las secuencias

del grupo monofilético compartió la po-

sición de la mayoría de los personajes estudiados (72-73%).

El análisis de parsimonia máximo de todos

Las secuencias de ITS generaron 1.089 árboles. los

consenso más parsimonioso árbol con-

afirmó los resultados de la unión de vecinos

análisis en todos los casos, aunque los niveles de

el puerto difiere ligeramente. El árbol de consenso

mostró los siguientes puntajes: IC = 0.69,

HI = 0,31, RI = 0,87 y RC = 0,60 (figura 2).

DISCUSIÓN

Unir vecinos y parsi máximo

análisis de ADN de secuencias de ADN de 25

Las cepas de Pleurotus estudiadas permitieron identificar

ficación de seis especies diferentes como parte del

diversidad genética de los hongos ostra en

México: P. "agaves" (sensu Vilgalys et al.29),

P. djamor, P. levis, P. ostreatus, P. pulmo-

narius y P. smithii. Esto está de acuerdo

con especies y grupos de interstilidad, que

han sido previamente reconocidos dentro del

género sobre la base de caracteres morfológicos

acters, estudios de compatibilidad de apareamiento y

análisis filogenéticos moleculares18,21,28,29,31.

La mayoría de las secuencias de cepas mexicanas fueron

claramente separados en los árboles consenso de

cepas de referencia de Europa y del Norte

Origen americano La excepción fue el

quence ECS-0156, que se ha agrupado con

los de las cepas de referencia, la apertura

la posibilidad de que las cepas cultivadas com

mercially puede haber escapado de

cultivo o se han depositado en

colecciones de tures. El estado taxonómico de P.

"Agaves" necesita una nomenclatura completa

análisis que implica información morfológica, genética,

y estudios moleculares. Al menos dos de cerca

especies relacionadas se pueden considerar dentro de este

complejo, P. agaves Dennis y P. opuntiae

(Durieu y Lév.) Sacc.

Ha habido controversia respecto

el estado taxonómico de P. cystidiosus

y P. smithii, como varios autores consideran

ellos como separados24,31 o la misma espe-

cies1,10. Casos similares de compatibilidad parcial

la posibilidad de separar entre especies biológicas

cies han sido reportados dentro del género

Pleurotus20. En este estudio, las secuencias

CP-18 y D478 de cepas mexicanas

formó el grupo monofilético de P. smith-

ii, un subclade independiente menor pero cercano

a P. cystidiosus. Otros estudios moleculares

se necesitan con un número mayor

de cepas de diversas regiones, así como

análisis genético de híbridos y su progreso

eny, para dilucidar las relaciones

entre estas poblaciones.

Linajes principales que comprenden P. djamor,

P. "agaves" sensu Vilgalys et al.29, y P.

calyptratus (grupos interóseos: V, XI), como

así como P. ostreatus, P. pulmonarius, y P.

eryngii (grupos interóseos: I, II, VI), están en

acuerdo con otros análisis filogenéticos

ysis de grupos inter-estériles llevados a cabo por

Vilgalys et al.29 utilizando la codificación nuclear

gen de ARN de subunidad grande (LSU). En el caso

de P. djamor, una especie de fenotipo conocido

plasticidad19, la subclade incluía

las formas blancas y rosadas compatibles pertenecen a

ing a la misma especie biológica9

, cual
anteriormente se había considerado como separado

especie o variedades2,6. Similar fue el caso

para P. pulmonarius, cuyas cepas pueden tener

sido considerado como P. ostreatus sensu lato

en estudios de cultivo y cultivo de hongos

vación hace muchos años12,15,17. Otro caso

fue P. levis, que previamente se identificó

como Lentinus levis sobre la base del mor-

personajes phological23. Considerando el

origen de las cepas estudiadas, es posible que

P. djamor, una especie ampliamente distribuida en

regiones tropicales y subtropicales en México,

se superpone geográficamente con P. ostreatus

y P. pulmonarius en tierras altas templadas.

Sin embargo, esta suposición requiere confirmación

mación derivada de un mayor número de

auténticas variedades autóctonas, como las grandes

cultivo a escala de hongos ostra ha

permitió la introducción incontrolada de

cepas comerciales a México.

Las especies de Pleurotus identificadas en

este estudio es una amplia base genética para los sistemas

programas de mejoramiento temáticos, y representan

buen potencial para el cultivo comercial

ción. Sin embargo, se necesitan más estudios,

particularmente en el norte, sur y

regiones orientales, para tener una

ter evaluación de la diversidad genética de

Especie Pleurotus en México.

EXPRESIONES DE GRATITUD

G. Huerta agradece al Dr. Tim James y al Dr. Ursula

Pintor de colaboración y asesoramiento durante su investigación

estadía en Duke University, EE. UU.

LITERATURA CITADA

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