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PROCEDIMIENTO 1A

Preparación de la muestra
La preparación del Agua peptonada tamponada se realizó de la siguiente manera:
1. Se disolvió 5,2 g de polvo (Agua peptonada tamponada Difco) en agua purificada.
Se tomó en cuenta que el polvo estaba caducado y se aumentó 10 % de polvo, para
aumentar la concentración.
2. Se calentó hasta conseguir una completa disolución
3. Se ajustó a un pH de 7,068. Adecuado en el rango pedido (7,2±0,2)
4. Se etiquetó correctamente para identificación de cada grupo.
5. Se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.
6. Luego se realizó la siembra de pre-enriquecimiento del alimento(hamburguesa):
25 g de alimento en 255 ml de agua peptonada tamponada.
7. Incubación aeróbica de 35 a 37ºC durante casi cuatro días (lo recomendable es
24-48 h).

PROCEDIMIENTO 1B
Se realizó la purificación de AND, donde se siguió los pasos de la guía de prácticas
1. Para un Tubo de microcentrífuga de 1.5 ml libre de nucleasas.
b. Agregar 200μl del material de muestra
c. Agregar 200μl de Lysis Buffer
d. Agregar 200 μl de Buffer de Unión
e. Agregar 40 μl de Proteinasa K
f. Mezclar inmediatamente e incubar a 70ºC por 10 minutos.
2. Agregar 100 μl de Isopropanol (o Etanol absoluto) y mezclar completamente.
3.Para transferir la muestra a un Tubo de Purificación (High PureTube).
a. Insertar un tubo de filtración (High FilterTube) en un Tubo de colecta (incluido
en el kit).
b. Pipetear la muestra completa en la parte superior del depósito del buffer en el
tubo de filtración.
c. Introducir el conjunto del tubo de filtración en una centrífuga de sobremesa
estándar.
4. Centrifugar por un minuto a 8000 x g (9500 rpm en un rotor de 80 mm de diámetro).
5. Después de la centrifugación:
a. Retirar el tubo de filtración del tubo de colecta; desechar el líquido presente y el
tubo de colecta.
6. Para la remoción de Inhibidores
a. ,Agregar 500 μl del Buffer removedor de Inhibidores (Inhibitor Removal
Buffer) sobre el depósito del conjunto del tubo de filtración. Repetir la centrifugación a
8000x g por 1 minuto y desechar el líquido y el tubo de colecta.
b. Reinsertar el tubo de filtración en un nuevo tubo de colecta.
7. Para el lavado de la muestra
a. Agregar 500 μl de Buffer de lavado (Wash Buffer) sobre el depósito del tubo
de filtrado.
b.Repetir la centrifugación (paso 4)
8.Después del primer lavado
a. Repetir el paso 5
b. Repetir el paso de lavado y centrifugado (paso7); desechar el líquido.
c. Haga girar el filtro del tubo de colecta del conjunto durante 10 segundos en
velocidad máxima (approx.13000 x g) para eliminar el tampón de lavado residual.
9. Desechar el tubo de colecta e insertar el Tubo de filtración en un tubo de micro
centrífuga de 1,5 ml limpio y estéril.
10. Para la elución del ácido nucleico:
a.Agregar 200 μl de Buffer de elución precalentado (70ºC) al tubo de filtrado.
b.Centrifugar el conjunto por 1 minuto a 8000 x g
11. El tubo de micro centrífuga ahora contiene el ácido nucleico eluido.
a.Utilizar una alícuota de esta para su proceso a PCR
b.Almacenamiento de ácidos nucleicos a 20ºC para análisis posteriores.

Gráficos de el procedimiento